Из Википедии, бесплатной энциклопедии
  (Перенаправлено с ДНК-лигазы I )
Перейти к навигации Перейти к поиску
ДНК-лигаза
DNA Repair.jpg
Художественная концепция ДНК-лигазы, восстанавливающей хромосомные повреждения
Идентификаторы
ЕС нет.6.5.1.1
№ CAS9015-85-4
Базы данных
IntEnzПросмотр IntEnz
BRENDABRENDA запись
ExPASyПросмотр NiceZyme
КЕГГЗапись в KEGG
MetaCycметаболический путь
ПРИАМпрофиль
Структуры PDB RCSB PDB PDBe PDBsum
Генная онтологияAmigo / QuickGO
Поиск
ЧВКстатьи
PubMedстатьи
NCBIбелки
лигаза I, ДНК, АТФ-зависимая
ДНК-лигаза.jpg
Идентификаторы
СимволLIG1
Ген NCBI3978
HGNC6598
OMIM126391
RefSeqNM_000234
UniProtP18858
Прочие данные
LocusChr. 19 [1]
Искать
СтруктурыШвейцарская модель
ДоменыИнтерПро
лигаза III, ДНК, АТФ-зависимая
Идентификаторы
СимволLIG3
Ген NCBI3980
HGNC6600
OMIM600940
RefSeqNM_002311
UniProtP49916
Прочие данные
LocusChr. 17 q11.2-q12
Искать
СтруктурыШвейцарская модель
ДоменыИнтерПро

ДНК-лигаза - это особый тип фермента, лигаза ( EC 6.5.1.1 ), который облегчает соединение цепей ДНК , катализируя образование фосфодиэфирной связи . Он играет роль в восстановлении одноцепочечных разрывов в дуплексной ДНК в живых организмах, но некоторые формы (например, ДНК-лигаза IV ) могут специфически восстанавливать двухцепочечные разрывы (т. Е. Разрыв в обеих комплементарных цепях ДНК). Одноцепочечные разрывы репарируются с помощью ДНК-лигазы с использованием комплементарной цепи двойной спирали в качестве матрицы [1], при этом ДНК-лигаза создает конечную фосфодиэфирную связь для полной репарации ДНК.

ДНК-лигаза используется как для репарации ДНК, так и для репликации ДНК (см. Лигазы млекопитающих ). Кроме того, ДНК-лигаза широко используется в лабораториях молекулярной биологии для экспериментов с рекомбинантной ДНК (см. Приложения для исследований ). Очищенная ДНК-лигаза используется при клонировании генов для соединения молекул ДНК с образованием рекомбинантной ДНК .

Ферментативный механизм [ править ]

Изображение демонстрирует, как лигаза (желтый овал) катализирует две цепи фрагментов ДНК. Лигаза соединяет два фрагмента ДНК с образованием более длинной цепи ДНК, «склеивая» их вместе.

Механизм ДНК-лигазы заключается в образовании двух ковалентных фосфодиэфирных связей между 3'-гидроксильными концами одного нуклеотида («акцептор») с 5'-фосфатным концом другого («донор»). На каждую образованную фосфодиэфирную связь расходуются две молекулы АТФ. АМФ необходим для лигазной реакции, которая проходит в четыре этапа:

  1. Реорганизация сайта активности, например, разрывов в сегментах ДНК или фрагментах Окадзаки и т. Д.
  2. Аденилилирование (добавление АМФ) остатка лизина в активном центре фермента, пирофосфат высвобождается;
  3. Перенос АМФ на 5 'фосфат так называемого донора, образование пирофосфатной связи;
  4. Образование фосфодиэфирной связи между 5'-фосфатом донора и 3'-гидроксилом акцептора. [2]
Наглядный пример того, как работает лигаза (с липкими концами )

Лигаза также работает с тупыми концами , хотя требуются более высокие концентрации фермента и другие условия реакции.

Типы [ править ]

E. coli [ править ]

E.coli , ДНК - лигазы кодируется Lig гена. ДНК-лигаза в E. coli , а также у большинства прокариот, использует энергию, полученную при расщеплении никотинамидадениндинуклеотида (НАД), для создания фосфодиэфирной связи. [3] Он не связывает ДНК с тупыми концами, за исключением условий молекулярного скучивания с полиэтиленгликолем , и не может эффективно соединять РНК с ДНК.

Активность ДНК-лигазы E. coli может быть усилена ДНК-полимеразой в нужных концентрациях. Улучшение работает только тогда, когда концентрации ДНК-полимеразы 1 намного ниже, чем у фрагментов ДНК, которые нужно лигировать. Повышение концентрации ДНК-полимераз Pol I отрицательно сказывается на ДНК-лигазе E. coli [4]

T4 [ править ]

ДНК-лигаза из бактериофага Т4 ( бактериофаг , поражающий бактерии Escherichia coli ). Лигаза Т4 наиболее часто используется в лабораторных исследованиях. [5] Он может лигировать либо когезионные, либо тупые концы ДНК, олигонуклеотиды, а также гибриды РНК и РНК-ДНК, но не однонитевые нуклеиновые кислоты. Он также может лигировать ДНК с тупыми концами с гораздо большей эффективностью, чем ДНК-лигаза E. coli . В отличие от ДНК-лигазы E. coli, ДНК-лигаза Т4 не может использовать НАД и абсолютно необходима АТФ в качестве кофактора. Некоторые инженерные разработки были сделаны для улучшения in vitroактивность ДНК-лигазы Т4; один успешный подход, например, тестировал ДНК-лигазу Т4, слитую с несколькими альтернативными ДНК-связывающими белками, и обнаружил, что конструкции с p50 или NF-kB в качестве партнеров слияния были более чем на 160% более активны при лигировании тупых концов для целей клонирования, чем конструкции дикого типа. ДНК-лигаза Т4. [6] Типичная реакция для вставки фрагмента в плазмидный вектор будет использовать от 0,01 (липкие концы) до 1 (тупые концы) единиц лигазы. Оптимальная температура инкубации для ДНК-лигазы Т4 составляет 16 ° C.

Бактериофаг Т4 лигазы мутанты обладают повышенной чувствительностью к обоим УФ - облучением [7] [8] и алкилирующего агента метилметансульфоната [9] , указывающий , что ДНК - лигазы используют в ремонте из повреждений ДНК , вызванных этими агентами.

Млекопитающее [ править ]

У млекопитающих существует четыре конкретных типа лигазы.

  1. ДНК-лигаза I : лигирует зарождающуюся ДНК отстающей цепи после того, как рибонуклеаза H удалила праймер РНК из фрагментов Окадзаки .
  2. ДНК-лигаза III : комплексы с белком репарации ДНК XRCC1, способствующие запечатыванию ДНК в процессе эксцизионной репарации нуклеотидов и рекомбинантных фрагментов. Из всех известных ДНК-лигаз млекопитающих только Lig III присутствует в митохондриях.
  3. ДНК-лигаза IV : комплексы с XRCC4 . Он катализирует заключительный этап пути репарации негомологичного соединения концов ДНК с двухцепочечным разрывом. Это также необходимо для рекомбинации V (D) J , процесса, который генерирует разнообразие в локусах иммуноглобулинов и Т-клеточных рецепторов во время развития иммунной системы .
  • ДНК-лигаза II: артефакт очистки, возникающий в результате протеолитической деградации ДНК-лигазы III. Первоначально она была признана еще одной ДНК-лигазой, и это причина необычной номенклатуры ДНК-лигаз. [10]

ДНК-лигаза эукариот и некоторых микробов использует аденозинтрифосфат (АТФ), а не НАД. [3]

Термостабильный [ править ]

Полученный из термофильных бактерий, фермент стабилен и активен при гораздо более высоких температурах, чем обычные ДНК-лигазы. Его период полураспада составляет 48 часов при 65 ° C и более 1 часа при 95 ° C. Было показано, что амплигаза ДНК-лигаза активна по крайней мере в течение 500 термических циклов (94 ° C / 80 ° C) или 16 часов цикла. 10  Эта исключительная термостабильность обеспечивает чрезвычайно высокую строгость гибридизации и специфичность лигирования. [11]

Измерение активности [ править ]

Для измерения активности ДНК-лигазы используются как минимум три различных единицы: [12]

  • Единица Вейсса - количество лигазы, которое катализирует обмен 1 нмоля 32 P из неорганического пирофосфата на АТФ за 20 минут при 37 ° C. Это наиболее часто используемая единица.
  • Единица Модрича-Лемана - используется редко, и одна единица определяется как количество фермента, необходимое для преобразования 100 нмолей d (AT) n в форму, устойчивую к экзонуклеазе-III, за 30 минут при стандартных условиях.
  • Многие коммерческие поставщики лигаз используют произвольную единицу, основанную на способности лигазы лигировать когезионные концы. Эти единицы часто более субъективны, чем количественные, и им не хватает точности.

Приложения для исследований [ править ]

Основная статья: Лигирование (молекулярная биология)

ДНК-лигазы стали незаменимыми инструментами в современных исследованиях молекулярной биологии для создания рекомбинантных последовательностей ДНК . Например, ДНК-лигазы используются с рестрикционными ферментами для вставки фрагментов ДНК, часто генов , в плазмиды .

Контроль оптимальной температуры является жизненно важным аспектом проведения эффективных экспериментов по рекомбинации, включающих лигирование фрагментов с когезионными концами. В большинстве экспериментов используется ДНК-лигаза Т4 (выделенная из бактериофага Т4 ), которая наиболее активна при 37 ° C. [13] Однако, для обеспечения оптимальной эффективности лигирования с липких составом фрагментами ( «липкие концами»), потребность температуры оптимального фермента должны быть сбалансирована с температурой плавления T м от липких концов быть лигирован, [14] гомологичны спаривания из липкие концы не будут стабильными, потому что высокая температура нарушает водородные связи. Реакция лигирования наиболее эффективна, когда липкие концы уже стабильно отожжены, и разрушение концов отжига, следовательно, приведет к низкой эффективности лигирования. Чем короче свес , тем меньше T м .

Поскольку фрагменты ДНК с тупыми концами не имеют когезионных концов для отжига, температура плавления не является фактором, который следует учитывать в пределах нормального температурного диапазона реакции лигирования. Ограничивающим фактором при лигировании тупых концов является не активность лигазы, а, скорее, количество выравниваний между концами фрагментов ДНК, которые происходят. Следовательно, наиболее эффективной температурой лигирования для ДНК с тупыми концами будет температура, при которой может происходить наибольшее количество выравниваний. Большинство перевязок с тупыми концами проводят при 14-25 ° C в течение ночи. Отсутствие стабильно отожженных концов также означает, что эффективность лигирования снижается, что требует использования более высокой концентрации лигазы. [14]

Новое использование ДНК-лигазы можно увидеть в области нанохимии, особенно в ДНК-оригами. Принципы самосборки, основанные на ДНК, доказали свою полезность для организации наноразмерных объектов, таких как биомолекулы, наномашины, наноэлектронные и фотонные компоненты. Сборка такой наноструктуры требует создания сложной сети молекул ДНК. Хотя самосборка ДНК возможна без какой-либо посторонней помощи с использованием различных субстратов, таких как обеспечение кататонической поверхности алюминиевой фольги, ДНК-лигаза может обеспечить ферментативную помощь, которая требуется для создания решетчатой ​​структуры ДНК из ДНК поверх подвешивания. [15]

История [ править ]

Первая ДНК-лигаза была очищена и охарактеризована в 1967 в лабораториях Геллерт, Леман, Ричардсон и Гурвиц. [16] Впервые он был очищен и охарактеризован Вейссом и Ричардсоном с использованием шестиступенчатого процесса хроматографического фракционирования, начинающегося с удаления остатков клеток и добавления стрептомицина, с последующими промывками колонки с диэтиламиноэтил (DEAE) целлюлозой и заключительным фракционированием фосфоцеллюлозы. Конечный экстракт содержал 10% активности, первоначально зарегистрированной в  среде E. coli  ; В ходе этого процесса было обнаружено, что АТФ и Mg ++ необходимы для оптимизации реакции. Обычные коммерчески доступные ДНК-лигазы были первоначально обнаружены у бактериофага T4 , E. coli и других.бактерии . [17]

Заболевания [ править ]

Генетические недостатки ДНК-лигаз человека были связаны с клиническими синдромами, характеризующимися иммунодефицитом, радиационной чувствительностью и аномалиями развития  [16]. Синдром LIG4 ( синдром лигазы IV) - редкое заболевание, связанное с мутациями в ДНК-лигазе 4 и препятствующее разрыву дцДНК. ремонтные механизмы. Синдром лигазы IV вызывает иммунодефицит у людей и обычно связан с микроцефалией и гипоплазией костного мозга. [18] Список распространенных заболеваний, вызванных отсутствием или неправильным функционированием ДНК-лигазы, выглядит следующим образом.

Пигментная ксеродермия [ править ]

Пигментная ксеродермия, широко известная как XP, является наследственным заболеванием, характеризующимся крайней чувствительностью к ультрафиолетовым (УФ) лучам солнечного света. Это заболевание чаще всего поражает глаза и участки кожи, подверженные воздействию солнца. У некоторых пораженных людей также есть проблемы, связанные с нервной системой. [19]

Атаксия-телеангиэктазия [ править ]

Мутации в гене ATM вызывают  атаксию-телеангиэктазию.. Ген ATM предоставляет инструкции по созданию белка, который помогает контролировать деление клеток и участвует в репарации ДНК. Этот белок играет важную роль в нормальном развитии и деятельности нескольких систем организма, включая нервную систему и иммунную систему. Белок ATM помогает клеткам распознавать поврежденные или разорванные цепи ДНК и координирует восстановление ДНК, активируя ферменты, которые фиксируют поврежденные цепи. Эффективное восстановление поврежденных цепей ДНК помогает поддерживать стабильность генетической информации клетки. У пораженных детей обычно возникают трудности с ходьбой, проблемы с равновесием и координацией рук, непроизвольные рывки (хорея), мышечные подергивания (миоклонус) и нарушения функции нервов (невропатия). Проблемы с движением обычно заставляют людей в подростковом возрасте нуждаться в помощи инвалидной коляски.Люди с этим расстройством также имеют невнятную речь и затрудняют движение глазами, чтобы смотреть из стороны в сторону (глазодвигательная апраксия).[20]

Анемия Фанкони [ править ]

Анемия Фанкони (FA) - редкое наследственное заболевание крови, которое приводит к недостаточности костного мозга. FA не позволяет костному мозгу производить достаточно новых клеток крови для нормальной работы организма. FA также может заставить костный мозг производить много дефектных клеток крови. Это может привести к серьезным проблемам со здоровьем, например к лейкемии . [21]

Синдром Блума [ править ]

Синдром Блума приводит к тому, что кожа становится чувствительной к солнечному свету, и обычно появляется пятно покрасневшей кожи в форме бабочки на носу и щеках. Кожная сыпь также может появиться на других участках, которые обычно подвергаются солнечному воздействию, например на тыльной стороне кистей рук и предплечьях. В сыпи часто появляются небольшие скопления расширенных кровеносных сосудов (телеангиэктазы); телеангиэктазии также могут возникать в глазах. Другие особенности кожи включают участки кожи, которые светлее или темнее, чем окружающие области (соответственно, гипопигментация или гиперпигментация). Эти пятна появляются на участках кожи, которые не подвергаются воздействию солнца, и их развитие не связано с высыпаниями.

В качестве мишени для наркотиков [ править ]

В недавних исследованиях человеческая ДНК-лигаза I использовалась в компьютерной разработке лекарств для идентификации ингибиторов ДНК-лигазы как возможных терапевтических агентов для лечения рака. [22] Поскольку чрезмерный рост клеток является признаком развития рака, таргетная химиотерапия, нарушающая функционирование ДНК-лигазы, может препятствовать адъювантным формам рака. Кроме того, было показано, что ДНК-лигазы можно в общих чертах разделить на две категории, а именно, АТФ- и НАД + -зависимые. Предыдущие исследования показали, что, хотя НАД + -зависимые ДНК-лигазы были обнаружены в спорадических клеточных или вирусных нишах за пределами бактериальной области жизни, нет ни одного случая, когда НАД + -зависимая лигаза присутствовала в эукариотических организмах.организм. Присутствие только у неэукариотических организмов, уникальной субстратной специфичности и отличительной доменной структуры НАД + -зависимых по сравнению с АТФ-зависимых ДНК-лигаз человека вместе делает НАД + -зависимые лигазы идеальными мишенями для разработки новых антибактериальных препаратов. [16]

См. Также [ править ]

  • Конец ДНК
  • Отстающая прядь
  • Репликация ДНК
  • Фрагмент Окадзаки
  • ДНК-полимераза
  • Секвенирование лигированием

Ссылки [ править ]

  1. ^ Паскаль JM, О'Брайен PJ, Томкинсон А.Е., Элленбергер Т (ноябрь 2004 г.). «Человеческая ДНК-лигаза I полностью окружает и частично раскручивает разорванную ДНК». Природа . 432 (7016): 473–8. Bibcode : 2004Natur.432..473P . DOI : 10,1038 / природа03082 . PMID  15565146 . S2CID  3105417 .
  2. ↑ Lehman IR (ноябрь 1974 г.). «ДНК-лигаза: структура, механизм и функции». Наука . 186 (4166): 790–7. Bibcode : 1974Sci ... 186..790L . DOI : 10.1126 / science.186.4166.790 . PMID 4377758 . S2CID 86549159 .  
  3. ^ a b Фостер JB, Slonczewski J (2010). Микробиология: развивающаяся наука (второе изд.). Нью-Йорк: WW Norton & Company. ISBN 978-0-393-93447-2.
  4. ^ Yang Y, LICATA VJ (февраль 2018). «ДНК-полимеразы Pol I стимулируют присоединение концов ДНК с помощью ДНК-лигазы Escherichia coli». Сообщения о биохимических и биофизических исследованиях . 497 (1): 13–18. DOI : 10.1016 / j.bbrc.2018.01.165 . PMID 29409896 . 
  5. ^ "Лигазы" (PDF) . Руководство по ресурсам ферментов . Корпорация Промега. С. 8–14.
  6. ^ Wilson RH, Morton SK, Deiderick H, Герт ML, Paul HA, Gerber I, Patel A, Ellington AD, Hunicke-Смит SP, Patrick WM (июль 2013). «Разработанные ДНК-лигазы с улучшенной активностью in vitro» . Белковая инженерия, дизайн и отбор . 26 (7): 471–8. DOI : 10,1093 / белок / gzt024 . PMID 23754529 . 
  7. ^ Baldy МВт (1968). «Ремонт и рекомбинация в фаге Т4. II. Гены, влияющие на чувствительность к УФ». Симпозиумы Колд-Спринг-Харбор по количественной биологии . 33 : 333–8. DOI : 10.1101 / sqb.1968.033.01.038 . PMID 4891973 . 
  8. ^ Baldy МВт (февраль 1970). «Чувствительность к УФ-излучению некоторых чувствительных к температуре мутантов фага Т4 с ранней функцией». Вирусология . 40 (2): 272–87. DOI : 10.1016 / 0042-6822 (70) 90403-4 . PMID 4909413 . 
  9. ^ Baldy МВт, Strom B, Бернштейн H (март 1971). «Ремонт алкилированной дезоксирибонуклеиновой кислоты бактериофага Т4 по механизму с участием полинуклеотидлигазы» . Журнал вирусологии . 7 (3): 407–8. DOI : 10,1128 / JVI.7.3.407-408.1971 . PMC 356131 . PMID 4927528 .  
  10. ^ Томкинсон, Алан Э; Саллмир, Аннахита (5 сентября 2013 г.). «Структура и функция ДНК-лигаз, кодируемых геном LIG3 млекопитающих» . Джин . 531 (2): 150–157. DOI : 10.1016 / j.gene.2013.08.061 . PMC 3881560 . PMID 24013086 .  
  11. ^ "Амплигаза - термостабильная ДНК-лигаза" . www.epibio.com . Проверено 15 мая 2017 .
  12. ^ Рассел DW, Sambrook J (2001). «Глава 1: Плазмиды и их полезность в молекулярном клонировании». Молекулярное клонирование: лабораторное руководство . 1 (3-е изд.). Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк: Лаборатория Колд-Спринг-Харбор. С. 1–159. ISBN 978-0-87969-577-4.
  13. ^ Baneyx F, G Lucotte (1993). Введение в методы молекулярного клонирования . Чичестер: Джон Уайли и сыновья. п. 156. ISBN. 978-0-471-18849-0.
  14. ^ a b Tabor S (май 2001 г.). «ДНК-лигазы». Текущие протоколы в молекулярной биологии . Глава 3: Раздел 3.14. DOI : 10.1002 / 0471142727.mb0314s08 . ISBN 978-0-471-14272-0. PMID  18265223 . S2CID  23944826 .
  15. ^ Bhanjadeo М.М., Найяк А.К., Subudhi U (2017). «Поверхностная самосборка ДНК: стратегия без ферментов к образованию разветвленной решетки ДНК». Сообщения о биохимических и биофизических исследованиях . 485 (2): 492–498. DOI : 10.1016 / j.bbrc.2017.02.024 . PMID 28189681 . 
  16. ^ a b c Шуман С (июнь 2009 г.). «ДНК-лигазы: успехи и перспективы» . Журнал биологической химии . 284 (26): 17365–9. DOI : 10.1074 / jbc.R900017200 . PMC 2719376 . PMID 19329793 .  
  17. ↑ Weiss B, Richardson CC (апрель 1967). «Ферментативный разрыв и присоединение дезоксирибонуклеиновой кислоты, I. Ремонт однонитевых разрывов в ДНК с помощью ферментной системы из Escherichia coli, инфицированной бактериофагом Т4» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 57 (4): 1021–8. Bibcode : 1967PNAS ... 57.1021W . DOI : 10.1073 / pnas.57.4.1021 . PMC 224649 . PMID 5340583 .  
  18. ^ Альтман T, Gennery AR (октябрь 2016). «Синдром ДНК-лигазы IV; обзор» . Журнал "Орфанет редких болезней" . 11 (1): 137. DOI : 10,1186 / s13023-016-0520-1 . PMC 5055698 . PMID 27717373 .  
  19. ^ "пигментная ксеродермия" . Домашний справочник по генетике . Проверено 15 мая 2017 .
  20. ^ «атаксия-телеангиэктазия» . Домашний справочник по генетике . Проверено 15 мая 2017 .
  21. ^ "Что такое анемия Фанкони?" . NHLBI, NIH . Проверено 15 мая 2017 .
  22. ^ Томкинсон А.Е., Хоуз TR, Вист NE (июнь 2013). «ДНК-лигазы как терапевтические мишени» . Трансляционные исследования рака . 2 (3). PMC 3819426 . PMID 24224145 .  

Внешние ссылки [ править ]

  • ДНК-лигаза: молекула месяца PDB
  • Общая информация о лигазе Davidson College
  • Протокол лигирования ДНК OpenWetWare
  • Обзор всей структурной информации, доступной в PDB для UniProt : P00970 (ДНК-лигаза) в PDBe-KB .
  • Обзор всей структурной информации, доступной в PDB для UniProt : P18858 (ДНК-лигаза 1) в PDBe-KB .
  • Обзор всей структурной информации, доступной в PDB для UniProt : P49916 (ДНК-лигаза 3) в PDBe-KB .