Родился 16 (28) февраля 1813 года в семье дворянина Нижегородской губернии, генерал-майора Семёна Алексеевича Глухова (?—1816) — директора Шосткинского порохового завода (1815—1816).
В 1832 году окончил Институт Корпуса инженеров путей сообщения в Петербурге[1], где затем более 30 лет преподавал математику, физику, физическую географию и высшую геодезию. Также он преподавал в Корпусе горных инженеров, Горном институте и во Втором кадетском корпусе.
В 1840-х годах он возглавлял Комиссию по устройству в России электромагнитного телеграфа, по его настоянию в России была принята азбука Морзе.
В 1860-х годах работал в Департаменте неокладных сборов, возглавлял экспедицию для поверки ввозимых в Россию спиртометров Траллеса. Был произведён в генерал-майоры 19 апреля 1864 года.
С 1865 по 1892 годы был бессменным учёным хранителем Депо образцовых мер и весов. Разработал программу развития отечественной метрологии и поверочного дела. Инициатор создания в 1869 году правительственной комиссии для преобразования Депо образцовых мер и весов. В. С. Глухов определил функции Депо как государственного поверочного органа, в ведении которого должны находиться все измерительные приборы, используемые для поверки мер и весов. Проект закона о мерах и весах предусматривал применение в качестве основной единицы длины — аршина, вместо сажени, а также более точное определение основной единицы массы — фунта. Предполагалось возобновление прототипов (эталонов) длины и массы и факультативное применение в России метрической системы мер наряду с русской системой.
Он произвёл сличение различных мер длины и массы, организовал первые в России метрологические работы по термометрии и способствовал усовершенствованию оборудования Депо образцовых мер и весов.