В 1568 году шотландскую королеву Марию Стюарт из-за подозрения в причастности к убийству своего супруга изгоняют из страны, и она бежит в Англию. Она надеется найти себе защиту у английской королевы Елизаветы. Та однако должна беспокоиться о собственной короне, поскольку Мария Стюарт сама претендует на неё. Поэтому королева Елизавета велит арестовать её и заключить под стражу в замке. Действие пьесы происходит спустя 19 лет, за три дня до казни Марии Стюарт.
Со стороны многих молодых людей, ослеплённых красотой Марии Стюарт, предпринимаются многочисленные попытки освободить шотландскую королеву из неволи. Также юный Мортимер хотел бы спасти узницу. Он только для видимости принимает приказ Елизаветы об убийстве Марии Стюарт. Он посвящает в свой план графа Лестер, который сам любит Марию Стюарт и одновременно является также любовником Елизаветы. Оказавшись перед данной дилеммой, граф Лестер берётся за организацию встречи двух королев, во время которой, как он надеется, Мария Стюарт должна разжалобить сердце своей соперницы.
Когда королевы в действительности встречаются, Елизавета пытается ещё сильнее унизить Марию Стюарт, взывающую к ней с мольбами. Она упрекает её в притворстве и обвиняет в том, что она отправила на тот свет всех своих мужей. Гордая Мария Стюарт в свою очередь также обличает Елизавету в ханжестве: Несмотря на своё подчёркнутое добродетельное поведение (в качестве «целомудренной королевы») Елизавета не может завуалировать своё несколько более низкое происхождение. В итоге попытка примирения со стороны графа Лестер отдалила и сделала соперниц ещё более непримиримыми.
После того, как проваливается попытка покушения на жизнь Елизаветы, Мортимер закалывает себя, поскольку не может спасти Марию Стюарт. Чтобы сохранить свои права на трон, английская королева хочет убить Марию Стюарт. Но поскольку Елизавета не желает брать на себя вину за смерть Марии Стюарт и не хочет идти на риск потери своей хорошей репутации, она хотя и подписывает приговор, но передаёт принятие решения о приведении его в исполнение в руки другого. Мария Стюарт всё же оказывается обезглавленной. Елизавета теряет всех своих советников.
Паулет проникает в комнату узницы Марии Стюарт, чтобы конфисковать её ценности и письма, поскольку в них, по его мнению, имеются сведения, которые уличают в существовании заговора против власти исповедующей протестантскую веру королевы Елизаветы. В ответ на протест кормилицы Анны Кеннеди против такого позорного обхождения Паулет подчёркивает опасность шотландской королевы, которая даже из заточения способна «швырнуть факел гражданской войны в жизнь монархии» и потому должна нести ответственность за свои грехи.