Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Процедура проверки Эймса

Тест Эймса - это широко используемый метод, в котором бактерии используются для проверки того, может ли данное химическое вещество вызывать мутации в ДНК тестируемого организма. Более формально это биологический анализ для оценки мутагенного потенциала химических соединений. [1] Положительный результат теста указывает на то, что химическое вещество является мутагенным и, следовательно, может действовать как канцероген , поскольку рак часто связан с мутацией.. Тест служит быстрым и удобным анализом для оценки канцерогенного потенциала соединения, поскольку стандартные анализы канцерогенов на мышах и крысах отнимают много времени (на выполнение требуется от двух до трех лет) и дороги. Однако известны ложноположительные и ложноотрицательные результаты. [2]

Процедура была описана в серии статей в начале 1970-х годов Брюсом Эймсом и его группой в Калифорнийском университете в Беркли . [3] [4] [5] [6]

Общая процедура [ править ]

В тесте Эймса используются несколько штаммов бактерии Salmonella typhimurium, которые несут мутации в генах, участвующих в синтезе гистидина . Эти штаммы являются ауксотрофными мутантами, т. Е. Им для роста требуется гистидин, но они не могут его продуцировать. Метод проверяет способность тестируемого вещества создавать мутации, которые приводят к возврату к «прототрофному» состоянию, так что клетки могут расти на среде без гистидина.

Штаммы- тестеры специально сконструированы для обнаружения либо сдвига рамки считывания (например, штаммы TA-1537 и TA-1538), либо точечных (например, штамм TA-1531) мутаций в генах, необходимых для синтеза гистидина, чтобы можно было идентифицировать мутагены, действующие посредством различных механизмов. Некоторые соединения весьма специфичны, вызывая реверсию всего у одного или двух штаммов. [4] Тестируемые штаммы также несут мутации в генах, ответственных за синтез липополисахаридов , что делает клеточную стенку бактерий более проницаемой, [5] и в системе эксцизионной репарации, чтобы сделать тест более чувствительным. [6]

У более крупных организмов, таких как млекопитающие, есть метаболические процессы, которые потенциально могут превратить химическое вещество, считающееся не мутагенным, в то, что является мутагенным, или то, которое считается мутагенным, в другое. [7] Таким образом, для более эффективного тестирования мутагенности химического соединения по отношению к более крупным организмам можно добавить ферменты печени крысы, чтобы попытаться воспроизвести влияние метаболических процессов на соединение, тестируемое в тесте Эймса. Экстракт печени крысы необязательно добавляют для имитации эффекта метаболизма , поскольку некоторые соединения, такие как бензо [ а ] пирен , сами по себе не являются мутагенными, но их продукты метаболизма обладают. [3]

Бактерии распределяются на чашке с агаром с небольшим количеством гистидина. Это небольшое количество гистидина в питательной среде позволяет бактериям расти в течение начального времени и иметь возможность мутировать. Когда гистидин истощается, выживут только бактерии, которые мутировали, чтобы получить способность производить собственный гистидин. Планшет инкубируют 48 часов. Мутагенность вещества пропорциональна количеству наблюдаемых колоний.

Тест Эймса и канцерогены [ править ]

Мутагены, идентифицированные с помощью теста Эймса, также являются возможными канцерогенами, и ранние исследования Эймса показали, что с помощью этого теста можно идентифицировать 90% известных канцерогенов. [8] Однако более поздние исследования показали идентификацию 50–70% известных канцерогенов. [ необходима цитата ] Тест был использован для идентификации ряда соединений, ранее использовавшихся в коммерческих продуктах, как потенциальных канцерогенов. [9] Примеры включают трис (2,3-дибромпропил) фосфат , который использовался в качестве антипирена в пластике и текстиле, таком как детская одежда для сна , [10] и фурилфурамид.который использовался в качестве антибактериальной добавки к пище в Японии в 1960-х и 1970-х годах. Фактически, фурилфурамид ранее проходил тесты на животных, но более тщательные тесты после его идентификации в тесте Эймса показали, что он канцерогенный. [11] Их положительные тесты привели к тому, что эти химические вещества были изъяты из использования в потребительских товарах.

Один интересный результат теста Эймса состоит в том, что кривая доза-ответ с использованием различных концентраций химического вещества почти всегда линейна [8], что указывает на отсутствие пороговой концентрации для мутагенеза. Следовательно, это предполагает, что, как и в случае с радиацией, может не быть безопасного порога для химических мутагенов или канцерогенов. [12] [13] Однако некоторые предположили, что организмы могут переносить низкие уровни мутагенов из-за защитных механизмов, таких как репарация ДНК , и, таким образом, может существовать порог для определенных химических мутагенов. [14] Сам Брюс Эймс возражал против линейной экстраполяции зависимости доза-ответ от высокой дозы, используемой в тестах на канцерогенез в системах животных, на более низкую дозу химических веществ, обычно встречающихся при воздействии на человека, поскольку результаты могут быть ложноположительными из-за митогенной реакции, вызванной искусственно высокой дозой. химикатов, используемых в таких тестах. [15] [16] Он также предостерег от «истерии по поводу крошечных следов химических веществ, которые могут или не могут вызвать рак», что «полностью исключает основные риски, о которых вам следует знать». [17]

Тест Эймса часто используется в качестве одного из начальных скринингов для потенциальных лекарств для отсеивания возможных канцерогенов, и это один из восьми тестов, требуемых в соответствии с Законом о пестицидах (США), и одним из шести тестов, требуемых в соответствии с Законом о контроле за токсичными веществами. (СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ). [18]

Ограничения [ править ]

Salmonella typhimurium - прокариот, поэтому он не является идеальной моделью для человека. Фракция S9 печени крысы используется для имитации метаболических условий у млекопитающих, чтобы можно было оценить мутагенный потенциал метаболитов, образованных родительской молекулой в печеночной системе; однако существуют различия в метаболизме между людьми и крысами, которые могут повлиять на мутагенность исследуемых химических веществ. [19] Таким образом, тест может быть улучшен за счет использования фракции S9 печени человека; его использование ранее ограничивалось его доступностью, но теперь оно доступно на коммерческой основе и, следовательно, может быть более целесообразным. [20] Адаптированная модель in vitro была создана для эукариотических клеток, например дрожжей.

Мутагены, идентифицированные в тесте Эймса, не обязательно должны быть канцерогенными, и требуются дальнейшие тесты на любой потенциальный канцероген, идентифицированный в тесте. Лекарства, содержащие нитратную составляющую, иногда оказываются положительными на Эймса, когда они действительно безопасны. Нитратные соединения могут образовывать оксид азота , важную сигнальную молекулу, которая может дать ложноположительный результат. Нитроглицерин является примером, который дает положительный результат по Эймсу, но все еще используется в лечении сегодня. Однако содержание нитратов в пищевых продуктах может быть восстановлено бактериальным действием до нитритов, которые, как известно, генерируют канцерогены при взаимодействии с аминами и амидами. Чтобы опровергнуть положительный результат теста Эймса, необходимы длительные токсикологические исследования и исследования результатов с такими соединениями.

Метод колебаний [ править ]

Метод флуктуации: 96-луночный планшет
Метод флуктуации: 384-луночный планшет

Первоначально тест Эймса был разработан с использованием чашек с агаром (метод включения чашек), как описано выше. С тех пор была разработана альтернатива выполнению теста Эймса, известная как «метод флуктуации». Этот метод аналогичен по концепции методу на основе агара: бактерии добавляются в реакционную смесь с небольшим количеством гистидина , что позволяет бактериям расти и мутировать, возвращаясь к синтезу собственного гистидина. Включая индикатор pH, частота мутации подсчитывается в микропланшетах.как количество лунок, изменивших цвет (вызванных падением pH из-за метаболических процессов размножающихся бактерий). Как и в случае традиционного теста Эймса, образец сравнивается с естественной фоновой скоростью обратной мутации, чтобы установить генотоксичность вещества. Метод флуктуации полностью выполняется в жидкой культуре и оценивается путем подсчета количества лунок, которые становятся желтыми от пурпурных в 96-луночных или 384-луночных микропланшетах.

В методе 96-луночного планшета частота мутации рассчитывается как количество лунок из 96, которые изменили цвет. Чашки инкубируют до пяти дней, при этом каждый день подсчитывают мутировавшие (желтые) колонии и сравнивают с фоновой скоростью обратной мутации с использованием установленных таблиц значимости для определения значительных различий между фоновой скоростью мутации и таковой для испытуемых. образцы.

В более упрощенном методе микрофлуктуации 384-луночного планшета частота мутации рассчитывается как количество лунок из 48, которые изменили цвет после 2 дней инкубации. Тестируемый образец анализируется на 6 уровнях доз с одновременным нулевым (фоновым) контролем и положительным контролем, которые помещаются в один 384-луночный планшет. Анализ проводится в трех экземплярах для обеспечения статистической надежности. В нем используются тестируемые штаммы, рекомендованные Директивой ОЭСР 471 (ауксотрофы гистидина и ауксотрофы триптофана).

Метод флуктуаций сравним с традиционным методом наливных планшетов с точки зрения чувствительности и точности, однако он имеет ряд преимуществ: для него требуется меньше исследуемого образца, он имеет простую колориметрическую конечную точку, подсчитывая количество положительных лунок из возможных. 96 или 48 лунок занимает гораздо меньше времени, чем подсчет отдельных колоний на чашке с агаром. Доступно несколько коммерческих комплектов. Большинство наборов содержат готовые к использованию расходные материалы, в том числе лиофилизированные бактерии, а тесты можно проводить с помощью многоканальных пипеток. Метод флуктуации также позволяет тестировать большие объемы водных образцов (до 75% об. / Об.), Повышая чувствительность и расширяя его применение для низкоуровневых мутагенов окружающей среды. [21]

Ссылки [ править ]

  1. ^ Mortelmans K, Zeiger E (ноябрь 2000). «Анализ мутагенности Ames Salmonella / микросом». Мутационные исследования . 455 (1–2): 29–60. DOI : 10.1016 / S0027-5107 (00) 00064-6 . PMID  11113466 .
  2. ^ Charnley G (2002). «Тест Эймса» . Энциклопедия общественного здоровья . eNotes.com. Архивировано из оригинала 4 февраля 2009 года . Проверено 2 мая 2014 .
  3. ^ a b Эймс Б.Н., Дерстон В.Е., Ямасаки Э., Ли Ф.Д. (август 1973 г.). «Канцерогены - это мутагены: простая тест-система, объединяющая гомогенаты печени для активации и бактерии для обнаружения» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 70 (8): 2281–5. DOI : 10.1073 / pnas.70.8.2281 . PMC 433718 . PMID 4151811 .  
  4. ^ a b Эймс Б.Н., Герни Э.Г., Миллер Дж. А., Бартч Н. (ноябрь 1972 г.). «Канцерогены как мутагены сдвига рамки считывания: метаболиты и производные 2-ацетиламинофлуорена и других канцерогенов ароматических аминов» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 69 (11): 3128–32. DOI : 10.1073 / pnas.69.11.3128 . PMC 389719 . PMID 4564203 .  
  5. ^ a b Эймс Б.Н., Ли Ф.Д., Дерстон В.Е. (март 1973 г.). «Улучшенная бактериальная тест-система для обнаружения и классификации мутагенов и канцерогенов» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 70 (3): 782–6. DOI : 10.1073 / pnas.70.3.782 . PMC 433358 . PMID 4577135 .  
  6. ^ a b Макканн Дж., Спингарн Н. Э., Кобори Дж., Эймс Б. Н. (март 1975 г.). «Обнаружение канцерогенов как мутагенов: штаммы бактериальных тестеров с плазмидами R-фактора» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 72 (3): 979–83. DOI : 10.1073 / pnas.72.3.979 . PMC 432447 . PMID 165497 .  
  7. Перейти ↑ Hartwell L, Goldberg M, Hood L, Reynolds A, Silver L (2011). Генетика: от генов к геномам (4-е изд.). Нью-Йорк: Макгроу-Хилл. ISBN 978-0-07-352526-6. OCLC  317623365 .
  8. ^ a b Макканн Дж., Чой Э., Ямасаки Э., Эймс Б.Н. (декабрь 1975 г.). «Обнаружение канцерогенов как мутагенов в тесте на сальмонеллы / микросомы: анализ 300 химических веществ» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 72 (12): 5135–9. DOI : 10.1073 / pnas.72.12.5135 . PMC 388891 . PMID 1061098 .  
  9. ↑ Эймс Б.Н. (май 1979 г.). «Выявление химических веществ в окружающей среде, вызывающих мутации и рак» (PDF) . Наука . 204 (4393): 587–93. DOI : 10.1126 / science.373122 . JSTOR 1748159 . PMID 373122 .   
  10. ^ Привал MJ, Макка EC, водостоки B, Rosendranz HS (январь 1977). «Трис (2,3-дибромпропил) фосфат: мутагенность широко применяемого антипирена». Наука . 195 (4273): 76–8. DOI : 10.1126 / science.318761 . PMID 318761 . 
  11. ^ Hayatsu, Hiroka (1991), мутагенов в продуктов питания: обнаружения и предотвращения , CRC Press ., Стр 286 страниц, ISBN 978-0-8493-5877-7
  12. ^ Тисдейл A (2011). Генотоксические примеси: стратегии идентификации и контроля . Вили-Блэквелл. ISBN 978-0-470-49919-1.
  13. ^ TUBIANA M (сентябрь 1992). «Канцерогенный эффект от воздействия малых доз канцерогенов» . Британский журнал промышленной медицины . 49 (9): 601–5. DOI : 10.1136 / oem.49.9.601 . PMC 1039303 . PMID 1390264 .  
  14. ↑ Jenkins GJ, Doak SH, Johnson GE, Quick E, Waters EM, Parry JM (ноябрь 2005 г.). «Существуют ли пороговые значения реакции на дозу для генотоксичных алкилирующих агентов?» . Мутагенез . 20 (6): 389–98. DOI : 10,1093 / mutage / gei054 . PMID 16135536 . 
  15. ↑ Forman D (август 1991). «Эймс, тест Эймса и причины рака» . BMJ . 303 (6800): 428–9. DOI : 10.1136 / bmj.303.6800.428 . PMC 1670593 . PMID 1912830 .  
  16. Перейти ↑ Ames BN, Gold LS (октябрь 1990 г.). «Химический канцерогенез: слишком много канцерогенов для грызунов» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 87 (19): 7772–6. DOI : 10.1073 / pnas.87.19.7772 . PMC 54830 . PMID 2217209 .  
  17. ^ Twombly R (сентябрь 2001). «Федеральный доклад о канцерогенности открывает новый список номинантов» . Журнал Национального института рака . 93 (18): 1372. DOI : 10,1093 / JNCI / 93.18.1372 . PMID 11562386 . 
  18. ^ Farmer PB, Walker JM (2006). Молекулярные основы рака . Krieger Publishing Company. ISBN 978-0-7099-1044-2.
  19. ^ Хакура А, Сузуки S, Сато Т (январь 1999 г.). «Преимущество использования человеческой печени S9 в тесте Эймса». Мутационные исследования . 438 (1): 29–36. DOI : 10.1016 / s1383-5718 (98) 00159-4 . PMID 9858674 . 
  20. ^ Хакура А, Сузуки S, Т Сато (2004). «Улучшение теста Эймса с использованием препарата S9 печени человека». В Yan Z, Caldwell G (ред.). Оптимизация в открытии лекарств: методы in vitro . Методы фармакологии и токсикологии. Humana Press. ISBN 978-1-58829-332-9.
  21. Перейти ↑ Bridges BA (ноябрь 1980 г.). «Флуктуационный тест». Архив токсикологии . 46 (1–2): 41–4. DOI : 10.1007 / BF00361244 . PMID 7235997 . S2CID 23769437 .  

Дальнейшее чтение [ править ]

  • Филлипсон, Кэролайн Э .; Иоаннидес, Костас (1 марта 1989 г.). «Метаболическое действие полициклических ароматических углеводородов на мутагены в тесте Эймса различными видами животных, включая человека». Мутационные исследования / Фундаментальные и молекулярные механизмы мутагенеза . 211 (1): 147–151. DOI : 10.1016 / 0027-5107 (89) 90115-2 . ISSN  0027-5107 . PMID  2493576 .
  • Маккиннелл Р.Г. (06.11.2015). Понимание, профилактика и контроль рака человека: историческая работа и жизни Элизабет Каверт Миллер и Джеймса А. Миллера . БРИЛЛ. ISBN 9789004286801.
  • Claxton LD, Umbuzeiro GD, DeMarini DM (ноябрь 2010 г.). «Анализ мутагенности сальмонелл: стетоскоп генетической токсикологии 21 века» . Перспективы гигиены окружающей среды . 118 (11): 1515–22. DOI : 10.1289 / ehp.1002336 . PMC  2974687 . PMID  20682480 .