Флуоресцентная гибридизация in situ


Флуоресце́нтная гибридиза́ция in situ, или метод FISH (англ. fluorescence in situ hybridization — FISH), — цитогенетический метод, который применяют для детекции и определения положения специфической последовательности ДНК на метафазных хромосомах или в интерфазных ядрах in situ. Кроме того, FISH используют для выявления специфических мРНК в образце ткани. В последнем случае метод FISH позволяет установить пространственно-временные особенности экспрессии генов в клетках и тканях.

Метод FISH используют в преимплантационной, пренатальной и постнатальной генетической диагностике[1], в диагностике онкологических заболеваний[2], в ретроспективной биологической дозиметрии[3].

При флуоресцентной гибридизации in situ используют ДНК-зонды (ДНК-пробы), которые связываются с комплементарными мишенями в образце. В состав ДНК-зондов входят нуклеозиды, меченные флюорофорами (прямое мечение) или такими конъюгатами, как биотин или дигоксигенин (непрямое мечение). При прямом мечении связавшийся с мишенью ДНК-зонд можно наблюдать при помощи флуоресцентного микроскопа сразу по завершении гибридизации. В случае непрямого мечения необходима дополнительная процедура окрашивания, в ходе которой биотин выявляют при помощи флуоресцентно-меченного авидина или стрептавидина, а дигоксигенин — при помощи флюоресцентно-меченых антител. Хотя непрямой вариант мечения ДНК-проб требует дополнительных реактивов и временных затрат, этот способ позволяет добиться обычно более высокого уровня сигнала за счёт присутствия на молекуле антитела или авидина 3—4 молекул флюорохрома. Кроме того, в случае непрямого мечения возможно каскадное усиление сигнала[4].

Для создания ДНК-зондов используют клонированные последовательности ДНК (например, NoiI-связующие клоны 3-й хромосомы человека, БАК[en]-клоны)[5][6], геномную ДНК, продукты ПЦР, меченые олигонуклеотиды, а также ДНК, полученную при помощи микродиссекции[4].

Мечение зонда может осуществляться разными способами, например, путём ник-трансляции или при помощи ПЦР с мечеными нуклеотидами.

На первом этапе происходит конструирование зондов. Размер зонда должен быть достаточно большим для того, чтобы гибридизация происходила по специфическому сайту, но и не слишком большой (не более 1 тыс. п. о.), чтобы не препятствовать процессу гибридизации. При выявлении специфических локусов или при окраске целых хромосом надо заблокировать гибридизацию ДНК-проб с неуникальными повторяющимися ДНК-последовательностями путём добавления в гибридизационную смесь немеченой ДНК повторов (например, Cot-1 DNA). Если ДНК-зонд представляет собой двуцепочечную ДНК, то перед гибридизацией её необходимо денатурировать.