Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

ХОЛОД-ПЦР ( совместно -amplification при л Ауэр д enaturation температурно - ПЦР ) представляет собой модифицированный полимеразной цепной реакции (ПЦР) протокол , который обогащает вариант аллели из смеси дикого типа и мутации отработанный ДНК . Способность преимущественно амплифицировать и идентифицировать миноритарные аллели и низкоуровневые соматические мутации ДНК в присутствии избыточных аллелей дикого типа полезны для обнаружения мутаций. Обнаружение мутаций важно в случае раннего обнаружения рака на основе биопсий тканей и биологических жидкостей, таких какплазма или сыворотка крови , оценка остаточной болезни после операции или химиотерапииопределение стадий заболевания и молекулярное профилирование для прогноза или индивидуального подхода к терапии для отдельных пациентов, а также мониторинг результатов терапии и ремиссии или рецидива рака. Обычная ПЦР будет амплифицировать как основной (дикий тип), так и минорный (мутантный) аллели с одинаковой эффективностью, перекрывая способность легко обнаруживать наличие мутаций низкого уровня. Способность обнаруживать мутации в смеси вариантной ДНК / ДНК дикого типа ценна, потому что эта смесь вариантной ДНК может возникнуть при предоставлении гетерогенного образца - как это часто бывает с биопсией рака. В настоящее время традиционная ПЦР используется в тандеме с рядом различных последующих анализов для генотипирования или обнаружения соматических мутаций. Они могут включать использование амплифицированной ДНК для ПДРФ.анализ, генотипирование MALDI-TOF (матричная лазерная десорбция – время пролета) или прямое секвенирование для обнаружения мутаций с помощью секвенирования по Сэнгеру или пиросеквенирования . Замена традиционной ПЦР на ХОЛОДНУЮ ПЦР для этих последующих анализов повысит надежность обнаружения мутаций в смешанных образцах, включая опухоли и биологические жидкости.

Обзор метода ХОЛОДНОЙ ПЦР [ править ]

Обзор ХОЛОДНОЙ ПЦР по сравнению с обычной ПЦР.
Обычная ПЦР по сравнению с ХОЛОДНОЙ ПЦР.

Лежащий в основе принцип ХОЛОДНОЙ ПЦР заключается в том, что несоответствие одиночных нуклеотидов немного изменяет температуру плавления (Tm) двухцепочечной ДНК. В зависимости от контекста последовательности и положения несоответствия Tm изменяется на 0,2–1,5 ° C (0,36–2,7 ° F). обычны для последовательностей до 200 пар оснований и выше. Зная это, авторы протокола воспользовались двумя наблюдениями:

  • Каждая двухцепочечная ДНК имеет «критическую температуру» (Tc) ниже, чем ее Tm. Эффективность ПЦР-амплификации заметно падает ниже Tc.
  • Tc зависит от последовательности ДНК. Два фрагмента матричной ДНК, отличающиеся только одним или двумя несовпадениями нуклеотидов, будут иметь разную эффективность амплификации, если стадия денатурации ПЦР установлена ​​на Tc.

Помня об этих принципах, авторы разработали следующий общий протокол:

  1. Стадия денатурации. ДНК денатурируется при высокой температуре - обычно 94 ° C (201 ° F).
  2. Промежуточный отжиг. Установите промежуточную температуру отжига, которая позволяет гибридизовать мутантную и аллель ДНК дикого типа друг с другом. Поскольку мутантная аллельная ДНК образует меньшую часть ДНК в смеси, они с большей вероятностью образуют несовпадающую гетеродуплексную ДНК с ДНК дикого типа.
  3. Стадия плавления. Эти гетеродуплексы легче плавятся при более низких температурах. Следовательно, они избирательно денатурируют при Tc.
  4. Этап отжига праймера. Гомодуплексная ДНК будет предпочтительно оставаться двухцепочечной и не будет доступна для отжига праймеров.
  5. Этап продления. ДНК-полимераза будет расширяться комплементарно матричной ДНК. Поскольку гетеродуплексная ДНК используется в качестве матрицы, большая часть минорной вариантной ДНК будет амплифицирована и доступна для последующих раундов ПЦР.

На сегодняшний день разработаны две формы ХОЛОДНОЙ ПЦР. Полная ХОЛОДНАЯ ПЦР и Быстрая ХОЛОДНАЯ ПЦР.

Обзор полной ХОЛОДНОЙ ПЦР по сравнению с быстрой ХОЛОДНОЙ ПЦР.
Полная ХОЛОДНАЯ ПЦР против быстрой ХОЛОДНОЙ ПЦР.

Полная ХОЛОДНАЯ ПЦР [ править ]

Полная ХОЛОДНАЯ ПЦР идентична протоколу, описанному выше. Эти пять ступеней используются для каждого раунда усиления.

Быстрая COLD-PCR [ править ]

Быстрая ХОЛОДНАЯ ПЦР отличается от полной ХОЛОДНОЙ ПЦР тем, что пропускаются стадии денатурации и промежуточного отжига. Это связано с тем, что в некоторых случаях предпочтительная амплификация мутантной ДНК настолько велика, что обеспечение образования гетеродуплексной ДНК мутантного / дикого типа не требуется. Таким образом, денатурация может происходить на Tc, переходить к отжигу праймера и затем к удлинению, опосредованному полимеразой. Каждый раунд усиления будет включать эти три стадии в указанном порядке. При использовании более низкой температуры денатурации реакция будет различать продукты с более низкой Tm, то есть вариантные аллели. Быстрая ХОЛОДНАЯ ПЦР дает гораздо более быстрые результаты из-за укороченного протокола. Однако важно отметить, что полная ХОЛОДНАЯ ПЦР необходима для амплификации всех возможных мутаций в исходной смеси ДНК.

Двухэтапная ХОЛОДНАЯ ПЦР - это модифицированная версия быстрой ХОЛОДНОЙ ПЦР. Во втором раунде быстрой ХОЛОДНОЙ ПЦР используются вложенные праймеры. Это повышает чувствительность обнаружения мутаций по сравнению с быстрой ХОЛОДНОЙ ПЦР за один цикл. [1]

Использование COLD-PCR на сегодняшний день [ править ]

ХОЛОДНАЯ ПЦР использовалась для повышения надежности ряда различных анализов, в которых традиционно используется обычная ПЦР.

Последующие приложения, использующие обычную ПЦР, которую можно заменить ХОЛОДНОЙ ПЦР.

ПДРФ и ХОЛОДНАЯ ПЦР [ править ]

Полиморфизм длины рестрикционного фрагмента приводит к расщеплению (или его отсутствию) ДНК для конкретной мутации выбранным рестрикционным ферментом, который не будет расщеплять ДНК дикого типа. В исследовании с использованием смеси дикого типа и мутации, содержащей ДНК, амплифицированную с помощью обычной ПЦР или ХОЛОДНОЙ ПЦР, было показано, что ХОЛОДНАЯ ПЦР, предшествующая анализу ПДРФ, улучшает обнаружение мутаций в 10-20 раз. [2]

Секвенирование по Сэнгеру и ХОЛОДНАЯ ПЦР [ править ]

Секвенирование по Сэнгеру недавно было использовано для оценки обогащения мутантной ДНК из смеси 1:20 мутантной ДНК: ДНК дикого типа. Вариант ДНК, содержащий мутацию, был получен из линии клеток рака молочной железы, о которой известно, что она содержит мутации р53 . [1] Сравнение хроматограмм секвенирования по Сэнгеру показало, что мутантный аллель был обогащен в 13 раз при использовании ХОЛОДНОЙ ПЦР по сравнению с одной традиционной ПЦР. [1] Это определялось размером пиков на хроматограмме в месте расположения вариантного аллеля.

Кроме того, ХОЛОДНАЯ ПЦР использовалась для обнаружения мутаций р53 в образцах аденокарциномы легких . В ходе исследования было обнаружено 8 мутаций низкого уровня (менее 20%), которые, вероятно, были бы пропущены при использовании обычных методов, которые не обогащают вариантную последовательность ДНК.

Пиросеквенирование и ХОЛОДНАЯ ПЦР [ править ]

Было показано, что, как и при прямом секвенировании по Сэнгеру, с пиросеквенированием ХОЛОДНАЯ ПЦР способна обнаруживать мутации, которые имели распространенность 0,5–1% от используемых образцов. [3] COLD-PCR была использована для обнаружения мутаций p53 и KRAS с помощью пиросеквенирования, и в обоих случаях было показано, что она превосходит стандартную PCR.

MALDI-TOF и COLD-PCR [ править ]

Та же исследовательская группа, которая разработала COLD-PCR и использовала ее для сравнения чувствительности обычной ПЦР для генотипирования с прямым секвенированием по Сэнгеру, RFLP и пиросеквенированием, также провела аналогичное исследование с использованием MALDI-TOF в качестве последующего приложения для обнаружения мутаций. Их результаты показали, что COLD-PCR может обогатить последовательности мутаций из смеси ДНК в 10-100 раз и что мутации с исходной распространенностью 0,1-0,5% будут обнаруживаться. [4] По сравнению с 5-10% низкоуровневой детекцией, ожидаемой при традиционной ПЦР.

QPCR и COLD-PCR [ править ]

Было показано, что запуск COLD-PCR на машине для количественной ПЦР с использованием зондов TaqMan, специфичных для мутации, увеличивает измеренную разницу между образцами мутантного и дикого типов. [4]

Преимущества COLD-PCR [ править ]

  • Одношаговый метод, позволяющий обогатить как известные, так и неизвестные миноритарные аллели независимо от типа и положения мутации.
  • Не требует дополнительных реагентов или специального оборудования. Поэтому стоимость не увеличивается.
  • Лучше, чем обычная ПЦР для обнаружения мутаций в смешанном образце.
  • Не увеличивает существенно время проведения эксперимента по сравнению с обычной ПЦР.

Недостатки COLD-PCR [ править ]

  • Оптимальная Tc должна быть измерена и определена для каждого ампликона. Добавление дополнительного шага к обычным процедурам на основе ПЦР.
  • Требование к точному контролю температуры денатурации во время ПЦР с точностью до ± 0,3 ° C (0,54 ° F).
  • Подходящая критическая температура может быть недоступна, чтобы различать мутантные последовательности ДНК и последовательности ДНК дикого типа.
  • Только для анализа последовательностей размером менее 200 пар оснований.
  • Уязвим к ошибкам, вызванным полимеразой.
  • Переменное общее обогащение мутаций, которое зависит от положения ДНК и замены нуклеотидов.
  • Нет гарантии, что все мутации низкого уровня будут преимущественно обогащены.

История [ править ]

ХОЛОДНАЯ ПЦР была первоначально описана Li et al. в статье Nature Medicine, опубликованной в 2008 году лабораторией доктора Майка Макригиоргоса в Онкологическом институте Даны Фарбер Гарвардской медицинской школы. [2] Как было сказано выше, эта технология использовалась в ряде экспериментальных экспериментов и медицинских исследовательских диагностических экспериментов.

Недавно технология COLD-PCR была лицензирована Transgenomic, Inc. Условия лицензирования включают исключительные права на коммерциализацию технологии в сочетании с секвенированием по Сэнгеру. В планах - разработка коммерческих приложений, которые позволят быстро и с высокой чувствительностью обнаруживать низкоуровневые соматические и митохондриальные мутации ДНК. [5]

Альтернативы [ править ]

Доступны и другие технологии для обнаружения меньших мутаций ДНК, и эти методы можно разделить по их способности обогащать и обнаруживать известные или неизвестные мутации. [6]

Альтернативы COLD-PCR. COLD-PCR имеет селективность от 10 -1 до 10-4.

См. Также [ править ]

  • ПЦР
  • Генотипирование
  • Полиморфизм единичного нуклеотида
  • SNP-генотипирование

Ссылки [ править ]

  1. ^ a b c Ли Дж., Милбери, Калифорния, Ли К., Макригиоргос Г.М. (ноябрь 2009 г.). «Двухэтапное секвенирование по Сэнгеру на основе COLD-PCR идентифицирует новый спектр низкоуровневых мутаций в аденокарциноме легких» . Мутация человека . 30 (11): 1583–90. DOI : 10.1002 / humu.21112 . PMC  2784016 . PMID  19760750 .
  2. ^ а б Ли Дж, Ван Л., Мамон Х , Кульке М. Х. , Бербеко Р., Макригиоргос Г. М. (май 2008 г.). «Замена ПЦР на ХОЛОДНУЮ ПЦР обогащает вариантные последовательности ДНК и переопределяет чувствительность генетического тестирования». Природная медицина . 14 (5): 579–84. DOI : 10.1038 / nm1708 . PMID 18408729 . 
  3. ↑ Zuo Z, Chen SS, Chandra PK и др. (Август 2009 г.). «Применение COLD-PCR для улучшенного обнаружения мутаций KRAS в клинических образцах» . Современная патология . 22 (8): 1023–31. DOI : 10.1038 / modpathol.2009.59 . PMID 19430420 . 
  4. ^ а б Ли Дж, Макригиоргос GM (апрель 2009 г.). «COLD-PCR: новая платформа для улучшенного обнаружения мутаций при онкологических и генетических исследованиях». Труды биохимического общества . 37 (2): 427–32. DOI : 10.1042 / BST0370427 . PMID 19290875 . 
  5. ↑ Редакционная группа Laboratorytalk (октябрь 2009 г.). «Трансгеномика лицензирует технологию COLD-PCR» . Архивировано из оригинала на 2011-07-18 . Проверено 4 марта 2010 .
  6. ^ Милбери CA, Li J, Makrigiorgos GM (апрель 2009). «Методы на основе ПЦР для обогащения миноритарных аллелей и мутаций» . Клиническая химия . 55 (4): 632–40. DOI : 10,1373 / clinchem.2008.113035 . PMC 2811432 . PMID 19201784 .