Открыта 9 сентября 1858 года по решению Священного Синода при правящем епископе Феофиле (Надеждине). Первый ректор — профессор Херсонской семинарии архимандрит Геннадий (Левицкий).
Первоначально Семинария не имела собственного здания, располагаясь в доме купца Лаптева напротив Вознесенского собора.
Благословение Святейшего Правительствующего Синода на строительство здания Семинарии было получено самарским епископом Герасимом (Добросердовым) в 1867 году.
В 1869 году, на праздник святых первоверховных апостолов Петра и Павла, было торжественно освящено место под строительство. Строительство было закончено к августу 1872 года по адресу «Ул. Соборная, д. 157, близ Кафедрального собора».
Семинария имела свою церковь, которая была освящена в 1872 году во имя святого апостола и евангелиста Иоанна Богослова.
В настоящее время в здании дореволюционной Самарской духовной семинарии располагается один из корпусов Самарского технического университета.