Проточная цитометрия (проточная цитофлуориметрия) — метод исследования дисперсных сред в режиме поштучного анализа элементов дисперсной фазы по сигналам светорассеяния и флуоресценции. Название метода связано с основным приложением, а именно, с исследованием одиночных биологических клеток в потоке.
Основа метода заключается в 1) использовании системы гидрофокусировки, которая обеспечивает прохождение клеток в потоке поодиночке; 2) облучении клетки лазерным излучением; 3) регистрации сигналов светорассеяния и флуоресценции от каждой клетки.
Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клетки (аутофлуоресценция) или внесённых в образец перед проведением проточной цитометрии.
Клеточная суспензия, предварительно меченная флюоресцирующими моноклональными антителами или флуоресцентными красителями, попадает в поток жидкости, проходящий через проточную ячейку. Условия подобраны таким образом, что клетки выстраиваются друг за другом за счет т. н. гидродинамического фокусирования струи в струе. Гидродинамическая фокусировка обеспечивается большим удельным расходом во внешней струе (струя-оболочка) по сравнению с удельным расходом пробы. Схематически принцип работы показан на видео. При увеличении удельного расхода во внешней струе, клетки выстраиваются в линию, одна за другой. В момент пересечения клеткой лазерного луча детекторы фиксируют:
Интенсивность рассеяния зависит от морфологии клетки (размер, форма, внутренняя структура), от ориентации клетки в потоке относительно направления падающего излучения, от состояния поляризации падающего излучения.
Интенсивность флуоресценции формируется за счет двух вкладов: специфической флуоресценции и автофлуоресценции. Специфическая флуоресценция связана с излучением молекул флуорохрома, специфически связанных с определенными клеточными компонентами (рецепторы, внутриклеточные белки, ДНК и др.). Автофлуоресценция связана с излучением собственных молекул клетки (белки, нуклеиновые кислоты и т.д.). Интенсивность специфической флуоресценции зависит от количества молекул флуорохрома в клетке, длины волны возбуждающего излучения, сечения поглощения (экстинкции) флуорохрома на этой длине волны, квантового выхода флуорохрома, числовой апертуры оптической системы сбора флуоресценции, спектрального диапазона системы оптической фильтрации и детекции. Интенсивность автофлуоресценции аналогичным образом зависит от оптических свойств собственных молекул клетки. На практике подготовка клеток перед измерением осуществляется таким образом, чтобы вклад специфической флуоресценции на несколько порядков превышал вклад автофлуоресценции.