Из Википедии, бесплатной энциклопедии
  (Перенаправлено с конфокального микроскопа )
Перейти к навигации Перейти к поиску
Принцип работы флуоресцентного и конфокального микроскопов

Конфокальная микроскопия , наиболее часто конфокальные лазерная сканирующая микроскопия ( CLSM ) или лазерная конфокальная сканирующая микроскопия ( ЛКСМ ), представляет собой оптический метод визуализации для увеличения оптического разрешения и контраста в виде микрофотографии с помощью с помощью пространственного крошечного отверстия , чтобы блокировать фокус света в формировании имиджа. [1] Захват нескольких двумерных изображений на разной глубине в образце позволяет реконструировать трехмерные структуры (процесс, известный как оптическое сечение) внутри объекта. Этот метод широко используется в научных и промышленных кругах, а типичное применение - в науках о жизни , контроле полупроводников и материаловедении .

Свет проходит через образец под обычным микроскопом настолько глубоко в образец, насколько он может проникнуть, в то время как конфокальный микроскоп фокусирует только меньший луч света на одном узком уровне глубины за раз. CLSM обеспечивает контролируемую и сильно ограниченную глубину резкости .

Основная концепция [ править ]

Принцип сенсора конфокальной точки из патента Мински
Слитый белок GFP экспрессируется в Nicotiana benthamiana . Флуоресценция видна с помощью конфокальной микроскопии.

Принцип конфокальной визуализации был запатентован в 1957 году Марвином Мински [2] и направлен на преодоление некоторых ограничений традиционных широкопольных флуоресцентных микроскопов . [3] В обычном (т.е. широкопольном) флуоресцентном микроскопе весь образец равномерно залит светом от источника света. Все части образца могут быть возбуждены одновременно, и результирующая флуоресценция обнаруживается фотодетектором или камерой микроскопа, включая большую несфокусированную часть фона. В отличие от этого, конфокальный микроскоп использует точечное освещение (см. Функцию распределения точек.) и точечное отверстие в оптически сопряженной плоскости перед детектором для устранения расфокусированного сигнала - от этой конфигурации происходит название «конфокальная». Поскольку может быть обнаружен только свет, производимый флуоресценцией очень близко к фокальной плоскости , оптическое разрешение изображения , особенно в направлении глубины образца, намного лучше, чем у широкопольных микроскопов. Однако, поскольку большая часть света от флуоресценции образца блокируется в отверстии, это повышенное разрешение достигается за счет снижения интенсивности сигнала - поэтому часто требуются длительные экспозиции . Чтобы компенсировать это падение сигнала после точечного отверстия , интенсивность света определяется чувствительным детектором, обычно фотоумножителем (ФЭУ) илилавинный фотодиод , преобразующий световой сигнал в электрический. [4]

Поскольку одновременно освещается только одна точка в образце, для получения двухмерных или трехмерных изображений требуется сканирование по обычному растру (т. Е. По прямоугольному шаблону с параллельными линиями сканирования) в образце. Луч сканируется по образцу в горизонтальной плоскости с помощью одного или нескольких ( сервоуправляемых ) колеблющихся зеркал. Этот метод сканирования обычно имеет низкую задержку реакции, и скорость сканирования можно варьировать. Более медленное сканирование обеспечивает лучшее отношение сигнал / шум , что приводит к лучшему контрасту .

Достижима толщина фокальной плоскости определяется главным образом от длины волны используемого света , деленной на числовой апертуры этого объектива , но и оптических свойств образца. Возможность тонкого оптического сечения делает эти типы микроскопов особенно хорошими для получения трехмерных изображений и профилирования поверхности образцов.

Последовательные срезы составляют «z-стек», который можно либо обработать для создания трехмерного изображения, либо объединить в двухмерный стек (в основном берется максимальная интенсивность пикселей, другие распространенные методы включают использование стандартного отклонения или суммирование пикселей). [1]

Конфокальная микроскопия обеспечивает возможность прямого, неинвазивного, серийного оптического сечения неповрежденных, толстых, живых образцов с минимальной подготовкой образцов, а также незначительное улучшение латерального разрешения по сравнению с широкопольной микроскопией. [4] Биологические образцы часто обрабатывают флуоресцентными красителями, чтобы сделать видимыми выбранные объекты. Однако фактическая концентрация красителя может быть низкой, чтобы минимизировать нарушение биологических систем: некоторые инструменты могут отслеживать отдельные флуоресцентные молекулы. Кроме того, трансгенные методы могут создавать организмы, которые производят свои собственные флуоресцентные химерные молекулы (например, слияние GFP, зеленого флуоресцентного белкас интересующим белком). Конфокальные микроскопы работают по принципу точечного возбуждения в образце (дифракционно ограниченное пятно) и точечного обнаружения результирующего флуоресцентного сигнала. Точечное отверстие в детекторе обеспечивает физический барьер, который блокирует расфокусированную флуоресценцию. Записывается только сфокусированная или центральная точка диска Эйри . Растровое сканирование образца по одной точке позволяет собирать тонкие оптические срезы простым изменением z-фокуса. Полученные изображения можно сложить, чтобы получить трехмерное изображение образца.

Методы, используемые для горизонтального сканирования [ править ]

На этом конфокальном изображении, сделанном на установке световой микроскопии EMBL , показана группа диатомовых водорослей с голубыми клеточными стенками, красными хлоропластами, синей ДНК и зелеными мембранами и органеллами.

Коммерчески доступны четыре типа конфокальных микроскопов:

Конфокальные лазерные сканирующие микроскопы используют несколько зеркал (обычно 2 или 3 сканирующих линейно по осям x и y) для сканирования лазером по образцу и «десканирования» изображения по фиксированному отверстию и детектору.

Конфокальные микроскопы с вращающимся диском ( диск Нипкова ) используют серию движущихся отверстий на диске для сканирования световых пятен. Поскольку серия точечных отверстий сканирует область параллельно, каждому точечному отверстию позволяют парить над определенной областью в течение более длительного периода времени, тем самым уменьшая энергию возбуждения, необходимую для освещения образца, по сравнению с лазерными сканирующими микроскопами. Пониженная энергия возбуждения снижает фототоксичность и фотообесцвечивание образца, что часто делает его предпочтительной системой для визуализации живых клеток или организмов.

Конфокальные микроскопы с улучшенными микролинзами или с двумя вращающимися дисками работают по тем же принципам, что и конфокальные микроскопы с вращающимся диском, за исключением того, что второй вращающийся диск, содержащий микролинзы, помещается перед вращающимся диском, содержащим микроотверстия. С каждым отверстием связана микролинза. Микролинзы захватывают широкую полосу света и фокусируют его в каждое точечное отверстие, значительно увеличивая количество света, направляемого в каждое точечное отверстие, и уменьшая количество света, блокируемого вращающимся диском. Конфокальные микроскопы, усиленные микролинзами, поэтому значительно более чувствительны, чем стандартные системы с вращающимся диском. Компания Yokogawa Electric изобрела эту технологию в 1992 году. [5]

Микроскопы с программируемой матрицей (PAM) используют пространственный модулятор света (SLM) с электронным управлением, который создает набор движущихся точечных отверстий. SLM - это устройство, содержащее массив пикселей с некоторыми свойствами ( непрозрачность , отражательная способность или оптическое вращение ) отдельных пикселей, которые можно регулировать электронным способом. SLM содержит микроэлектромеханические зеркала или жидкокристаллические компоненты. Изображение обычно получается камерой с зарядовой связью (ПЗС).

Каждый из этих классов конфокальных микроскопов имеет свои преимущества и недостатки. Большинство систем либо оптимизированы для скорости записи (например, захвата видео), либо для высокого пространственного разрешения. Конфокальные лазерные сканирующие микроскопы могут иметь программируемую плотность выборки и очень высокое разрешение, в то время как Nipkow и PAM используют фиксированную плотность выборки, определяемую разрешением камеры. Формирования изображения частота кадров , как правило , медленнее для одиночных точечных лазерных сканирующих систем , чем прядильные-диск или PAM систем. Коммерческие конфокальные микроскопы с вращающимся диском обеспечивают частоту кадров более 50 в секунду [6], что является желательной функцией для динамических наблюдений, таких как визуализация живых клеток.

На практике Nipkow и PAM позволяют сканировать несколько отверстий параллельно одной и той же области [7], если отверстия находятся на достаточно большом расстоянии друг от друга.

Передовые разработки конфокальной лазерной сканирующей микроскопии теперь позволяют получать изображения с более высокой, чем при стандартной скорости видео (60 кадров в секунду) изображениями, используя несколько микроэлектромеханических сканирующих зеркал.

Конфокальная рентгенофлуоресцентная визуализация - это новый метод, который позволяет контролировать глубину в дополнение к горизонтальному и вертикальному наведению, например, при анализе скрытых слоев на картине. [8]

Улучшение разрешения [ править ]

CLSM - это метод сканирования изображений, при котором полученное разрешение лучше всего объясняется путем сравнения его с другим методом сканирования, таким как сканирующий электронный микроскоп (SEM). CLSM имеет то преимущество, что не требует подвешивания зонда на несколько нанометров от поверхности, как, например, в AFM или STM , где изображение получается путем сканирования поверхности с помощью тонкого наконечника. Расстояние от линзы объектива до поверхности (так называемое рабочее расстояние ) обычно сравнимо с расстоянием в обычном оптическом микроскопе. Это зависит от оптической конструкции системы, но типичное рабочее расстояние составляет от сотен микрометров до нескольких миллиметров.

В CLSM образец освещается точечным лазерным источником, и каждый элемент объема связан с дискретной интенсивностью рассеяния или флуоресценции. Здесь размер сканируемого объема определяется размером пятна (близким к дифракционному пределу) оптической системы, поскольку изображение сканирующего лазера представляет собой не бесконечно маленькую точку, а трехмерную дифракционную картину. Размер этой дифракционной картины и определяемый ею фокусный объем контролируются числовой апертурой.линзы объектива системы и длины волны используемого лазера. Это можно рассматривать как классический предел разрешения обычных оптических микроскопов, использующих широкопольное освещение. Однако с помощью конфокальной микроскопии можно даже улучшить предел разрешения методов широкопольного освещения, поскольку конфокальная апертура может быть закрыта для устранения дифракционной картины более высоких порядков [ необходима цитата ] . Например, если диаметр крошечного отверстия установлен на 1 единицу Эйритогда только дифракционная картина первого порядка проходит через апертуру к детектору, в то время как более высокие порядки блокируются, что улучшает разрешение за счет небольшого уменьшения яркости. При флуоресцентных наблюдениях предел разрешения конфокальной микроскопии часто ограничивается отношением сигнал / шум.вызвано небольшим количеством фотонов, обычно доступных в флуоресцентной микроскопии. Компенсировать этот эффект можно, используя более чувствительные фотоприемники или увеличивая интенсивность точечного источника лазерного излучения. Увеличение интенсивности освещения лазером может привести к чрезмерному обесцвечиванию или другому повреждению исследуемого образца, особенно для экспериментов, в которых требуется сравнение яркости флуоресценции. При визуализации тканей с дифференциальной рефракцией, таких как губчатый мезофилл листьев растений или другие ткани, содержащие воздушное пространство, часто проявляются сферические аберрации, ухудшающие качество конфокального изображения. Однако такие аберрации можно значительно уменьшить, помещая образцы в оптически прозрачные нетоксичные перфторуглероды, такие как перфтордекалин., который легко проникает в ткани и имеет почти такой же показатель преломления, что и вода. [9]

Использует [ редактировать ]

CLSM широко используется во многих биологических научных дисциплин, от клеточной биологии и генетики в области микробиологии и биологии развития . [10] Он также используется в квантовой оптике, формировании изображений нанокристаллов и спектроскопии.

Биология и медицина [ править ]

Пример стопки изображений конфокального микроскопа, показывающих распределение актиновых филаментов по клетке.

Клинически CLSM используется для оценки различных заболеваний глаз и особенно полезен для визуализации, качественного анализа и количественного определения эндотелиальных клеток роговицы . [11] Он используется для локализации и идентификации присутствия нитчатых грибковых элементов в строме роговицы в случаях кератомикоза , что позволяет быстро диагностировать и, таким образом, раннее назначить окончательную терапию. Перспективными являются исследования методов CLSM для эндоскопических процедур ( эндомикроскопия ). [12]В фармацевтической промышленности рекомендовалось следить за процессом производства тонкопленочных фармацевтических форм, чтобы контролировать качество и равномерность распределения лекарств. [13] Конфокальная микроскопия также используется для изучения биопленок - сложных пористых структур, которые являются предпочтительной средой обитания микроорганизмов. Некоторые временные и пространственные функции биопленок можно понять, только изучив их структуру на микро- и мезомасштабах. Исследование на микроуровне необходимо для выявления активности и организации отдельных микроорганизмов. [14]

Оптика и кристаллография [ править ]

CLSM используется в качестве механизма поиска данных в некоторых трехмерных оптических системах хранения данных и помогла определить возраст папируса Магдалины .

Сохранение аудио [ править ]

Система IRENE использует конфокальную микроскопию для оптического сканирования и восстановления поврежденного исторического аудио. [15]

Варианты и улучшения [ править ]

Улучшение осевого разрешения [ править ]

Функция рассеяния точки для микроотверстия представляет собой эллипсоид, длина которого в несколько раз превышает его ширину. Это ограничивает осевое разрешение микроскопа. Одним из способов преодоления этого является микроскопия 4Pi, при которой падающий и / или испускаемый свет может мешать как сверху, так и снизу образца, чтобы уменьшить объем эллипсоида. Альтернативный метод - конфокальная тета-микроскопия . В этой технике конус освещающего света и обнаруживаемый свет расположены под углом друг к другу (лучший результат, когда они перпендикулярны). Пересечение двух функций рассеяния точки дает гораздо меньший эффективный объем выборки. На основе этого появился микроскоп с одноплоскостной подсветкой . Дополнительно деконволюцияможет использоваться с использованием экспериментально полученной функции рассеяния точки для удаления света не в фокусе, улучшая контраст как в осевой, так и в боковой плоскостях.

Супер разрешение [ править ]

Существуют конфокальные варианты, которые достигают разрешения ниже дифракционного предела, такие как микроскопия истощения с использованием стимулированного излучения (STED). Помимо этого метода , доступен широкий спектр других (не основанных на конфокальной основе) методов сверхвысокого разрешения , таких как PALM, (d) STORM, SIM и т. Д. Все они имеют свои преимущества, такие как простота использования, разрешение и необходимость в специальном оборудовании, буферах или флуорофорах.

Работоспособность при низких температурах [ править ]

Для получения изображений образцов при низких температурах использовались два основных подхода, основанные на архитектуре лазерной сканирующей конфокальной микроскопии . Один из подходов заключается в использовании криостата с непрерывным потоком : только образец имеет низкую температуру, и к нему оптически обращаются через прозрачное окно. [16] Другой возможный подход состоит в том, чтобы иметь часть оптики (особенно объектив микроскопа) в криогенном хранилище Дьюара . [17] Этот второй подход, хотя и более громоздкий, гарантирует лучшую механическую стабильность и позволяет избежать потерь из-за окна.

Изображения [ редактировать ]

  • β-тубулин у Tetrahymena (мерцательное простейшее ).

  • Частичный профиль поверхности монеты номиналом 1 евро, измеренный с помощью дискового конфокального микроскопа Нипкова.

  • Данные отражения для монеты номиналом 1 евро.

  • Цветное изображение актиновых филаментов в раковой клетке.

  • Зеленый сигнал от антитела к тубулину, конъюгированного с Alexa Fluor 488) и ядер (синий сигнал от ДНК, окрашенной DAPI) в клетках корневой меристемы 4-дневного возраста Arabidopsis thaliana (Col-0). Шкала шкалы: 5 мкм.

История [ править ]

Начало: 1940–1957 [ править ]

Схема из патентной заявки Мински, показывающая принцип работы конфокального сканирующего микроскопа, который он построил.

В 1940 году офтальмолог из Берна , Швейцария, Ганс Гольдманн разработал систему щелевой лампы для документирования результатов обследования глаз. [18] Эта система рассматривается некоторыми более поздними авторами как первая конфокальная оптическая система. [19] [20]

В 1943 году Зюн Коана опубликовал конфокальную систему. [21] [19] На рисунке в этой публикации показан путь конфокального передающего луча.

В 1951 году Хирото Наора, коллега Коаны, описал конфокальный микроскоп в журнале Science для спектрофотометрии . [22]

Первый конфокальный сканирующий микроскоп был построен Марвином Мински в 1955 году, а патент был подан в 1957 году. Сканирование точки освещения в фокальной плоскости осуществлялось перемещением предметного столика. Никаких научных публикаций представлено не было, и изображения, сделанные с их помощью, не сохранились. [23] [24]

Сканирующий тандемный микроскоп [ править ]

Схема тандемного сканирующего микроскопа Петра. Красная полоса добавлена ​​для обозначения Nipkow-Disk.

В 1960-х годах чехословацкий Моймир Петрад с медицинского факультета Карлова университета в Пльзене разработал тандемный сканирующий микроскоп - первый коммерческий конфокальный микроскоп. Он был продан небольшой компанией в Чехословакии и в США компанией Tracor-Northern (позже Noran) и использовал вращающийся диск Нипкова для создания множественных точечных отверстий возбуждения и излучения. [20] [25]

Чехословацкий патент был подан в 1966 году Петраем и Миланом Хадравски, чехословацкими коллегами. Первая научная публикация с данными и изображениями, полученными с помощью этого микроскопа, была опубликована в журнале Science в 1967 году под авторством М. Дэвида Эггера из Йельского университета и Петраша. [26] В качестве сноски к этой статье упоминается, что Петрад сконструировал микроскоп и руководил его конструкцией, и что он был отчасти «научным сотрудником» Йельского университета. Во второй публикации 1968 года описывалась теория и технические детали инструмента , а дополнительными авторами были Хадравски и Роберт Галамбос , глава группы в Йельском университете. [27] В 1970 году был получен патент США. Он был подан в 1967 году. [28]

1969: Первый конфокальный лазерный сканирующий микроскоп [ править ]

В 1969 и 1971 годах М. Дэвид Эггер и Пол Давидовиц из Йельского университета опубликовали две статьи, описывающие первый конфокальный лазерный сканирующий микроскоп. [29] [30]Это был точечный сканер, то есть генерировалось только одно пятно освещения. Он использовал микроскопию эпи-освещения-отражения для наблюдения за нервной тканью. Гелий-неоновый лазер мощностью 5 мВт с длиной волны 633 нм отражался полупрозрачным зеркалом в сторону объектива. Объектив представлял собой простую линзу с фокусным расстоянием 8,5 мм. В отличие от всех более ранних и более поздних систем, образец сканировался путем движения этой линзы (сканирование объектива), что приводило к перемещению фокальной точки. Отраженный свет возвращался к полупрозрачному зеркалу, прошедшая часть фокусировалась другой линзой на точечное отверстие детектирования, за которым помещалась трубка фотоумножителя. Сигнал визуализировался на ЭЛТ осциллографа, катодный луч перемещался одновременно с объективом. Специальное устройство позволило сделатьФотографии Polaroid , три из которых были показаны в публикации 1971 года.

Авторы размышляют о флуоресцентных красителях для исследований in vivo . Они цитируют патент Мински, благодарят Стива Бэра, в то время докторанта Медицинской школы Альберта Эйнштейна в Нью-Йорке, где он разработал конфокальный линейный сканирующий микроскоп [31], за предложение использовать лазер с «микроскопом Мински» и поблагодарить Галамбоса, Хадравского и Петра за обсуждения, приведшие к разработке их микроскопа. Мотивация для их разработки заключалась в том, что в тандемном сканирующем микроскопе только часть 10 -7 освещаемого света участвует в создании изображения в окуляре. Таким образом, качество изображения было недостаточным для большинства биологических исследований. [19][32]

1977–1985: Точечные сканеры с лазерами и сценическим сканированием [ править ]

В 1977 году Колин Дж. Р. Шеппард и Амарджиоти Чоудхури , Оксфорд , Великобритания, опубликовали теоретический анализ конфокальных и лазерных сканирующих микроскопов. [33] Вероятно, это первая публикация, в которой используется термин «конфокальный микроскоп». [19] [32]

В 1978 году братья Кристоф Кремер и Томас Кремер опубликовали проект конфокального лазерного сканирующего микроскопа, использующего флуоресцентное возбуждение с электронным автофокусом. Они также предложили лазерное точечное освещение с помощью «4π-точечной голограммы ». [32] [34] Эта конструкция CLSM впервые объединила метод лазерного сканирования с трехмерным обнаружением биологических объектов, помеченных флуоресцентными маркерами .

В 1978 и 1980 годах оксфордская группа Колина Шеппарда и Тони Уилсона описала конфокальный микроскоп с эпи-лазерным освещением, сканирующим столиком и фотоумножителями в качестве детекторов. Столик мог перемещаться по оптической оси (оси z), что позволяло производить оптические последовательные секции. [32]

В 1979 году Фред Бракенхофф и его коллеги продемонстрировали, что теоретические преимущества оптического секционирования и улучшения разрешения действительно достижимы на практике. В 1985 году эта группа стала первой, кто опубликовал убедительные изображения, полученные с помощью конфокального микроскопа, которые смогли ответить на биологические вопросы. [35] Вскоре после этого многие другие группы начали использовать конфокальную микроскопию для ответа на научные вопросы, которые до этого оставались загадкой из-за технологических ограничений.

В 1983 году Ай Джей Кокс и К. Шеппард из Оксфорда опубликовали первую работу, в которой конфокальный микроскоп управлялся компьютером. Первый коммерческий лазерный сканирующий микроскоп, столик-сканер SOM-25, был предложен Oxford Optoelectronics (после нескольких поглощений, приобретенных BioRad), начиная с 1982 года. Он был основан на дизайне оксфордской группы. [20] [36]

С 1985 года: лазерные точечные сканеры со сканированием луча [ править ]

В середине 1980-х Уильям Брэдшоу Амос и Джон Грэм Уайт и его коллеги, работающие в Лаборатории молекулярной биологии в Кембридже, создали первый сканирующий микроскоп с конфокальным лучом. [37] [38] Столик с образцом не двигался, вместо этого было пятно освещения, что позволяло получать изображения быстрее: четыре изображения в секунду по 512 строк в каждом. Сильно увеличенные промежуточные изображения благодаря длине пути луча 1-2 метра позволили использовать обычную ирисовую диафрагму.в виде «точечного отверстия» диаметром ~ 1 мм. Первые микрофотографии были сделаны с длительной экспозицией на пленке до того, как была добавлена ​​цифровая камера. Дальнейшее улучшение позволило впервые увеличить масштаб подготовки. Zeiss , Leitz и Cambridge Instruments не интересовались коммерческим производством. [39] Совет медицинских исследований (MRC) наконец спонсировал разработку прототипа. Дизайн был приобретен компанией Bio-Rad , изменен с помощью компьютерного управления и выпущен на рынок под названием «MRC 500». Преемник MRC 600 позже стал основой для разработки первого двухфотонно-флуоресцентного микроскопа, разработанного в 1990 году в Корнельском университете .[35]

Разработки в Королевском технологическом институте KTH в Стокгольме примерно в то же время привели к созданию коммерческого CLSM, распространяемого шведской компанией Sarastro. [40] Предприятие было приобретено в 1990 году компанией Molecular Dynamics [41], но в конечном итоге производство CLSM было прекращено. В Германии компания Heidelberg Instruments , основанная в 1984 году, разработала CLSM, которая изначально предназначалась для промышленных приложений, а не для биологии. Этот прибор был приобретен в 1990 году компанией Leica Lasertechnik . Компания Zeiss уже представила на рынке неконфокальный лазерный сканирующий микроскоп для определения летающего пятна, который был модернизирован до конфокального. Отчет 1990 г. [42]упомянул некоторых производителей конфокальных линз: Sarastro, Technical Instrument, Meridian Instruments, Bio-Rad, Leica, Tracor-Northern и Zeiss. [35]

В 1989 году Фриц Карл Прейкшат вместе с сыном Экхардом Прейкшатом изобрели сканирующий лазерный диодный микроскоп для анализа размеров частиц. [43] [44] Он и Экхард Прейкшат стали соучредителями Lasentec для его коммерциализации. В 2001 году Lasentec была приобретена Mettler Toledo . [45] Они используются в основном в фармацевтической промышленности для обеспечения контроля процесса кристаллизации на месте в больших системах очистки.

См. Также [ править ]

  • Спектроскопия модуляции заряда
  • Деконволюция
  • Флуоресцентный микроскоп
  • Сфокусированный ионный пучок
  • Наложение фокуса
  • Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия
  • Визуализация живых клеток
  • Объектив микроскопа
  • Предметное стекло микроскопа
  • Оптический микроскоп
  • Оптическое сечение
  • Фотоприемник
  • Функция разброса точки
  • Микроскоп истощения с вынужденным излучением
  • Микроскопия сверхвысокого разрешения
  • Флуоресцентный микроскоп полного внутреннего отражения (TIRF)
  • Микроскопия с двухфотонным возбуждением : хотя они используют родственную технологию (оба являются лазерными сканирующими микроскопами), многофотонные флуоресцентные микроскопы не являются строго конфокальными микроскопами. Термин конфокальный возникает из-за наличия диафрагмы в сопряженной фокальной плоскости (конфокальной). В многофотонных микроскопах эта диафрагма обычно отсутствует.

Ссылки [ править ]

  1. ^ a b Pawley JB (редактор) (2006). Справочник по биологической конфокальной микроскопии (3-е изд.). Берлин: Springer. ISBN 0-387-25921-X.CS1 maint: дополнительный текст: список авторов ( ссылка )
  2. ^ Поданный в 1957 году и получил 1961. США 3013467 
  3. Воспоминания об изобретении конфокального сканирующего микроскопа , Scanning 10 (1988), pp128–138.
  4. ^ a b Fellers TJ, Дэвидсон MW (2007). «Введение в конфокальную микроскопию» . Ресурсный центр Olympus Fluoview . Национальная лаборатория сильного магнитного поля . Проверено 25 июля 2007 .
  5. ^ "Аналитика для патента США № 5162941, конфокальный микроскоп" .
  6. ^ "Технические данные конфокального микроскопа белого света NanoFocus µsurf с вращающимся диском" . Архивировано из оригинала на 2014-01-20 . Проверено 14 августа 2013 .
  7. ^ "Технические данные сенсорной головки Sensofar 'PLu neox' Dual, объединяющей конфокальную и интерферометрическую методы, а также спектроскопическую рефлектометрию" .
  8. ^ Vincze L (2005). «Конфокальная рентгеновская флуоресцентная визуализация и рентгенофлуоресцентная томография для трехмерного микроанализа микроэлементов» . Микроскопия и микроанализ . 11 (Приложение 2). DOI : 10.1017 / S1431927605503167 .
  9. ^ Литтлджон, Джордж R .; Gouveia, João D .; Эднер, Кристоф; Смирнов, Николай; С любовью, Джон (2010). «Перфтордекалин повышает разрешение мезофилла Arabidopsis thaliana in vivo при конфокальной микроскопии». Новый фитолог . 186 (4): 1018–1025. DOI : 10.1111 / j.1469-8137.2010.03244.x . ЛВП : 10026,1 / 9344 . ISSN 1469-8137 . PMID 20374500 .  
  10. ^ Хуан Карлос Стокерт, Альфонсо Бласкес-Кастро (2017). "Глава 6 Флуоресцентные приборы и методы" . Флуоресцентная микроскопия в науках о жизни . Издательство Bentham Science. С. 180–184. ISBN 978-1-68108-519-7. Проверено 24 декабря 2017 года .
  11. Перейти ↑ Patel DV, McGhee CN (2007). «Современная конфокальная микроскопия in vivo роговицы живого человека с использованием белого света и методов лазерного сканирования: большой обзор». Clin. Экспериментируйте. Офтальмол . 35 (1): 71–88. DOI : 10.1111 / j.1442-9071.2007.01423.x . PMID 17300580 . S2CID 23029612 .  
  12. ^ Хоффман A, Гетц M, Вит M, Galle PR, Нейрат MF, Kiesslich R (2006). «Конфокальная лазерная эндомикроскопия: техническое состояние и текущие показания». Эндоскопия . 38 (12): 1275–83. DOI : 10,1055 / с-2006-944813 . PMID 17163333 . 
  13. ^ Le Person, S .; Пуиггали, младший; Барон, М .; Рокес, М. (1998). «Сушка в ближнем инфракрасном диапазоне фармацевтических тонких пленок: экспериментальный анализ внутреннего массопереноса». Химическая инженерия и переработка: интенсификация процессов . 37 (3): 257–263. DOI : 10.1016 / S0255-2701 (98) 00032-4 .
  14. ^ Гитис, Виталий; Ротенберг, Гади (2020). Гитис, Виталий; Ротенберг, Гади (ред.). Справочник по пористым материалам . Сингапур: World Scientific. С. 63–64. DOI : 10.1142 / 11909 . ISBN 978-981-122-322-8.
  15. ^ Процесс оцифровки . Проект IRENE, Калифорнийский университет, библиотеки Беркли .
  16. ^ Hirschfeld, V .; Хабнер, CG (2010). «Чувствительный и универсальный лазерный сканирующий конфокальный оптический микроскоп для флуоресценции одиночных молекул при 77 К». Обзор научных инструментов . 81 (11): 113705–113705–7. Bibcode : 2010RScI ... 81k3705H . DOI : 10.1063 / 1.3499260 . PMID 21133476 . 
  17. ^ Grazioso, F .; Паттон, Бразилия; Смит, JM (2010). «Конфокальный оптический микроскоп со сканирующим лучом высокой стабильности для работы при низких температурах». Обзор научных инструментов . 81 (9): 093705–4. Bibcode : 2010RScI ... 81i3705G . DOI : 10.1063 / 1.3484140 . PMID 20886985 . 
  18. Ганс Гольдманн (1939). "Spaltlampenphotographie und –photometrie". Ophthalmologica . 98 (5/6): 257–270. DOI : 10.1159 / 000299716 . Примечание: 98-й том относится к 1939 году, однако на первой странице статьи январь 1940 года указан как дата публикации.
  19. ^ a b c d Колин Дж. Р. Шеппард (3 ноября 2009 г.). «Конфокальная микроскопия. Развитие современной микроскопии». Визуализация и микроскопия .онлайн
  20. ^ a b c Барри Р. Мастерс: конфокальная микроскопия и микроскопия с многофотонным возбуждением. Генезис визуализации живых клеток. SPIE Press, Беллингем, Вашингтон, США, 2006 г., ISBN 978-0-8194-6118-6 , S. 120-121. 
  21. ^ Zyun Koana (1942). Журнал Института светотехники . 26 (8): 371–385. Отсутствует или пусто |title=( справка ) Статья размещена на сайте журнала . PDF-файл с пометкой «P359 - 402» имеет размер 19020 килобайт и содержит также соседние статьи из того же номера. На рисунке 1б статьи показана схема конфокального тракта прохождения луча.
  22. ^ Наора, Хирото (1951). «Микроспектрофотометрия и цитохимический анализ нуклеиновых кислот». Наука . 114 (2959): 279–280. Bibcode : 1951Sci ... 114..279N . DOI : 10.1126 / science.114.2959.279 . PMID 14866220 . 
  23. ^ Марвин Мински: Аппарат для микроскопии. Патент США 3.013.467 , подана 7 ноября 1957 г., выдана 19 декабря 1961 г.
  24. Марвин Мински (1988). «Воспоминания об изобретении конфокального сканирующего микроскопа». Сканирование . 10 (4): 128–138. DOI : 10.1002 / sca.4950100403 .
  25. ^ Гай Кокс: методы оптического изображения в клеточной биологии. 1. издание. CRC Press, Taylor & Francis Group, Бока-Ратон, Флорида, США, 2006 г., ISBN 0-8493-3919-7 , страницы 115-122. 
  26. ^ Egger MD, Petran M (июль 1967). «Новый микроскоп в отраженном свете для просмотра неокрашенных клеток головного мозга и ганглиев». Наука . 157 (786): 305–7. Bibcode : 1967Sci ... 157..305E . DOI : 10.1126 / science.157.3786.305 . PMID 6030094 . S2CID 180450 .  
  27. ^ MOJMÍR PETRÁŇ; МИЛАН АДРАВСКИЙ; М. ДЭВИД ЭГГЕР; РОБЕРТ ГАЛАМБОС (1968). "Сканирующий тандемный микроскоп в отраженном свете". Журнал Оптического общества Америки . 58 (5): 661–664. Bibcode : 1968JOSA ... 58..661P . DOI : 10.1364 / JOSA.58.000661 .
  28. ^ Моймир Петрад, Милан Хадравски: МЕТОД И МЕРОПРИЯТИЯ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ РАЗРЕШЕНИЯ, СИЛЫ И КОНТРАСТНОСТИ. онлайн в Google Patents, подана 4 ноября 1967 г., предоставлена ​​30 июня 1970 г.
  29. ^ Давидовиц, P .; Эггер, доктор медицины (1969). «Сканирующий лазерный микроскоп» . Природа . 223 (5208): 831. Bibcode : 1969Natur.223..831D . DOI : 10.1038 / 223831a0 . PMID 5799022 . S2CID 4161644 .  
  30. ^ Давидовиц, P .; Эггер, доктор медицины (1971). «Сканирующий лазерный микроскоп для биологических исследований». Прикладная оптика . 10 (7): 1615–1619. Bibcode : 1971ApOpt..10.1615D . DOI : 10,1364 / AO.10.001615 . PMID 20111173 . 
  31. ^ Барри Р. Мастерс: конфокальная микроскопия и микроскопия с многофотонным возбуждением. Генезис визуализации живых клеток. SPIE Press, Беллингем, Вашингтон, США, 2006 г., ISBN 978-0-8194-6118-6 , стр. 124-125. 
  32. ^ а б в г Шинья Иноуэ (2006). «Глава 1: Основы конфокального сканирования изображений в световой микроскопии». В Джеймсе Паули (ред.). Справочник по биологической конфокальной микроскопии (3-е изд.). ООО "Спрингер Сайенс энд Бизнес Медиа". стр.  1 -19. ISBN 978-0-387-25921-5.
  33. ^ Шеппард, CJR; Чоудхури, А. (1977). «Формирование изображения в сканирующем микроскопе». Optica Acta: Международный журнал оптики . 24 (10): 1051–1073. DOI : 10.1080 / 713819421 .
  34. ^ Cremer, C .; Кремер Т. (1978). «Соображения по поводу лазерного сканирующего микроскопа с высоким разрешением и глубиной резкости». Microscopica Acta . 81 : 31–44. PMID 713859 . 
  35. ^ а б в Амос, WB ; Белый, JG (2003). «Как конфокальный лазерный сканирующий микроскоп попал в биологические исследования» . Биология клетки . 95 (6): 335–342. DOI : 10.1016 / S0248-4900 (03) 00078-9 . PMID 14519550 . S2CID 34919506 .  
  36. ^ Кокс, Эй Джей; Шеппард, CJ (1983). «Сканирующий оптический микроскоп, включающий в себя цифровой каркас и микрокомпьютер». Прикладная оптика . 22 (10): 1474. Bibcode : 1983ApOpt..22.1474C . DOI : 10,1364 / ao.22.001474 . PMID 18195988 . 
  37. Перейти ↑ White, JG (1987). «Оценка конфокального по сравнению с традиционным отображением биологических структур с помощью флуоресцентной световой микроскопии» . Журнал клеточной биологии . 105 (1): 41–48. DOI : 10,1083 / jcb.105.1.41 . ISSN 0021-9525 . PMC 2114888 . PMID 3112165 .   
  38. Перейти ↑ Anon (2005). "Доктор Джон Уайт FRS" . royalsociety.org . Лондон: Королевское общество . Архивировано из оригинала на 2015-11-17.
  39. ^ Амос, WB; Белый, JG (2003). «Как конфокальный лазерный сканирующий микроскоп попал в биологические исследования» . Биология клетки . 95 (6): 335–342. DOI : 10.1016 / S0248-4900 (03) 00078-9 . PMID 14519550 . S2CID 34919506 .  
  40. ^ Карлссон, К .; Danielsson, PE; Lenz, R .; Liljeborg, A .; Majlöf, L .; Ослунд, Н. (1985). «Трехмерная микроскопия с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа». Письма об оптике . 10 (2): 53–55. Bibcode : 1985OptL ... 10 ... 53C . DOI : 10.1364 / OL.10.000053 . PMID 19724343 . 
  41. Брент Джонсон (1 февраля 1999 г.). «Образ - это все». Ученый . онлайн
  42. Диана Морган (23 июля 1990 г.). "Конфокальные микроскопы расширяют горизонты карьеры в области клеточной биологии". Ученый . онлайн
  43. ^ «Аппаратура и метод анализа частиц» .
  44. ^ «Аппаратура и метод анализа частиц» .
  45. ^ Все права защищены, Mettler-Toledo International Inc. «Анализ распределения частиц по размерам» . Архивировано из оригинала на 2016-10-09 . Проверено 6 октября 2016 .
  • Хоффман, Дэвид П .; Штенгель, Глеб; Xu, C. Shan; Кэмпбелл, Кирби Р .; Фриман, Мелани; Ван, Лэй; Милки, Дэниел Э .; Пазолли, Х. Амалия; Айер, Нирмала; Богович, Джон А .; Стейбли, Дэниел Р .; Ширинифард, Аббас; Пан, Песня; Пил, Дэвид; Шефер, Кэти; Pomp, Wim; Чанг, Чи-Лун; Липпинкотт-Шварц, Дженнифер; Кирххаузен, Том; Solecki, Дэвид Дж .; Бетциг, Эрик; Гесс, Харальд Ф. (2020). «Корреляционная трехмерная электронная микроскопия сверхвысокого разрешения и блочная микроскопия целых замороженных клеток стекловидного тела» . Наука . 367 (6475): eaaz5357. DOI : 10.1126 / science.aaz5357 . ISSN  0036-8075 . PMC  7339343 . PMID  31949053.

Внешние ссылки [ править ]

  • Виртуальный CLSM (на основе Java)
  • Анимации и пояснения к различным типам микроскопов, включая флуоресцентные и конфокальные микроскопы (Université Paris Sud)