Христианство на территории Нишской епархии проповедовали ученики апостолов апостольских, которые уже оставили здесь своих учеников. Ниш с древнейших времён имел епископскую кафедру. На территории епархии родился император Константин I Великий.
Ранняя история епархии известна мало. До 732 года была подвластна Папскому престолу. При переселении славян епархия пресеклась.
С X века епархия входила в состав Охридской архиепископии. После 1219 года епархия переходит в состав Сербской церкви, и впоследствии разделила её судьбу, в 1766 году став частью Константинопольского патриархата в ранге митрополии. Когда в августе 1831 года была воссоздана Сербская автономная церковь в составе Вселенского патриархата, то Нишская митрополия не вошла в её состав, оставаясь в юрисдикции Константинополя[2], а с 11 февраля 1872 года была частью автокефальной Болгарской православной церкви (которая в это время находилась в схизме), но уже 10 октября 1879 года стала частью новопровозглашённой автокефальной Сербской церкви[3].
В 1898 году на источнике рядом со входящем в состав епархии монастыре в Джунисе было явление Богородице местной девочке Милойке Йоцич, которая дала завет построить на этом месте храм. Рассказ о явлении был опубликован только в 1936 году братом девочки. С тех пор камень, на который ступала Богородица, и сам источник считаются чудотворными и стали местами паломничества верующих[4].
В октябре 2013 года в Нише состоялись основные торжества, посвящённые празднованию 1700-летию подписания Миланского эдикта.