Токсин A Clostridium difficile (TcdA) - это токсин, вырабатываемый Clostridioides difficile , ранее известный как Clostridium difficile . [1] Он похож на токсин B Clostridium difficile . Токсины являются основными факторами вирулентности, продуцируемыми грамположительными анаэробными [2] бактериями Clostridioides difficile . Токсины действуют за счет повреждения слизистой оболочки кишечника и вызывают симптомы инфекции C. difficile , включая псевдомембранозный колит .
Токсин А | ||||||
---|---|---|---|---|---|---|
Идентификаторы | ||||||
Организм | ||||||
Символ | toxA | |||||
Альт. символы | tcdA | |||||
Entrez | 4914076 | |||||
RefSeq (Prot) | YP_001087137.1 | |||||
UniProt | P16154 | |||||
Прочие данные | ||||||
Номер ЕС | 2.4.1.- | |||||
Хромосома | геном: 0,79 - 0,81 Мб | |||||
|
TcdA - один из крупнейших известных бактериальных токсинов. С молекулярной массой 308 кДа, как правило , описываются как мощный энтеротоксин , [3] , но он также имеет некоторую активность в качестве цитотоксина . [4] Токсин действует путем модификации белков ГТФазы клетки-хозяина путем глюкозилирования, что приводит к изменению клеточной активности. Факторы риска для C. несговорчивых инфекций включают лечение антибиотиков, которые могут нарушить нормальные кишечные микробиот и привести к колонизации C. несговорчивых бактерий. [5]
ген tcdA
Ген содержит открытую рамку считывания (ORF) от 8,133 нуклеотидов , кодирующей 2,710 аминокислот . TcdA и TcdB имеют 63% гомологии в своих аминокислотных последовательностях. [6] Эти гены экспрессируются во время поздней логарифмической фазы и стационарной фазы в ответ на факторы окружающей среды. Стрессы окружающей среды, такие как антибиотики и подавление катаболитов, могут влиять на экспрессию токсинов. [7]
Локус патогенности
В tcdA и tcdB гены расположены на несговорчивый Clostridioides хромосомы в 19.6 т.п.н. патогенности локуса (PaLoc) обнаружены только в токсигенных штаммов C.difficile , . Нетоксигенные штаммы содержат фрагмент из 127 пар оснований, заменяющий PaLoc. [8] Этот локус также содержит три других дополнительных гена tcdC , tcdR и tcdE . [9] Экспрессия TcdC высока во время ранней экспоненциальной фазы и снижается по мере перехода роста в стационарную фазу , что согласуется с увеличением экспрессии tcdA и tcdB . Соответственно, паттерны экспрессии указывают на tcdC как на возможный негативный регулятор продукции токсина. tcdR может служить положительным регулятором выработки токсина. [7] Предполагается , что tcdE способствует высвобождению TcdA и TcdB за счет литической активности на мембране бактериальной клетки. Из-за своей гомологии с другими белками схожей функции, а также из-за расположения гена между tcdA и tcdB , tcdE, как предполагается, будет функционировать как литический белок, который облегчает высвобождение, поскольку TcdA и TcdB не имеют сигнального пептида для секреции . [8]
Состав
Белок содержит три домена. Амино N-концевой домен содержит активный сайт , ответственный за glucosylating активности токсина. И TcdA, и TcdB используют эту высококонсервативную N-концевую область (74% гомологии между обоими токсинами) для изменения идентичных субстратов . [7]
Карбокси- С-концевой домен содержит повторяющиеся единицы, которые отвечают за связывание рецептора на поверхности клеток-мишеней. Эти короткие гомологичные повторяющиеся единицы были названы комбинированными повторяющимися олигопептидами (CROP). [7] [10] Недавнее исследование демонстрирует, что CROP определяют эффективность TcdA через взаимодействия со структурами на поверхности клетки. [11] Эти области CROP варьируются от 21 до 50 остатков и играют роль в связывании рецепторов. [7] Эта повторяющаяся на С-конце область обозначается как иммуно-доминантная область, поскольку связывание лиганда может блокироваться моноклональными антителами, специфичными для этой области. [12] [13] Эта область содержит наиболее гидрофильную часть молекулы. [10]
Считается, что центрально расположенный гидрофобный домен, содержащий кластер из 172 высококонсервативных гидрофобных аминокислот, важен для транслокации ферментативной части белка. [5] [6]
Механизм действия
TcdA должен быть интернализован в клетке-хозяине посредством эндоцитоза , чтобы получить доступ к цитозолю . Связывание рецептора - это первый шаг, необходимый для проникновения в клетку через эндоцитоз в кислой эндосоме . [6] Низкий pH в эндосоме вызывает структурные изменения, такие как обнажение гидрофобных доменов, которые имеют решающее значение для функции TcdA. [7] [14]
N-концевой домен TcdA катализирует реакцию глюкотрансферазы, которая переносит молекулу глюкозы из UDP-глюкозы и ковалентно присоединяет ее к консервативным аминокислотам в молекулах-мишенях. [6] Таким образом, TcdA катализирует глюкозилирование и последующую необратимую инактивацию целевых молекул в семействе Ras малых ГТФаз. [9] Эти молекулы-мишени включают RhoA , Rac и Cdc42 , которые являются регуляторными белками актинового цитоскелета эукариот и модуляторами многих различных клеточных сигнальных путей. [7]
Внутриклеточные цели
TcdA в первую очередь нацелен на Rho , Rac и Cdc42 . Эти молекулы являются важными регуляторами клеточной передачи сигналов. Малые GTPases, такие как Rho, Rac и Cdc42, регулируют свою активность, чередуя активное состояние, связанное с GTP , и неактивное состояние, связанное с GDP . [7] Факторы обмена гуанина (GEF) регулируют обмен GTP и ВВП . [15]
TcdA глюкозилирует RhoA путем переноса молекулы глюкозы с UDP-глюкозы , нуклеотидного сахара, на Thr-37 RhoA GTPase. В Rac и Cdc42 сахарный фрагмент переносится на Thr-35. Глюкозилирование препятствует правильному связыванию GTP и блокирует активацию. [7] TcdA действует преимущественно на GDP-связанную форму белков GTPase, поскольку эта конфигурация раскрывает остаток треонина, который глюкозилируется токсином. [5]
RhoA регулирует актиновый цитоскелет и формирует стрессовые волокна и очаговые спайки . [16] Когда RhoA инактивируется через TcdA, его взаимодействие с нижележащими эффекторами ингибируется. Это приводит к изменениям актинового цитоскелета, которые увеличивают проницаемость кишечного эпителия . Rac и Cdc42 участвуют в образовании филоподий, критически важных для движения и миграции клеток. В целом, Rho , Rac и Cdc42 все регулируют процессы в клетках, которые зависят от полимеризации актина. Многие физиологические эффекты, которые клетки испытывают после воздействия TcdA, могут быть связаны с нарушением регуляции полимеризации актина и клеточных путей, контролируемых мишенями TcdA. [7]
Физиологические эффекты
Морфология клетки
Воздействие TcdA приводит к немедленным изменениям морфологии клеток, включая потерю структурной целостности из-за уменьшения нитчатого актина ( F-актина ) и увеличения глобулярного актина . [17] Дезорганизация актиновых филаментов и цитоскелета приводит к повышенной проницаемости плотных контактов, что приводит к серьезному повреждению эпителиальных клеток и секреции жидкости. [18] [19] Накопление и секреция жидкости являются вторичными по отношению к повреждению слизистой оболочки, которое происходит после воздействия TcdA. Отчетливые изменения в системе микрофиламентов приводят к округлению клеток и их гибели. [17] Эти изменения являются результатом инактивации белков Rho , которые играют важную роль в регулировании плотных контактов . [7] [20]
Апоптоз
Апоптоз - наиболее вероятный механизм гибели клеток, подвергшихся действию TcdA. Инактивация Rho может активировать каспазу-3 и каспазу-9 ; два ключевых компонента апоптотического пути. TcdA был связан с разрушением митохондриальной мембраны и высвобождением цитохрома C через активацию каспазы и инактивацию Rho , что также предполагает, что TcdA способна индуцировать апоптоз. [21] [22]
Клиническое значение
Диарея, связанная с Clostridioides difficile (CDAD)
Модели на животных показали , TcdA включает в себя диарею, нейтрофильной инфильтрации, воспаление в слизистой оболочке кишечника и некроз из эпителиальных клеток . Этот токсин считается основной причиной CDAD. [18] TcdA повреждает кончики ворсинок кишечника, что разрушает мембрану щеточной каймы , что приводит к эрозии клеток и вытеканию жидкости из поврежденного участка. Это повреждение и связанная с ним реакция жидкости вызывает диарею, связанную с инфекцией Clostridioides difficile . [17]
Псевдомембранозный колит
TcdA может вызывать физиологические изменения, которые возникают при псевдомембранозном колите (PMC), связанном с C. difficile , тяжелом изъязвлении толстой кишки. Повреждение токсинами слизистой оболочки толстой кишки способствует накоплению фибрина , муцина и мертвых клеток с образованием слоя мусора в толстой кишке (псевдомембраны), вызывая воспалительную реакцию . [5] Повреждение TcdA вызывает повышенную проницаемость эпителия, выработку цитокинов и хемокинов , инфильтрацию нейтрофилов, продукцию активных форм кислорода (АФК), активацию тучных клеток и прямое повреждение слизистой оболочки кишечника. [23] Все это можно отнести к TcdA-индуцированной инактивации белков Rho GTPase . [20] Отсутствие плотных контактов может обеспечить проникновение нейтрофилов в кишечник, что приведет к накоплению нейтрофилов; визитная карточка ЧВК. TcdA-индуцированная продукция цитокинов IL-8 и других медиаторов воспаления вносит свой вклад в стадии воспаления, наблюдаемые при PMC. Инфильтрация нейтрофилами, макрофагами и тучными клетками в ответ на повреждение TcdA увеличивает воспалительную реакцию за счет продукции и высвобождения других медиаторов, таких как фактор некроза опухоли альфа , IL-1 , IL-6 и другие монокины . Эти медиаторы вызывают дополнительное повреждение слизистой оболочки кишечника и еще больше усиливают воспалительную реакцию, влияя на устойчивость PMC. [24] При обширном повреждении стенки кишечника бактерии могут попасть в кровоток и вызвать септический шок и смерть. [5]
Обнаружение и диагностика токсинов
TcdA и TcdB присутствуют в надосадочной жидкости культур Clostridium difficile и могут быть очищены от фильтрата. Оба токсина постоянно обнаруживаются в образцах фекалий людей и животных [25] и в настоящее время используются в качестве маркеров для диагностики инфекции C. difficile . [7] Было обнаружено, что более 90% пациентов, инфицированных C. difficile , обладают цитотоксической активностью в стуле. Глюкозилирование Rho GTPases инактивирует белки GTPase, что приводит к коллапсу цитоскелтона, что приводит к округлению клеток. Для обнаружения токсинов C. difficile в образцах стула был разработан анализ тканевых культур . [17] Анализ округления клеток (анализ цитотоксичности) был разработан для диагностики инфекции C. difficile . [11] Иммуноферментный анализ (ELISA) был использован для обнаружения TcdA и TcdB с помощью специфических антител . При использовании с ELISA анализ цитотоксичности является «золотым стандартом» при использовании на клетках Vero для диагностики C. difficile . [11]
Важность TcdA и TcdB при инфекции C. difficile
С 1980-х и начала 1990-х годов активно обсуждается роль TcdA и TcdB в инфекции C. difficile . Предыдущие отчеты с очищенными токсинами показали, что одного TcdA было достаточно, чтобы вызвать симптомы инфекции, а TcdB не мог этого сделать, если не сочетался с TcdA. [7] Более поздний эксперимент показал, что TcdB действительно важен для вирулентности . [26] Более ранние исследования установили, что TcdA строго энтеротоксин , а TcdB - цитотоксин , но позже было обнаружено, что оба токсина имеют одинаковый механизм действия. [6] Чтобы полностью изучить роль обоих токсинов в патогенезе инфекции C. difficile , была разработана система нокаута гена на модели инфекции хомяка. Путем постоянного нокаута tcdA , tcdB или обоих (двойной нокаут) было показано, что C. difficile, продуцирующая один или оба токсина , обладает цитотоксической активностью, и эта активность транслируется непосредственно в вирулентность in vivo . Было также обнаружено, что двойной нокаут tcdAtcdB был полностью ослаблен по вирулентности . В целом, это исследование продемонстрировало важность как TcdA, так и TcdB при инфекции C. difficile , показав, что любой токсин способен проявлять цитотоксичность. [9]
Смотрите также
- Clostridium difficile TcdE Holin
- Холин
Рекомендации
- ^ Планш Т, Aghaizu А, Holliman Р, Р Райли, Poloniecki Дж, Breathnach А, Кришна S (декабрь 2008). «Диагностика инфекции Clostridium difficile с помощью наборов для обнаружения токсинов: систематический обзор». Ланцетные инфекционные болезни . 8 (12): 777–84. DOI : 10.1016 / S1473-3099 (08) 70233-0 . PMID 18977696 .
- ^ Эдвардс А.Н., Суарес Дж. М., Макбрайд С. М. (сентябрь 2013 г.). «Выращивание и поддержание Clostridium difficile в анаэробной среде» . Журнал визуализированных экспериментов: JoVE (79): e50787. DOI : 10.3791 / 50787 . PMC 3871928 . PMID 24084491 .
- ^ Петерсон Л. Р., Холтер Дж. Дж., Шанхольцер С. Дж., Гаррет С. Р., Гердинг Д. Н. (август 1986 г.). «Обнаружение токсинов A (энтеротоксин) и B (цитотоксин) Clostridium difficile в клинических образцах. Оценка теста латексной агглютинации» . Американский журнал клинической патологии . 86 (2): 208–11. DOI : 10.1093 / ajcp / 86.2.208 . PMID 3739972 .
- ^ Такер К.Д., Кэрриг П.Е., Уилкинс Т.Д. (май 1990 г.). «Токсин A Clostridium difficile является сильнодействующим цитотоксином» . Журнал клинической микробиологии . 28 (5): 869–71. DOI : 10.1128 / JCM.28.5.869-871.1990 . PMC 267826 . PMID 2112562 .
- ^ а б в г д Винклер М.Э., Уилсон Б.Дж., Салиерс А.А., Уитт Д.Д. (2010). Бактериальный патогенез: молекулярный подход . Парк Металлов, Огайо: ASM. ISBN 978-1-55581-418-2.
- ^ а б в г д Чавес-Оларте Э., Вайдманн М., Эйхель-Штрейбер С., Телестам М. (октябрь 1997 г.). «Токсины A и B из Clostridium difficile различаются по ферментативной активности, специфичности клеточного субстрата и поверхностному связыванию с культивируемыми клетками» . Журнал клинических исследований . 100 (7): 1734–41. DOI : 10.1172 / JCI119698 . PMC 508356 . PMID 9312171 .
- ^ Б с д е е г ч я J к л м Вот, Д. Д., Баллард, Д. Д. (апрель 2005 г.). « Токсины Clostridium difficile : механизм действия и роль в заболевании» . Обзоры клинической микробиологии . 18 (2): 247–63. DOI : 10.1128 / CMR.18.2.247-263.2005 . PMC 1082799 . PMID 15831824 .
- ^ а б Tan KS, Wee BY, Song KP (июль 2001 г.). «Доказательства холиновой функции гена tcdE в патогенности Clostridium difficile » . J. Med. Microbiol . 50 (7): 613–9. DOI : 10.1099 / 0022-1317-50-7-613 . PMID 11444771 .
- ^ а б в Кюне С.А., Картман С.Т., Хип Дж.Т., Келли М.Л., Кокейн А., Минтон Н.П. (октябрь 2010 г.). «Роль токсина А и токсина В в инфекции Clostridium difficile ». Природа . 467 (7316): 711–3. Bibcode : 2010Natur.467..711K . DOI : 10,1038 / природа09397 . ЛВП : 10044/1/15560 . PMID 20844489 . S2CID 4417414 .
- ^ а б Голубь CH, Ван С.З., Прайс С.Б., Фелпс С.Дж., Лайерли Д.М., Уилкинс Т.Д., Джонсон Дж.Л. (февраль 1990 г.). «Молекулярная характеристика гена токсина А Clostridium difficile » . Инфекция и иммунитет . 58 (2): 480–8. DOI : 10.1128 / IAI.58.2.480-488.1990 . PMC 258482 . PMID 2105276 .
- ^ а б в Оллинг А, Гой С., Хоффманн Ф, Татге Х, Just I, Герхард Р. (2011). «Повторяющиеся олигопептидные последовательности модулируют цитопатическую активность, но не являются решающими для клеточного поглощения токсина A Clostridium difficile » . PLOS ONE . 6 (3): e17623. Bibcode : 2011PLoSO ... 617623O . DOI : 10.1371 / journal.pone.0017623 . PMC 3060812 . PMID 21445253 .
- ^ Салливан Н.М., Пеллетт С., Уилкинс Т.Д. (март 1982 г.). «Очистка и характеристика токсинов A и B Clostridium difficile » . Инфекция и иммунитет . 35 (3): 1032–40. DOI : 10.1128 / IAI.35.3.1032-1040.1982 . PMC 351151 . PMID 7068210 .
- ^ фон Эйхель-Штрейбер С., Лауфенберг-Фельдманн Р., Сартинген С., Шульце Дж., Зауэрборн М. (май 1992 г.). «Сравнительный анализ последовательности токсинов A и B Clostridium difficile ». Молекулярная генетика и геномика . 233 (1–2): 260–8. DOI : 10.1007 / bf00587587 . PMID 1603068 . S2CID 7052419 .
- ^ Флорин I, Телестам М (декабрь 1983 г.). «Интернализация цитотоксина Clostridium difficile в культивируемых фибробластах легких человека». Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Исследование молекулярных клеток . 763 (4): 383–92. DOI : 10.1016 / 0167-4889 (83) 90100-3 . PMID 6652117 .
- ^ Чжоу К., Ван Й., Горски Дж. Л., Номура Н., Коллард Дж., Бокоч Г. М. (июль 1998 г.). «Факторы обмена гуаниновых нуклеотидов регулируют специфичность нисходящей передачи сигналов от Rac и Cdc42» . Журнал биологической химии . 273 (27): 16782–6. DOI : 10.1074 / jbc.273.27.16782 . PMID 9642235 .
- ^ Just I, Selzer J, von Eichel-Streiber C, Aktories K (март 1995). «На низкомолекулярный GTP-связывающий белок Rho действует токсин А из Clostridium difficile » . Журнал клинических исследований . 95 (3): 1026–31. DOI : 10.1172 / JCI117747 . PMC 441436 . PMID 7883950 .
- ^ а б в г Лайерли Д.М., Криван ХК, Уилкинс Т.Д. (январь 1988 г.). « Clostridium difficile : болезнь и токсины» . Обзоры клинической микробиологии . 1 (1): 1–18. DOI : 10,1128 / cmr.1.1.1 . PMC 358025 . PMID 3144429 .
- ^ а б Варни М., Верман Дж. П., Авесани В., Дельме М. (февраль 1994 г.). «Человеческий антительный ответ на токсин A Clostridium difficile в зависимости от клинического течения инфекции» . Инфекция и иммунитет . 62 (2): 384–9. DOI : 10.1128 / IAI.62.2.384-389.1994 . PMC 186119 . PMID 8300199 .
- ^ Hecht G, Pothoulakis C, LaMont JT, Madara JL (ноябрь 1988 г.). « Токсин A Clostridium difficile нарушает структуру цитоскелета и проницаемость плотных контактов культивируемых монослоев кишечного эпителия человека» . Журнал клинических исследований . 82 (5): 1516–24. DOI : 10.1172 / JCI113760 . PMC 442717 . PMID 3141478 .
- ^ а б Нусрат А., Гири М., Тернер Дж. Р., Колган С. П., Паркос Калифорния, Карнес Д., Лемичез Е., Боке П., Мадара Дж. Л. (ноябрь 1995 г.). «Белок Rho регулирует плотные контакты и перифункциональную организацию актина в поляризованном эпителии» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 92 (23): 10629–33. Bibcode : 1995PNAS ... 9210629N . DOI : 10.1073 / pnas.92.23.10629 . PMC 40665 . PMID 7479854 .
- ^ Hippenstiel S, Schmeck B., N'Guessan PD, Seybold J, Krüll M, Preissner K, Eichel-Streiber CV, Suttorp N (октябрь 2002 г.). «Инактивация белка Rho индуцировала апоптоз культивируемых эндотелиальных клеток человека». Американский журнал физиологии. Клеточная и молекулярная физиология легких . 283 (4): L830–8. DOI : 10,1152 / ajplung.00467.2001 . PMID 12225960 . S2CID 7033902 .
- ^ Брито Г.А., Фуджи Дж., Карнейро-Филхо Б.А., Лима А.А., Обриг Т., Геррант Р.Л. (ноябрь 2002 г.). «Механизм апоптоза, вызванного токсином А Clostridium difficile в клетках Т84» . Журнал инфекционных болезней . 186 (10): 1438–47. DOI : 10.1086 / 344729 . PMID 12404159 .
- ^ Келли С.П., Беккер С., Линевски Дж. К., Джоши М. А., О'Кин Дж. К., Дики Б. Ф., Ламонт Дж. Т., Поулакис С. (март 1994 г.). «Набор нейтрофилов в энтерите токсина А Clostridium difficile у кроликов» . Журнал клинических исследований . 93 (3): 1257–65. DOI : 10.1172 / JCI117080 . PMC 294078 . PMID 7907603 .
- ^ Флегель В.А., Мюллер Ф., Даубенер В., Фишер Х.Г., Хаддинг У., Нортофф Х. (октябрь 1991 г.). «Цитокиновый ответ человеческих моноцитов на токсин А и токсин В Clostridium difficile » . Инфекция и иммунитет . 59 (10): 3659–66. DOI : 10.1128 / IAI.59.10.3659-3666.1991 . PMC 258935 . PMID 1910012 .
- ^ Лима А.А., Лайерли Д.М., Уилкинс Т.Д., Иннес Д.Д., Геррант Р.Л. (март 1988 г.). «Действие токсинов A и B Clostridium difficile в тонком и толстом кишечнике кролика in vivo и на культивируемых клетках in vitro» . Инфекция и иммунитет . 56 (3): 582–8. DOI : 10.1128 / IAI.56.3.582-588.1988 . PMC 259330 . PMID 3343050 .
- ^ Лирас Д., О'Коннор-младший, Ховарт П.М., Самбол С.П., Картер Г.П., Фумунна Т., Пун Р., Адамс В., Ведантам Дж., Джонсон С., Гердинг Д. Н., Руд Дж. И. (апрель 2009 г.). «Токсин B необходим для вирулентности Clostridium difficile » . Природа . 458 (7242): 1176–9. Bibcode : 2009Natur.458.1176L . DOI : 10,1038 / природа07822 . PMC 2679968 . PMID 19252482 .