Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Часть серии по
Генетика
Гибридогенез в водных лягушках gametes.svg
 
Ключевые компоненты
История и темы
Исследование
Персонализированная медицина
Персонализированная медицина

Секвенирование ДНК - это процесс определения последовательности нуклеиновой кислоты - порядка нуклеотидов в ДНК . Он включает любой метод или технологию, которые используются для определения порядка четырех оснований: аденина , гуанина , цитозина и тимина . Появление методов быстрого секвенирования ДНК значительно ускорило биологические и медицинские исследования и открытия. [1] [2]

Знание последовательностей ДНК стало незаменимым для фундаментальных биологических исследований и во многих прикладных областях, таких как медицинская диагностика , биотехнология , судебная биология , вирусология и биологическая систематика . Сравнение здоровых и мутировавших последовательностей ДНК может диагностировать различные заболевания, включая различные виды рака, [3] охарактеризовать репертуар антител [4] и может использоваться для руководства лечением пациентов. [5] Наличие быстрого способа секвенирования ДНК позволяет оказывать более быструю и индивидуализированную медицинскую помощь, а также идентифицировать и каталогизировать большее количество организмов. [4]

Высокая скорость секвенирования, достигаемая с помощью современной технологии секвенирования ДНК, сыграла важную роль в секвенировании полных последовательностей ДНК или геномов многих типов и видов жизни, включая геном человека и другие полные последовательности ДНК многих животных, растений и микробов. разновидность.

Пример результатов автоматического секвенирования ДНК с обрывом цепи.

Первые последовательности ДНК были получены в начале 1970-х академическими исследователями трудоемкими методами, основанными на двумерной хроматографии . После разработки флуоресценции -На методов секвенирования с секвенсор ДНК , [6] секвенирование ДНК стало проще и порядков быстрее. [7]

Приложения [ править ]

Секвенирование ДНК может использоваться для определения последовательности отдельных генов , более крупных генетических областей (то есть кластеров генов или оперонов ), полных хромосом или полных геномов любого организма. Секвенирование ДНК также является наиболее эффективным способом непрямого секвенирования РНК или белков (через их открытые рамки считывания ). Фактически, секвенирование ДНК стало ключевой технологией во многих областях биологии и других наук, таких как медицина, судебная экспертиза и антропология .

Молекулярная биология [ править ]

Секвенирование используется в молекулярной биологии для изучения геномов и белков, которые они кодируют. Информация, полученная с помощью секвенирования, позволяет исследователям идентифицировать изменения в генах, ассоциации с заболеваниями и фенотипами, а также определять потенциальные мишени для лекарств.

Эволюционная биология [ править ]

Поскольку ДНК представляет собой информативную макромолекулу с точки зрения передачи от одного поколения к другому, секвенирование ДНК используется в эволюционной биологии для изучения взаимосвязи различных организмов и их эволюции.

Метагеномика [ править ]

Основная статья: Метагеномика

Область метагеномики включает идентификацию организмов, присутствующих в водоеме, сточных водах , грязи, отфильтрованном из воздуха мусоре или образцах мазков от организмов. Знание того, какие организмы присутствуют в конкретной среде, имеет решающее значение для исследований в области экологии , эпидемиологии , микробиологии и других областях. Секвенирование позволяет исследователям определить, например, какие типы микробов могут присутствовать в микробиоме .

Вирусология [ править ]

Основная статья: Вирусология

Поскольку большинство вирусов слишком малы, чтобы их можно было увидеть в световой микроскоп, секвенирование является одним из основных инструментов вирусологии для идентификации и изучения вируса. [8] Вирусные геномы могут быть основаны на ДНК или РНК. РНК-вирусы более чувствительны ко времени для секвенирования генома, поскольку они быстрее разлагаются в клинических образцах. [9] Традиционное секвенирование по Сэнгеру и секвенирование нового поколения используются для секвенирования вирусов в фундаментальных и клинических исследованиях, а также для диагностики возникающих вирусных инфекций, молекулярной эпидемиологии вирусных патогенов и тестирования лекарственной устойчивости. В GenBank более 2,3 миллиона уникальных вирусных последовательностей . [8]В последнее время NGS превзошел традиционный метод Сэнгера как самый популярный подход для создания вирусных геномов. [8]

Во время вспышки птичьего гриппа в 1990 году секвенирование вирусов определило, что подтип гриппа возник в результате пересортировки между перепелами и домашней птицей. Это привело к принятию в Гонконге закона , запрещающего совместную продажу живых перепелов и птицы на рынке. Секвенирование вирусов также можно использовать для оценки начала вирусной вспышки с помощью метода молекулярных часов . [9]

Медицина [ править ]

Медицинские техники могут секвенировать гены (или, теоретически, полные геномы) пациентов, чтобы определить, существует ли риск генетических заболеваний. Это форма генетического тестирования , хотя некоторые генетические тесты могут не включать секвенирование ДНК. Кроме того, секвенирование ДНК может быть полезно для определения конкретных бактерий, чтобы обеспечить более точное лечение антибиотиками , тем самым снижая риск создания устойчивости к противомикробным препаратам в популяциях бактерий. [10] [11] [12] [13] [14] [15]

Криминалистика [ править ]

Секвенирование ДНК может использоваться вместе с методами профилирования ДНК для судебно-медицинской идентификации [16] и установления отцовства . За последние несколько десятилетий тестирование ДНК претерпело огромные изменения, в конечном итоге связав отпечаток ДНК с тем, что находится под следствием. Образцы ДНК в отпечатках пальцев, слюне, волосяных фолликулах и т. Д. Уникально отделяют каждый живой организм от другого. Тестирование ДНК - это метод, который может обнаруживать определенные геномы в цепи ДНК для создания уникального и индивидуального рисунка.

Четыре канонических основы [ править ]

Основная статья: нуклеотид

Каноническая структура ДНК состоит из четырех оснований: тимина (Т), аденина (А), цитозина (С) и гуанина (G). Секвенирование ДНК - это определение физического порядка этих оснований в молекуле ДНК. Однако есть много других оснований, которые могут присутствовать в молекуле. В некоторых вирусах (в частности, бактериофаге ) цитозин может быть заменен гидроксиметилом или гидроксиметил цитозином глюкозы. [17] В ДНК млекопитающих могут быть обнаружены вариантные основания с метильными группами или фосфосульфатом. [18] [19] В зависимости от метода секвенирования конкретная модификация, например 5mC ( 5-метилцитозин) часто встречается у людей, может быть обнаружен или не обнаружен. [20]

История [ править ]

Открытие структуры и функции ДНК [ править ]

Дезоксирибонуклеиновая кислота ( ДНК ) была впервые обнаружена и выделена Фридрихом Мишером в 1869 году, но она оставалась недостаточно изученной в течение многих десятилетий, потому что считалось, что белки, а не ДНК, содержат генетический план жизни. Эта ситуация изменилась после 1944 года в результате некоторых экспериментов Освальда Эйвери , Колина Маклауда и Маклина Маккарти, продемонстрировавших, что очищенная ДНК может превращать один штамм бактерий в другой. Это был первый случай, когда ДНК была продемонстрирована способность трансформировать свойства клеток.

В 1953 году Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик предложили свою модель двойной спирали ДНК, основанную на кристаллизованных рентгеновских структурах, которые изучала Розалинд Франклин . Согласно модели, ДНК состоит из двух цепей нуклеотидов, намотанных друг на друга, связанных водородными связями и движущихся в противоположных направлениях. Каждая цепь состоит из четырех комплементарных нуклеотидов - аденина (A), цитозина (C), гуанина (G) и тимина (T) - с A на одной цепи всегда в паре с T на другой, а C всегда в паре с G. Они предположили, что такая структура позволяет использовать каждую нить для реконструкции другой, что является центральной идеей для передачи наследственной информации между поколениями.[21]

Фредерик Сэнджер , пионер секвенирования. Сэнгер - один из немногих ученых, удостоенных двух Нобелевских премий: одной за секвенирование белков , а другой - за секвенирование ДНК.

Основа для секвенирования белков была впервые заложена работой Фредерика Сенгера, который к 1955 году завершил последовательность всех аминокислот в инсулине., небольшой белок, секретируемый поджелудочной железой. Это стало первым убедительным доказательством того, что белки представляют собой химические образования с определенным молекулярным паттерном, а не случайную смесь веществ, взвешенных в жидкости. Успех Сэнгера в секвенировании инсулина вдохновил исследователей-рентгеновских кристаллографов, включая Уотсона и Крика, которые к настоящему времени пытались понять, как ДНК управляет образованием белков внутри клетки. Вскоре после посещения серии лекций, прочитанных Фредериком Сэнгером в октябре 1954 года, Крик начал развивать теорию, согласно которой расположение нуклеотидов в ДНК определяет последовательность аминокислот в белках, что, в свою очередь, помогает определить функцию белка. Он опубликовал эту теорию в 1958 г. [22]

Секвенирование РНК [ править ]

Секвенирование РНК было одной из самых ранних форм секвенирования нуклеотидов. Важнейшим ориентиром в секвенировании РНК является последовательность первого полного гена и полного генома бактериофага MS2 , идентифицированная и опубликованная Уолтером Файерсом и его сотрудниками из Гентского университета ( Гент , Бельгия ) в 1972 [23] и 1976 годах. [24] Традиционные методы секвенирования РНК требуют создания молекулы кДНК , которую необходимо секвенировать. [25]

Методы раннего секвенирования ДНК [ править ]

Первый метод определения последовательностей ДНК включал стратегию локализационного удлинения праймера, разработанную Рэем Ву из Корнельского университета в 1970 году. [26] Катализ ДНК-полимеразой и специфическое мечение нуклеотидов, оба из которых занимают видное место в современных схемах секвенирования, были использованы для секвенирования когезионные концы ДНК лямбда-фага. [27] [28] [29] Между 1970 и 1973 годами Ву, Р. Падманабхан и его коллеги продемонстрировали, что этот метод можно использовать для определения любой последовательности ДНК с использованием синтетических локально-специфичных праймеров. [30] [31] [32] Фредерик Сэнджерзатем принял эту стратегию праймера-расширения для разработки более быстрых методов секвенирования ДНК в то MRC Центр , Кембридж , Великобритания и опубликовал метод «секвенирование ДНК с ингибиторами цепи оконечной» в 1977 г. [33] Уолтер Гилберт и Аллан Максого в Гарварде также разработаны методы секвенирования, в том числе один для «секвенирования ДНК путем химической деградации». [34] [35] В 1973 году Гилберт и Максам сообщили о последовательности из 24 пар оснований, используя метод, известный как анализ блуждающих точек. [36] Успехам в секвенировании способствовало одновременное развитие рекомбинантной ДНК. технология, позволяющая изолировать образцы ДНК от источников, отличных от вирусов.

Секвенирование полных геномов [ править ]

5386 п.н. геном бактериофага φX174 . Каждый цветной блок представляет собой ген.

Первым полным ДНК-геномом, который был секвенирован, был геном бактериофага φX174 в 1977 году. [37] В 1984 году ученые Совета медицинских исследований расшифровали полную последовательность ДНК вируса Эпштейна-Барра , обнаружив, что он содержит 172 282 нуклеотида. Завершение последовательности ознаменовало собой важный поворотный момент в секвенировании ДНК, поскольку это было достигнуто без предварительного знания генетического профиля вируса. [38]

Нерадиоактивный метод переноса молекул ДНК из реакционных смесей секвенирования на иммобилизирующую матрицу во время электрофореза был разработан Гербертом Полом и его сотрудниками в начале 1980-х годов. [39] [40] Вслед за коммерциализацией секвенатора ДНК "Система прямого блоттинга-электрофореза GATC 1500" от GATC Biotech , который интенсивно использовался в рамках программы секвенирования генома ЕС, полная последовательность ДНК хромосома II дрожжей Saccharomyces cerevisiae . [41] Лаборатория Лероя Э. Гуда в Калифорнийском технологическом институте анонсировала первый полуавтоматический аппарат для секвенирования ДНК в 1986 году. [42]За этим последовал маркетинг первой полностью автоматизированной машины для секвенирования, ABI 370, компанией Applied Biosystems , в 1987 г. и разработка Dupont Genesis 2000 [43], в которой использовалась новая техника флуоресцентного мечения, позволяющая идентифицировать все четыре дидезоксинуклеотида на одной дорожке. К 1990 году Национальные институты здравоохранения США (NIH) начали крупномасштабные испытания секвенирования Mycoplasma capricolum , Escherichia coli , Caenorhabditis elegans и Saccharomyces cerevisiae по цене 0,75 доллара США за основу. Тем временем в Craig Venter началось секвенирование последовательностей кДНК человека , называемых тегами экспрессируемой последовательностилаборатории, попытка захватить кодирующую часть генома человека . [44] В 1995 году Вентер, Гамильтон Смит и его коллеги из Института геномных исследований (TIGR) опубликовали первый полный геном свободноживущего организма, бактерии Haemophilus influenzae . Круговая хромосома содержит 1830137 оснований, и ее публикация в журнале Science [45] ознаменовала собой первое опубликованное использование полногеномного секвенирования, устраняющее необходимость в первоначальных усилиях по картированию.

К 2001 году методы секвенирования с дробовиком были использованы для получения черновой последовательности генома человека. [46] [47]

Методы высокопроизводительного секвенирования (HTS) [ править ]

В середине и конце 1990-х годов было разработано несколько новых методов секвенирования ДНК, которые к 2000 году были реализованы в коммерческих секвенаторах ДНК . Вместе они назывались методами секвенирования «следующего поколения» или «второго поколения» (NGS) по порядку. чтобы отличить их от более ранних методов, включая секвенирование по Сэнгеру. В отличие от первого поколения секвенирования, технология NGS обычно характеризуется высокой масштабируемостью, что позволяет секвенировать весь геном сразу. Обычно это достигается путем фрагментации генома на мелкие кусочки, случайной выборки фрагмента и его секвенирования с использованием одной из множества технологий, таких как описанные ниже. Целый геном возможен, потому что несколько фрагментов секвенируются одновременно (что дает название «массово-параллельное» секвенирование) в автоматизированном процессе.

Технология NGS дала огромные возможности исследователям искать информацию о здоровье, антропологам - исследовать происхождение человека, и стала катализатором « персонализированной медицины»."движение. Однако это также открыло дверь к большему количеству ошибок. Существует множество программных инструментов для проведения вычислительного анализа данных NGS, каждый со своим собственным алгоритмом. Даже параметры в одном программном пакете могут изменить результат анализ. Кроме того, большой объем данных, полученных с помощью секвенирования ДНК, также потребовал разработки новых методов и программ для анализа последовательностей. Для решения этих проблем были предприняты несколько попыток разработки стандартов в области NGS, большинство из которых были Небольшие усилия, предпринимаемые отдельными лабораториями. Совсем недавно крупная организованная работа, финансируемая FDA, завершилась разработкой стандарта BioCompute .

26 октября 1990 года Роджер Цзян , Пепи Росс, Маргарет Фанесток и Аллан Дж. Джонстон подали патент, описывающий пошаговое («основание за основанием») секвенирование с помощью съемных 3'-блокаторов на массивах ДНК (блоты и отдельные молекулы ДНК). [48] В 1996 году Пол Нюрен и его ученик Мостафа Ронаги из Королевского технологического института в Стокгольме опубликовали свой метод пиросеквенирования . [49]

1 апреля 1997 г. Паскаль Майер и Лоран Фаринелли подали во Всемирную организацию интеллектуальной собственности патенты, описывающие секвенирование колоний ДНК. [50] приготовления образца ДНК и случайным образом поверхностно полимеразной цепной реакции (ПЦР) выстроив способы , описанные в этом патенте, в сочетании с Roger Tsien и др. В «базовой по-базе» метод секвенирования, теперь реализован в Illumina «S Секвенсоры генома Hi-Seq.

В 1998 году Фил Грин и Брент Юинг из Вашингтонского университета описали свой показатель качества phred для анализа данных секвенатора [51], знаковый метод анализа, получивший широкое распространение и до сих пор являющийся наиболее распространенным показателем для оценки точности секвенирования. Платформа. [52]

Lynx Therapeutics опубликовала и выпустила на рынок массовое параллельное секвенирование сигнатур (MPSS) в 2000 году. Этот метод включал в себя параллельную, опосредованную адаптером / лигированием технологию секвенирования на основе гранул и служил первым коммерчески доступным методом секвенирования «следующего поколения», хотя не Секвенаторы ДНК были проданы независимым лабораториям. [53]

Основные методы [ править ]

Секвенирование Максама-Гилберта [ править ]

Основная статья: секвенирование Максама-Гилберта

Аллан Максам и Уолтер Гилберт опубликовали метод секвенирования ДНК в 1977 году, основанный на химической модификации ДНК и последующем расщеплении по определенным основаниям. [34] Этот метод, также известный как химическое секвенирование, позволял использовать очищенные образцы двухцепочечной ДНК без дальнейшего клонирования. Использование радиоактивного мечения в этом методе и его техническая сложность препятствовали его широкому использованию после того, как методы Сэнгера были усовершенствованы.

Секвенирование Maxam-Gilbert требует радиоактивного мечения на одном 5'-конце ДНК и очистки фрагмента ДНК, который нужно секвенировать. Затем химическая обработка приводит к разрыву небольшого количества одного или двух из четырех нуклеотидных оснований в каждой из четырех реакций (G, A + G, C, C + T). Концентрация модифицирующих химикатов контролируется для введения в среднем одной модификации на молекулу ДНК. Таким образом, образуется серия меченых фрагментов от конца с радиоактивной меткой до первого «разрезанного» сайта в каждой молекуле. Фрагменты в четырех реакциях подвергают электрофорезу бок о бок в денатурирующих акриламидных гелях для разделения по размеру. Для визуализации фрагментов гель экспонируют на рентгеновской пленке для авторадиографии, получая серию темных полос, каждая из которых соответствует радиоактивно меченному фрагменту ДНК, из которых можно сделать вывод о последовательности.[34]

Методы завершения цепи [ править ]

Основная статья: секвенирование по Сэнгеру

Метод обрыва цепи, разработанный Фредериком Сэнгером и его сотрудниками в 1977 году, вскоре стал предпочтительным методом из-за его относительной простоты и надежности. [33] [54] При изобретении метод обрыва цепи использовал меньше токсичных химикатов и меньшее количество радиоактивности, чем метод Максама и Гилберта. Из-за своей сравнительной простоты метод Сэнгера вскоре был автоматизирован и стал методом, используемым в первом поколении секвенаторов ДНК .

Секвенирование по Сэнгеру - метод, который преобладал с 1980-х до середины 2000-х годов. За этот период были достигнуты большие успехи в таких технологиях, как флуоресцентное маркирование, капиллярный электрофорез и общая автоматизация. Эти разработки позволили значительно повысить эффективность секвенирования, что привело к снижению затрат. Метод Сэнгера в форме массового производства - это технология, позволившая получить первый геном человека в 2001 году, положив начало эпохе геномики . Однако позже в этом десятилетии на рынке появились радикально иные подходы, в результате чего стоимость генома снизилась со 100 миллионов долларов в 2001 году до 10 000 долларов в 2011 году [55].

Крупномасштабное секвенирование и De Novo секвенирование [ править ]

Геномная ДНК фрагментируется на случайные части и клонируется как бактериальная библиотека. ДНК из отдельных бактериальных клонов секвенируется, и последовательность собирается с использованием перекрывающихся участков ДНК. (Щелкните, чтобы развернуть)

Крупномасштабное секвенирование часто направлено на секвенирование очень длинных частей ДНК, таких как целые хромосомы , хотя крупномасштабное секвенирование также может использоваться для создания очень большого количества коротких последовательностей, таких как обнаруженные на фаговом дисплее . Для более длинных мишеней, таких как хромосомы, общие подходы состоят в разрезании (с помощью рестрикционных ферментов ) или разрезании (с помощью механических сил) больших фрагментов ДНК на более короткие фрагменты ДНК. Затем фрагментированную ДНК можно клонировать в ДНК-вектор и амплифицировать в бактериальном хозяине, таком как Escherichia coli . Короткие фрагменты ДНК, очищенные из отдельных бактериальных колоний, индивидуально секвенируются и собираются электронным способом.в одну длинную непрерывную последовательность. Исследования показали, что добавление этапа выбора размера для сбора фрагментов ДНК одинакового размера может повысить эффективность секвенирования и точность сборки генома. В этих исследованиях автоматическая калибровка оказалась более воспроизводимой и точной, чем ручная калибровка геля. [56] [57] [58]

Термин « секвенирование de novo » конкретно относится к методам, используемым для определения последовательности ДНК без ранее известной последовательности. De novo переводится с латыни как «с самого начала». Пробелы в собранной последовательности могут быть заполнены прогулкой праймера . Различные стратегии имеют разные компромиссы в скорости и точности; Методы дробовика часто используются для секвенирования больших геномов, но его сборка сложна и трудна, особенно с повторами последовательностей, часто вызывающими пробелы в сборке генома.

В большинстве подходов к секвенированию используется этап клонирования in vitro для амплификации отдельных молекул ДНК, поскольку их методы молекулярного обнаружения недостаточно чувствительны для секвенирования отдельных молекул. ПЦР эмульсии [59] изолирует отдельные молекулы ДНК вместе с покрытыми праймером шариками в водных каплях в масляной фазе. Затем с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) каждая гранула покрывается клональными копиями молекулы ДНК с последующей иммобилизацией для последующего секвенирования. ПЦР эмульсии используется в методах, разработанных Marguilis et al. (коммерциализируется 454 Life Sciences ), Shendure and Porreca et al. (также известное как « секвенирование полонии ») и секвенирование SOLiD (разработано Agencourt, позже Applied Biosystems , теперь Life Technologies ). [60] [61] [62] ПЦР эмульсии также используется в платформах GemCode и Chromium, разработанных 10x Genomics . [63]

Секвенирование дробовика [ править ]

Основная статья: последовательность использования дробовика

Секвенирование дробовиком - это метод секвенирования, разработанный для анализа последовательностей ДНК длиной более 1000 пар оснований, вплоть до целых хромосом. Этот метод требует, чтобы целевая ДНК была разбита на случайные фрагменты. После секвенирования отдельных фрагментов последовательности могут быть повторно собраны на основе их перекрывающихся областей. [64]

Высокопроизводительные методы [ править ]

Множественные фрагментированные считывания последовательностей должны быть собраны вместе на основе их перекрывающихся областей.

Высокопроизводительное секвенирование, которое включает методы секвенирования следующего поколения «короткое чтение» и «долгое считывание» третьего поколения, [nt 1] применяется к секвенированию экзома, секвенированию генома, повторному секвенированию генома, профилированию транскриптома ( RNA-Seq ), ДНК-белковые взаимодействия ( ChIP-секвенирование ) и характеристика эпигенома . [65] Повторное секвенирование необходимо, потому что геном одного особи вида не будет указывать на все вариации генома среди других особей того же вида.

Высокий спрос на дешевое секвенирование стимулировал развитие технологий секвенирования с высокой пропускной способностью, которые распараллеливают процесс секвенирования, создавая одновременно тысячи или миллионы последовательностей. [66] [67] [68] Технологии высокопроизводительного секвенирования предназначены для снижения стоимости секвенирования ДНК по сравнению с тем, что возможно с помощью стандартных методов определения терминатора красителя. [69] При секвенировании со сверхвысокой пропускной способностью до 500 000 операций секвенирования путем синтеза могут выполняться параллельно. [70] [71] [72] Такие технологии привели к способности секвенировать весь геном человека всего за один день. [73] По состоянию на 2019 год, корпоративными лидерами в разработке продуктов для высокопроизводительного секвенирования были компании Illumina , Qiagen и ThermoFisher Scientific . [73]

Сравнение высокопроизводительных методов секвенирования [74] [75]
МетодПрочитать длинуТочность (однократное чтение, а не консенсус)Чтений за прогонВремя на запускСтоимость на 1 миллиард баз (в долларах США)ПреимуществаНедостатки
Секвенирование одной молекулы в реальном времени (Pacific Biosciences)30 000 п.н. ( N50 );

максимальная длина чтения> 100 000 оснований [76] [77] [78]

87% точность считывания необработанных данных [79]4 000 000 на ячейку SMRT Sequel 2, 100–200 гигабаз [76] [80] [81]От 30 минут до 20 часов [76] [82]7,2–43,3 долл. СШАБыстрый. Обнаруживает 4 мкКл, 5 мкКл, 6 мА. [83]Умеренная пропускная способность. Оборудование может быть очень дорогим.
Ионный полупроводник (секвенирование ионного торрента)до 600 п.н. [84]99,6% [85]до 80 миллионов2 часа66,8–950 долларовМенее дорогое оборудование. Быстрый.Ошибки гомополимера.
Пиросеквенирование (454)700 п.н.99,9%1 миллион24 часа10 000 долл. СШАДлинный размер чтения. Быстрый.Прогоны дорогие. Ошибки гомополимера.
Секвенирование путем синтеза (Illumina)MiniSeq, NextSeq: 75–300 п.н .;

MiSeq: 50–600 п.н .;

HiSeq 2500: 50–500 п.н .;

HiSeq 3/4000: 50–300 пар оснований;

HiSeq X: 300 п.н.

99,9% (Phred30)MiniSeq / MiSeq: 1–25 миллионов;

NextSeq: 130-00 миллионов;

HiSeq 2500: 300 миллионов - 2 миллиарда;

HiSeq 3/4000 2,5 миллиарда;

HiSeq X: 3 миллиарда

От 1 до 11 дней, в зависимости от секвенсора и указанной длины чтения [86]От 5 до 150 долларовВозможность высокого выхода секвенирования в зависимости от модели секвенатора и желаемого применения.Оборудование может быть очень дорогим. Требуется высокая концентрация ДНК.
Комбинаторный синтез якоря зонда (cPAS-BGI / MGI)BGISEQ-50: 35-50 бп;

MGISEQ 200: 50-200 бп;

BGISEQ-500, MGISEQ-2000: 50-300 б.п. [87]

99,9% (Phred30)БГИСЭК-50: 160М;

MGISEQ 200: 300M;

BGISEQ-500: 1300M на проточную кювету;

MGISEQ-2000: проточная кювета FCS 375M, проточная кювета FCL 1500M на каждую проточную кювету.

От 1 до 9 дней в зависимости от прибора, длины считывания и количества одновременных запусков проточных кювет.5–120 долларов
Секвенирование лигированием (SOLiD-секвенирование)50 + 35 или 50 + 50 б.п.99,9%От 1,2 до 1,4 миллиарда1-2 недели60–130 долларов СШАНизкая стоимость базы.Медленнее, чем другие методы. Имеет проблемы с последовательностью палиндромных последовательностей. [88]
Секвенирование нанопорВ зависимости от подготовки библиотеки, а не от устройства, пользователь выбирает длину чтения (сообщается до 2 272 580 п.н. [89] ).~ 92–97% однократного чтениязависит от длины чтения, выбранной пользователемданные передаются в режиме реального времени. Выберите от 1 минуты до 48 часов7–100 долларов СШАСамый длинный человек читает. Доступное сообщество пользователей. Портативный (размером с ладонь).Более низкая пропускная способность, чем у других машин, точность однократного считывания за 90 секунд
Секвенирование GenapSysОколо 150 п.н. односторонний99,9% (Phred30)От 1 до 16 миллионовОколо 24 часов667 долл. СШАНизкая стоимость инструмента (10 000 $)
Обрыв цепи (секвенирование по Сэнгеру)От 400 до 900 п.н.99,9%Нет данныхОт 20 минут до 3 часов2 400 000 долл. СШАПолезно для многих приложений.Более дорогой и непрактичный для больших проектов секвенирования. Этот метод также требует трудоемкого этапа клонирования плазмиды или ПЦР.

Долговременные методы секвенирования [ править ]

Дополнительная информация: долгосрочное секвенирование

Секвенирование одиночных молекул в реальном времени (SMRT) [ править ]

Основная статья: Секвенирование одной молекулы в реальном времени

Секвенирование SMRT основано на методе секвенирования путем синтеза. ДНК синтезируется в волноводах нулевой моды (ZMW) - небольших хорошо похожих на сосуды контейнерах с инструментами для улавливания, расположенными на дне скважины. Секвенирование выполняется с использованием немодифицированной полимеразы (прикрепленной к основанию ZMW) и флуоресцентно меченных нуклеотидов, свободно протекающих в растворе. Лунки сконструированы таким образом, что регистрируется только флуоресценция, возникающая на дне лунки. Флуоресцентная метка отделяется от нуклеотида при его включении в цепь ДНК, оставляя немодифицированную цепь ДНК. Согласно Pacific Biosciences(PacBio), разработчик технологии SMRT, эта методология позволяет обнаруживать модификации нуклеотидов (например, метилирование цитозина). Это происходит благодаря наблюдению за кинетикой полимеразы. Этот подход позволяет считывать 20 000 нуклеотидов и более при средней длине считывания 5 килобаз. [80] [90] В 2015 году компания Pacific Biosciences объявила о запуске нового инструмента для секвенирования под названием Sequel System с 1 миллионом ZMW по сравнению с 150 000 ZMW в инструменте PacBio RS II. [91] [92] SMRT-секвенирование называется секвенированием « третьего поколения » или «долгим чтением».

Секвенирование ДНК нанопор [ править ]

Основная статья: Секвенирование нанопор

ДНК, проходящая через нанопору, изменяет свой ионный ток. Это изменение зависит от формы, размера и длины последовательности ДНК. Каждый тип нуклеотида блокирует поток ионов через пору на разный период времени. Метод не требует модифицированных нуклеотидов и выполняется в режиме реального времени. Секвенирование нанопор упоминается как секвенирование « третьего поколения » или «долгое чтение», наряду с секвенированием SMRT.

Ранние промышленные исследования этого метода были основаны на методе, называемом «секвенирование экзонуклеаз», при котором считывание электрических сигналов происходило по мере того, как нуклеотиды проходили через поры альфа (α) -гемолизина, ковалентно связанные с циклодекстрином . [93] Однако последующий коммерческий метод, «секвенирование цепи», секвенировал основания ДНК в интактной цепи.

Двумя основными направлениями развития секвенирования нанопор являются твердотельное секвенирование нанопор и секвенирование нанопор на основе белков. При секвенировании белковых нанопор используются мембранные белковые комплексы, такие как α-гемолизин, MspA ( Mycobacterium smegmatis Porin A) или CssG, которые демонстрируют большие перспективы, учитывая их способность различать отдельные нуклеотиды и группы. [94] Напротив, в твердотельном секвенировании нанопор используются синтетические материалы, такие как нитрид кремния и оксид алюминия, и это предпочтительнее из-за их превосходных механических свойств, термической и химической стабильности. [95] Метод изготовления важен для этого типа секвенирования, учитывая, что массив нанопор может содержать сотни пор с диаметром менее восьми нанометров.[94]

Эта концепция возникла из идеи, что одноцепочечные молекулы ДНК или РНК могут быть электрофоретически возбуждены в строгой линейной последовательности через биологическую пору, которая может быть меньше восьми нанометров, и может быть обнаружена при условии, что молекулы выделяют ионный ток при движении через поры. Пора содержит область обнаружения, способную распознавать разные основания, при этом каждая база генерирует различные временные сигналы, соответствующие последовательности оснований, когда они пересекают пору, которые затем оцениваются. [95] Точный контроль над транспортом ДНК через поры имеет решающее значение для успеха. Различные ферменты, такие как экзонуклеазы и полимеразы, были использованы для смягчения этого процесса, располагая их возле входа в поры. [96]

Краткосрочные методы секвенирования [ редактировать ]

Дополнительная информация: короткое чтение последовательности

Массивно-параллельная последовательность подписей (MPSS) [ править ]

Первая из технологий высокопроизводительного секвенирования, массово-параллельное секвенирование сигнатур (или MPSS), была разработана в 1990-х годах в Lynx Therapeutics, компании, основанной в 1992 году Сидни Бреннером и Сэмом Элетром . MPSS был методом на основе шариков, который использовал комплексный подход лигирования адаптера с последующим декодированием адаптера, считывая последовательность с шагом в четыре нуклеотида. Этот метод сделал его чувствительным к систематическому смещению или потере конкретных последовательностей. Поскольку технология была настолько сложной, MPSS выполнялась только «внутри компании» Lynx Therapeutics, и никакие машины для секвенирования ДНК не продавались независимым лабораториям. Lynx Therapeutics объединилась с Solexa (позже приобретена Illumina) в 2004 году, что привело к развитию секвенирования путем синтеза, более простого подхода, приобретенного у Manteia Predictive Medicine , что сделало MPSS устаревшим. Однако основные свойства вывода MPSS были типичными для более поздних типов данных с высокой пропускной способностью, включая сотни тысяч коротких последовательностей ДНК. В случае MPSS их обычно использовали для секвенирования кДНК для измерения уровней экспрессии генов . [53]

Секвенирование полонии [ править ]

Основная статья: Секвенирование полонии

Полоните-секвенирование метод, разработанные в лаборатории Джордж М. Церкви Гарвардского университета, была одним из первых высоких пропускной способности систем секвенирования , и была использована для последовательности полного E.coli , геном в 2005 году [97] Это в сочетании в пробирке paired- tag библиотеки с эмульсионной ПЦР, автоматизированным микроскопом и химией секвенирования на основе лигирования для секвенирования генома E. coli с точностью> 99,9999% и стоимостью примерно 1/9 от секвенирования по Сэнгеру. [97] Лицензия на технологию была передана Agencourt Biosciences, впоследствии была выделена в Agencourt Personal Genomics и в конечном итоге включена в Applied Biosystems.Платформа SOLiD. Позднее Applied Biosystems была приобретена компанией Life Technologies , которая теперь является частью Thermo Fisher Scientific .

454 пиросеквенирование [ править ]

Основная статья: 454 Науки о жизни § Технологии

Распараллеленная версия пиросеквенирования была разработана компанией 454 Life Sciences , которая с тех пор была приобретена компанией Roche Diagnostics . В этом методе амплифицируется ДНК внутри капель воды в масляном растворе (эмульсионная ПЦР), при этом каждая капля содержит одну матрицу ДНК, прикрепленную к одной покрытой праймером бусине, которая затем образует клональную колонию. Машина для секвенирования содержит множество пиколитровых лунок, каждая из которых содержит одну гранулу и ферменты секвенирования. Пиросеквенирование использует люциферазу для генерации света для обнаружения отдельных нуклеотидов, добавленных к растущей ДНК, а объединенные данные используются для генерации считываний последовательностей . [60]Эта технология обеспечивает промежуточную длину чтения и цену за базу по сравнению с секвенированием по Сэнгеру с одной стороны и Solexa и SOLiD с другой. [69]

Секвенирование Illumina (Solexa) [ править ]

Основная статья: Секвенирование красителя Illumina

Solexa , теперь часть Illumina , была основана Шанкаром Баласубраманианом и Дэвидом Кленерманом в 1998 году и разработала метод секвенирования, основанный на технологии обратимых терминаторов красителей и инженерных полимераз. [98] Концепция обратимой терминированной химии была изобретена Бруно Канардом и Саймоном Сарфати в Институте Пастера в Париже. [99] [100] Он был разработан внутри компании Solexa лицами, указанными в соответствующих патентах. В 2004 году Solexa приобрела компанию Manteia Predictive Medicine , чтобы получить технологию массового параллельного секвенирования, изобретенную в 1997 году Паскалем Майером и Лораном Фаринелли. [50]Он основан на «кластерах ДНК» или «колониях ДНК», который включает клональную амплификацию ДНК на поверхности. Кластерная технология была приобретена совместно с Lynx Therapeutics of California. Позже Solexa Ltd. объединилась с Lynx и образовала Solexa Inc.

Секвенсор Illumina HiSeq 2500
Проточная кювета Illumina NovaSeq 6000

В этом методе молекулы ДНК и праймеры сначала прикрепляются к предметному стеклу или проточной кювете и амплифицируются с помощью полимеразы, так что образуются локальные клональные колонии ДНК, позже названные «кластерами ДНК». Для определения последовательности добавляют четыре типа оснований обратимых терминаторов (RT-основания) и смывают невключенные нуклеотиды. Камера делает изображения флуоресцентно меченных нуклеотидов. Затем краситель вместе с концевым 3'-блокатором химически удаляется из ДНК, позволяя начать следующий цикл. В отличие от пиросеквенирования, цепи ДНК удлиняются на один нуклеотид за раз, и получение изображения может выполняться с задержкой, что позволяет захватывать очень большие массивы колоний ДНК с помощью последовательных изображений, полученных с одной камеры.

Секвенсор Illumina MiSeq

Разделение ферментативной реакции и захвата изображения обеспечивает оптимальную производительность и теоретически неограниченную емкость секвенирования. Таким образом, при оптимальной конфигурации максимально достижимая производительность инструмента определяется исключительно коэффициентом аналого-цифрового преобразования камеры, умноженным на количество камер и разделенным на количество пикселей на колонию ДНК, необходимое для их оптимальной визуализации (приблизительно 10 пикселей / колония). В 2012 году с камерами, работающими с частотой аналого-цифрового преобразования более 10 МГц, и доступной оптикой, жидкостями и ферментами, пропускная способность может быть кратной 1 миллиону нуклеотидов в секунду, что примерно соответствует 1 эквиваленту генома человека при 1x покрытии.в час на инструмент, и 1 геном человека повторно секвенировали (примерно с 30-кратным увеличением) в день на каждый инструмент (оборудованный единственной камерой). [101]

Комбинаторный синтез якоря зонда (cPAS) [ править ]

Этот метод является усовершенствованной модификацией технологии лигирования якоря комбинаторного зонда (cPAL), описанной Complete Genomics [102], которая с тех пор стала частью китайской геномной компании BGI в 2013 году. [103] Обе компании усовершенствовали технологию, чтобы обеспечить более длительное считывание. продолжительность, сокращение времени реакции и более быстрое получение результатов. Кроме того, данные теперь генерируются как непрерывные полноразмерные чтения в стандартном формате файла FASTQ и могут использоваться как есть в большинстве конвейеров биоинформатического анализа на основе короткого чтения. [104] [ необходима ссылка ]

Две технологии, которые составляют основу этой высокопроизводительной технологии секвенирования, - это наношарики ДНК (DNB) и структурированные массивы для прикрепления наношаров к твердой поверхности. [102]ДНК-наношарики просто формируются путем денатурирования двухцепочечных библиотек с лигированием адаптеров и лигирования прямой цепи только со шпоночным олигонуклеотидом с образованием круга оцДНК. Достоверные копии кругов, содержащих вставку ДНК, производятся с использованием амплификации вращающегося круга, которая генерирует примерно 300–500 копий. Длинная цепь оцДНК складывается сама по себе, образуя трехмерную структуру наношара, которая имеет диаметр примерно 220 нм. Создание DNB заменяет необходимость создания ПЦР-копий библиотеки на проточной кювете и, как таковое, может удалить большую часть повторяющихся считываний, лигирования адаптер-адаптер и ошибок, вызванных ПЦР. [104] [ необходима ссылка ]

Секвенсор BGI MGISEQ-2000RS

Узорчатый массив положительно заряженных пятен создается с помощью методов фотолитографии и травления с последующей химической модификацией для создания проточной ячейки секвенирования. Каждое пятно на проточной кювете имеет диаметр примерно 250 нм, разделено 700 нм (от центра к центру) и позволяет легко прикрепить один отрицательно заряженный DNB к проточной кювете и, таким образом, уменьшить скопление или чрезмерную кластеризацию на проточной кювете. [102] [ необходима ссылка ]

Затем выполняется секвенирование путем добавления олигонуклеотидного зонда, который присоединяется в комбинации к определенным сайтам внутри DNB. Зонд действует как якорь, который затем позволяет одному из четырех одиночных обратимо инактивированных меченых нуклеотидов связываться после прохождения через проточную кювету. Несвязанные нуклеотиды вымываются перед лазерным возбуждением прикрепленных меток, затем излучают флуоресценцию, и сигнал улавливается камерами, который преобразуется в цифровой выход для определения основания. Присоединенное основание имеет свой терминатор и метку, химически расщепленную по завершении цикла. Цикл повторяется с другим потоком свободных меченых нуклеотидов через проточную ячейку, чтобы позволить следующему нуклеотиду связываться и улавливать его сигнал.Этот процесс выполняется несколько раз (обычно от 50 до 300 раз) для определения последовательности вставленного фрагмента ДНК со скоростью примерно 40 миллионов нуклеотидов в секунду по состоянию на 2018 год.[ необходима цитата ]

SOLiD секвенирование [ править ]

Подготовка библиотеки для платформы SOLiD
Основная статья: ABI Solid Sequencing
Двухбазовая схема кодирования. При двухбазовом кодировании каждой уникальной паре оснований на 3'-конце зонда назначается один из четырех возможных цветов. Например, «AA» назначается синему, «AC» - зеленому и так далее для всех 16 уникальных пар. Во время секвенирования каждая база в шаблоне секвенируется дважды, и полученные данные декодируются по этой схеме.

Технология SOLiD от Applied Biosystems (теперь это бренд Life Technologies ) использует секвенирование путем лигирования . Здесь пул всех возможных олигонуклеотидов фиксированной длины помечен в соответствии с положением в последовательности. Олигонуклеотиды отжигаются и лигируются; предпочтительное лигирование ДНК-лигазой для сопоставления последовательностей приводит к сигналу, информативному о нуклеотиде в этом положении. Каждая база в шаблоне дважды упорядочивается, и полученные данные декодируются в соответствии со схемой кодирования с двумя базами , используемой в этом методе. Перед секвенированием ДНК амплифицируют с помощью эмульсионной ПЦР. Полученные шарики, каждая из которых содержит отдельные копии одной и той же молекулы ДНК, помещают на предметное стекло. [105]В результате получаются последовательности количества и длины, сопоставимые с секвенированием Illumina. [69] Сообщается, что это секвенирование методом лигирования имеет некоторые проблемы с секвенированием палиндромных последовательностей. [88]

Секвенирование полупроводников Ion Torrent [ править ]

Основная статья: Ионно-полупроводниковое секвенирование

Компания Ion Torrent Systems Inc. (теперь принадлежит Life Technologies ) разработала систему, основанную на использовании стандартной химии секвенирования, но с новой системой обнаружения на основе полупроводников. Этот метод секвенирования основан на обнаружении ионов водорода , которые выделяются во время полимеризации в ДНК , в отличие от оптических методов , используемых в других системах секвенирования. Микролунка, содержащая цепь ДНК-матрицы, подлежащую секвенированию, заполняется одним типом нуклеотида . Если введенный нуклеотид комплементаренк ведущему нуклеотиду матрицы он включается в растущую комплементарную цепь. Это вызывает высвобождение иона водорода, который запускает сверхчувствительный ионный датчик, что указывает на то, что произошла реакция. Если в матричной последовательности присутствуют гомополимерные повторы, несколько нуклеотидов будут включены в один цикл. Это приводит к соответствующему количеству высвобождаемых водородов и пропорционально более высокому электронному сигналу. [106]

Секвенирование шаблона TAGGCT с помощью IonTorrent, PacBioRS и GridION

Секвенирование наношаров ДНК [ править ]

Основная статья: секвенирование наношаров ДНК

Секвенирование наношаров ДНК - это тип высокопроизводительной технологии секвенирования, используемой для определения всей геномной последовательности организма. Компания Complete Genomics использует эту технологию для секвенирования образцов, представленных независимыми исследователями. В этом методе используется репликация по вращающемуся кругу для амплификации небольших фрагментов геномной ДНК в наношарики ДНК. Затем для определения нуклеотидной последовательности используется свободное секвенирование путем лигирования. [107] Этот метод секвенирования ДНК позволяет большое количество ДНК nanoballs быть секвенировано в перспективу и при низких реагентных затратах по сравнению с другими высокими пропускной секвенированией платформ. [108]Однако из каждого наношара ДНК определяются только короткие последовательности ДНК, что затрудняет сопоставление коротких считываний с эталонным геномом . [107] Эта технология использовалась в нескольких проектах по секвенированию генома, и ее планируется использовать в других целях. [109]

Секвенирование одной молекулы с помощью Heliscope [ править ]

Основная статья: флуоресцентное секвенирование одной молекулы Helicos

Секвенирование с помощью Heliscope - это метод секвенирования отдельных молекул, разработанный Helicos Biosciences . Он использует фрагменты ДНК с добавленными адаптерами хвоста поли-А, которые прикреплены к поверхности проточной ячейки. Следующие шаги включают основанное на расширении секвенирование с циклической промывкой проточной кюветы флуоресцентно меченными нуклеотидами (по одному типу нуклеотидов за раз, как в методе Сенгера). Считывание выполняется секвенсором Heliscope. [110] [111] Чтения короткие, в среднем 35 п.н. [112] Что сделало эту технологию особенно новой, так это то, что она была первой в своем классе, которая секвенировала неамплифицированную ДНК, тем самым предотвращая любые ошибки чтения, связанные с этапами амплификации. [113]В 2009 году геном человека был секвенирован с помощью Heliscope, однако в 2012 году компания обанкротилась. [114]

Микрожидкостные системы [ править ]

Есть две основные микрофлюидные системы, которые используются для секвенирования ДНК; капельная микрофлюидика и цифровая микрофлюидика . Микрожидкостные устройства решают многие из текущих ограничений современных систем секвенирования.

Abate et al. изучал использование микрофлюидных устройств на основе капель для секвенирования ДНК. [4] Эти устройства способны формировать и обрабатывать капли размером с пиколитр со скоростью тысячи в секунду. Устройства были созданы из полидиметилсилоксана (PDMS) и использовали методы резонансного переноса энергии Форстера и FRET для считывания последовательностей ДНК, заключенных в каплях. Каждая позиция в массиве проверена на конкретную 15 базовую последовательность. [4]

Fair et al. использовали цифровые микрофлюидные устройства для изучения пиросеквенирования ДНК . [115] Существенные преимущества включают портативность устройства, объем реагента, скорость анализа, возможности массового производства и высокую производительность. Это исследование предоставило доказательство концепции, показывающей, что цифровые устройства можно использовать для пиросеквенирования; исследование включало использование синтеза, который включает расширение ферментов и добавление меченых нуклеотидов. [115]

Boles et al. также изучал пиросеквенирование на цифровых микрофлюидных устройствах. [116] Они использовали электросмачивающее устройство для создания, смешивания и разделения капель. При секвенировании используется протокол с тремя ферментами и шаблоны ДНК, закрепленные магнитными шариками. Устройство было протестировано с использованием двух протоколов и показало 100% точность на основе необработанных уровней пирограммы. Преимущества этих цифровых микрофлюидных устройств включают размер, стоимость и достижимые уровни функциональной интеграции. [116]

Исследования секвенирования ДНК с использованием микрофлюидики также могут быть применены к секвенированию РНК с использованием аналогичных капельно-микрофлюидных методов, таких как метод inDrops. [117] Это показывает, что многие из этих методов секвенирования ДНК можно будет применять и дальше, чтобы лучше понять геномы и транскриптомы.

Методы в разработке [ править ]

Методы секвенирования ДНК, которые в настоящее время разрабатываются, включают считывание последовательности при прохождении цепи ДНК через нанопоры (метод, который сейчас является коммерческим, но последующие поколения, такие как твердотельные нанопоры, все еще находятся в разработке) [118] [119] и методы, основанные на микроскопии. такие как атомно-силовая микроскопия или просвечивающая электронная микроскопия , которые используются для определения положений отдельных нуклеотидов в длинных фрагментах ДНК (> 5000 п.н.) путем маркировки нуклеотидов более тяжелыми элементами (например, галогенами) для визуального обнаружения и записи. [120] [121] Технологии третьего поколениястремятся увеличить производительность и сократить время получения результата и стоимость за счет устранения необходимости в избыточных реагентах и ​​использования процессивности ДНК-полимеразы. [122]

Туннельные токи Секвенирование ДНК [ править ]

Другой подход использует измерения электрических туннельных токов через однонитевую ДНК, когда она движется через канал. В зависимости от своей электронной структуры каждая база по-разному влияет на туннельный ток [123], что позволяет различать разные базы. [124]

Использование туннельных токов может упорядочить на порядки быстрее, чем методы ионного тока, и уже достигнуто секвенирование нескольких олигомеров ДНК и микро-РНК. [125]

Секвенирование путем гибридизации [ править ]

Секвенирование путем гибридизации - неферментативный метод, в котором используется ДНК-микрочип . Единый пул ДНК, последовательность которого необходимо определить, флуоресцентно метят и гибридизуют с массивом, содержащим известные последовательности. Сильные сигналы гибридизации от данного места на массиве идентифицируют его последовательность в секвенируемой ДНК. [126]

Этот метод секвенирования использует характеристики связывания библиотеки коротких одноцепочечных молекул ДНК (олигонуклеотидов), также называемых ДНК-зондами, для восстановления целевой последовательности ДНК. Неспецифические гибриды удаляют промыванием и элюируют ДНК-мишень. [127] Гибриды перестраиваются таким образом, что последовательность ДНК может быть реконструирована. Преимущество этого типа секвенирования заключается в его способности захватывать большое количество целей с однородным покрытием. [128] Обычно требуется большое количество химикатов и исходная ДНК. Однако с появлением гибридизации на основе растворов требуется гораздо меньше оборудования и химикатов. [127]

Секвенирование с масс-спектрометрией [ править ]

Для определения последовательностей ДНК можно использовать масс-спектрометрию . Матричная лазерная десорбционная ионизационная времяпролетная масс-спектрометрия, или MALDI-TOF MS , была специально исследована как альтернативный метод гель-электрофорезу для визуализации фрагментов ДНК. С помощью этого метода фрагменты ДНК, полученные в результате реакций секвенирования обрыва цепи, сравниваются по массе, а не по размеру. Масса каждого нуклеотида отличается от массы других, и эту разницу можно обнаружить с помощью масс-спектрометрии. Однонуклеотидные мутации во фрагменте легче обнаружить с помощью МС, чем с помощью только гель-электрофореза. MALDI-TOF MS может более легко обнаруживать различия между фрагментами РНК, поэтому исследователи могут косвенно секвенировать ДНК с помощью методов, основанных на MS, сначала преобразовав ее в РНК. [129]

Более высокое разрешение фрагментов ДНК, разрешенное методами на основе МС, представляет особый интерес для исследователей судебной медицины, поскольку они могут захотеть найти однонуклеотидные полиморфизмы в образцах ДНК человека для идентификации людей. Эти образцы могут быть сильно разложены, поэтому судебно-медицинские эксперты часто предпочитают митохондриальную ДНК из- за ее более высокой стабильности и применения в исследованиях клонов. Методы секвенирования MS на основе были использованы для сравнения последовательностей митохондриальной ДНК человека из образцов в Федеральном бюро расследований базы данных [130] и из костей найдены в массовых могилах солдат Первой мировой войны. [131]

Методы раннего завершения цепи и TOF MS продемонстрировали длину считывания до 100 пар оснований. [132] Исследователи не смогли превысить этот средний размер чтения; подобно секвенированию только по окончанию цепи, секвенирование ДНК на основе МС может не подходить для крупных проектов по секвенированию de novo . Тем не менее, недавнее исследование действительно использовало считывание коротких последовательностей и масс-спектроскопию для сравнения однонуклеотидных полиморфизмов в патогенных штаммах Streptococcus . [133]

Микрожидкостное секвенирование по Сэнгеру [ править ]

Основная статья: секвенирование по Сэнгеру

При микрофлюидном секвенировании по Сэнгеру вся амплификация фрагментов ДНК с помощью термоциклирования, а также их разделение с помощью электрофореза выполняется на одной стеклянной пластине (приблизительно 10 см в диаметре), что сокращает использование реагентов, а также стоимость. [134] В некоторых случаях исследователи показали, что они могут увеличить производительность обычного секвенирования с помощью микрочипов. [135] Еще предстоит провести исследования, чтобы сделать такое использование технологий эффективным.

Методы, основанные на микроскопии [ править ]

Основная статья: Трансмиссионная электронная микроскопия, секвенирование ДНК

Этот подход позволяет непосредственно визуализировать последовательность молекул ДНК с помощью электронной микроскопии. Первая идентификация пар оснований ДНК в интактных молекулах ДНК путем ферментативного включения модифицированных оснований, которые содержат атомы с увеличенным атомным номером, прямой визуализации и идентификации индивидуально помеченных оснований в синтетической молекуле ДНК с 3272 парами оснований и вирусном геноме с 7249 парами оснований был продемонстрирован. [136]

Последовательность RNAP [ править ]

Этот метод основан на использовании РНК-полимеразы (РНКП), которая прикрепляется к шарику из полистирола . Один конец ДНК, подлежащий секвенированию, прикрепляют к другой бусине, причем обе бусинки помещают в оптические ловушки. Движение RNAP во время транскрипции сближает шарики, и их относительное расстояние изменяется, что затем может быть записано с разрешением в один нуклеотид. Последовательность выводится на основе четырех считываний с пониженными концентрациями каждого из четырех типов нуклеотидов, аналогично методу Сэнгера. [137] Производится сравнение между областями, и информация о последовательности выводится путем сравнения областей известной последовательности с областями неизвестной последовательности. [138]

Высокопроизводительное секвенирование вирусов in vitro [ править ]

Был разработан метод анализа полных наборов белковых взаимодействий с использованием комбинации 454 пиросеквенирования и метода отображения мРНК вируса in vitro . В частности, этот метод ковалентно связывает интересующие белки с кодирующими их мРНК, а затем обнаруживает части мРНК с помощью ПЦР с обратной транскрипцией . Затем мРНК можно амплифицировать и секвенировать. Комбинированный метод был назван IVV-HiTSeq и может выполняться в бесклеточных условиях, хотя его результаты могут не соответствовать условиям in vivo . [139]

Подготовка образца [ править ]

Успех любого протокола секвенирования ДНК зависит от экстракции и подготовки образца ДНК или РНК из интересующего биологического материала.

  • В результате успешной экстракции ДНК будет получен образец ДНК с длинными неразрушенными цепями.
  • Успешная экстракция РНК даст образец РНК, который необходимо преобразовать в комплементарную ДНК (кДНК) с использованием обратной транскриптазы - ДНК-полимеразы, которая синтезирует комплементарную ДНК на основе существующих цепей РНК способом, подобным ПЦР. [140] Комплементарная ДНК может быть обработана так же, как геномная ДНК.

В соответствии с используемой технологией секвенирования образцы, полученные в результате экстракции ДНК или РНК, требуют дополнительной подготовки. Для секвенирования по Сэнгеру перед секвенированием требуются процедуры клонирования или ПЦР. В случае методов секвенирования следующего поколения перед обработкой требуется подготовка библиотеки. [141] Оценка качества и количества нуклеиновых кислот как после экстракции, так и после подготовки библиотеки выявляет деградированные, фрагментированные и низкочистые образцы и дает высококачественные данные секвенирования. [142]

Высокопроизводительный характер современных технологий секвенирования ДНК / РНК создал проблему для масштабирования метода подготовки проб. Несколько инструментов для работы с жидкостями используются для подготовки большего количества проб с меньшим общим временем работы:

КомпанияПогрузчики жидкости / Автоматизацияlower_mark_USDupper_mark_USDLanding_url
ОпентроныОпенТронс ОТ-25750 долл. США20 000 долл. СШАhttps://www.opentrons.com/
GilsonГилсон Пипетмакс20 000 долл. США40 000 долл. СШАhttps://gb.gilson.com/GBSV/system-pipetmax.html
NeotecNeotec EzMate25 000 долл. США45 000 долл. СШАhttp://neotec.co.il/pipetting-device/
FormulatrixFormulatrix Mantis40 000 долл. США60 000 долл. СШАhttps://formulatrix.com/liquid-handling-systems/mantis-liquid-handler/
Hudson RoboticsHudson Robotics СОЛО40 000 долл. США50 000 долл. СШАhttps://hudsonrobotics.com/products/applications/automated-solutions-next-generation-sequencing-ngs/
ГамильтонГамильтон Микролаб НИМБУС40 000 долл. США80 000 долл. СШАhttps://www.hamiltoncompany.com/automated-liquid-handling/platforms/microlab-nimbus#specifications
TTP LabtechTTP Labtech Mosquito HV Genomics45 000 долл. США80 000 долл. СШАhttps://www.sptlabtech.com/products/liquid-handling/mosquito-hv-genomics/
Бекман КоултерБиомек 400050 000 долл. США65 000 долл. СШАhttps://www.mybeckman.uk/liquid-handlers/biomek-4000/b22640
ГамильтонГамильтон Геномик STARlet50 000 долл. США100 000 долл. СШАhttps://www.hamiltoncompany.com/automated-liquid-handling/assay-ready-workstations/genomic-starlet
EppendorfEppendorf epMotion 5075t95 000 долл. США110 000 долл. СШАhttps://www.eppendorf.com/epmotion/
Бекман КоултерBeckman Coulter Biomek i5100 000 долл. США150 000 долл. СШАhttps://www.beckman.com/liquid-handlers/biomek-i5
ГамильтонГамильтон NGS STAR100 000 долл. США200 000 долл. СШАhttp://www.hamiltonrobotics.com/
ПеркинЭлмерPerkinElmer Sciclone G3 NGS и рабочая станция NGSx150 000 долл. США220 000 долл. СШАhttps://www.perkinelmer.com/uk/product/sciclone-g3-ngs-workstation-cls145321
AgilentAgilent Bravo NGS170 000 долл. США290 000 долл. СШАhttps://www.agilent.com/en/products/automated-liquid-handling/automated-liquid-handling-applications/bravo-ngs
Бекман КоултерBeckman Coulter Biomek i7200 000 долл. США250 000 долл. СШАhttps://www.beckman.com/liquid-handlers/biomek-i7
Лабцит Эхо 525Beckman Coulter Labcyte Echo 525260 000 долл. США300 000 долл. СШАhttps://www.labcyte.com/products/liquid-handling/echo-525-liquid-handler
TecanTecan NGS270 000 долл. США350 000 долл. СШАhttps://lifesciences.tecan.com/ngs-sample-preparation

Инициативы развития [ править ]

Общая стоимость секвенирования генома человека с течением времени, рассчитанная NHGRI .

В октябре 2006 года фонд X Prize Foundation выступил с инициативой по содействию разработке технологий полногеномного секвенирования , получившей название Archon X Prize , с намерением выделить 10 миллионов долларов «первой команде, которая сможет создать устройство и использовать его для секвенирования 100 геномов человека. в течение 10 дней или меньше, с точностью не более одной ошибки на каждые 100 000 секвенированных оснований, с последовательностями, точно покрывающими не менее 98% генома, и с повторяющейся стоимостью не более 10 000 долларов США за геном ". [143]

Каждый год Национальный институт исследования генома человека (NHGRI) выделяет гранты на новые исследования и разработки в области геномики . Гранты 2010 г. и кандидаты 2011 г. включают продолжение работы в области микрожидкостных, полониевых и методологий секвенирования на основе тяжелых оснований. [144]

Вычислительные задачи [ править ]

Описанные здесь технологии секвенирования производят необработанные данные, которые необходимо собрать в более длинные последовательности, такие как полные геномы ( сборка последовательностей ). Для этого существует множество вычислительных задач, таких как оценка необработанных данных последовательности, которая выполняется программами и алгоритмами, такими как Phred и Phrap . Другие проблемы связаны с повторяющимися последовательностями, которые часто препятствуют полной сборке генома, потому что они встречаются во многих местах генома. Как следствие, многие последовательности не могут быть отнесены к конкретным хромосомам . Получение исходных данных о последовательностях - это только начало подробного биоинформатического анализа. [145]Однако были разработаны новые методы секвенирования и исправления ошибок секвенирования. [146]

Прочитать обрезку [ править ]

Иногда необработанные считывания, производимые секвенсором, верны и точны только в части их длины. Использование всего чтения может привести к появлению артефактов в последующих анализах, таких как сборка генома, вызов snp или оценка экспрессии генов. Были представлены два класса программ обрезки, основанные на классах алгоритмов, основанных на окнах или на классах алгоритмов с промежуточной суммой. [147] Это неполный список алгоритмов обрезки, доступных в настоящее время, с указанием класса алгоритмов, к которому они принадлежат:

Прочтите алгоритмы обрезки
Название алгоритмаТип алгоритмаСвязь
Cutadapt [148]Текущая суммаCutadapt
ConDeTri [149]На основе окнаConDeTri
ЭРНЕ-ФИЛЬТР [150]Текущая суммаERNE-ФИЛЬТР
Качественный триммер FASTXНа основе окнаКачественный триммер FASTX
PRINSEQ [151]На основе окнаPRINSEQ
Trimmomatic [152]На основе окнаTrimmomatic
SolexaQA [153]На основе окнаSolexaQA
SolexaQA-BWAТекущая суммаSolexaQA-BWA
СерпНа основе окнаСерп

Этические вопросы [ править ]

Дополнительная информация: Биоэтика

Генетика человека была включена в сферу биоэтики с начала 1970-х годов [154], и рост использования секвенирования ДНК (особенно высокопроизводительного секвенирования) привел к возникновению ряда этических проблем. Одна из ключевых проблем - это право собственности на ДНК человека и данные, полученные при секвенировании этой ДНК. [155] Что касается самой молекулы ДНК, ведущего судебного дела по этой теме, Мур против Регентов Калифорнийского университета (1990) постановил, что отдельные лица не имеют прав собственности на выброшенные клетки или какую-либо прибыль, полученную с использованием этих клеток (например, как запатентованная клеточная линия). Однако люди имеют право на информированное согласие на удаление и использование ячеек. Что касается данных, полученных с помощью секвенирования ДНК, Мур не дает человеку никаких прав на информацию, полученную из его ДНК. [155]

Поскольку секвенирование ДНК становится все более распространенным, хранение, безопасность и совместное использование геномных данных также становятся все более важными. [155] [156] Например, одна проблема заключается в том, что страховщики могут использовать геномные данные человека для изменения своей квоты в зависимости от предполагаемого будущего здоровья человека на основе его ДНК. [156] [157] В мае 2008 г. в Соединенных Штатах был подписан Закон о недискриминации в области генетической информации (GINA), запрещающий дискриминацию на основе генетической информации в отношении медицинского страхования и трудоустройства. [158] [159] В 2012 г. Комиссия при президенте США по изучению вопросов биоэтикисообщили, что существующее законодательство о конфиденциальности для данных секвенирования ДНК, таких как GINA и Закон о переносимости и подотчетности медицинского страхования, было недостаточным, отметив, что данные полногеномного секвенирования были особенно чувствительными, поскольку их можно было использовать для идентификации не только человека, от которого эти данные были созданы, но и их родственники. [160] [161]

В большинстве Соединенных Штатов «брошенная» ДНК, например ДНК, обнаруженная на облизанной марке или конверте, кофейной чашке, сигарете, жевательной резинке, бытовом мусоре или волосах, упавших на общественный тротуар, может быть законно собрана. и установлен кем-либо, включая полицию, частных детективов, политических оппонентов или лиц, вовлеченных в споры об отцовстве. По состоянию на 2013 год в одиннадцати штатах действуют законы, которые можно интерпретировать как запрещающие «кражу ДНК». [162]

Этические вопросы также были подняты в связи с все более широким использованием скрининга генетических вариаций как у новорожденных, так и у взрослых такими компаниями, как 23andMe . [163] [164] Утверждалось, что скрининг на генетические вариации может быть вредным, увеличивая тревогу у людей, у которых был обнаружен повышенный риск заболевания. [165] Например, в одном случае, упомянутом в Time , врачи, проверяющие больного ребенка на генетические варианты, решили не сообщать родителям о неродственном варианте, связанном с деменцией, из-за вреда, который он может причинить родителям. [166] Однако исследование 2011 г., опубликованное в Медицинском журнале Новой Англии.показал, что люди, подвергшиеся профилированию риска заболевания, не проявляют повышенного уровня тревожности. [165]

См. Также [ править ]

Примечания [ править ]

  1. ^ «Следующее поколение» остается широко используемым с 2019 года. Например, Straiton J, Free T, Sawyer A, Martin J (февраль 2019). «От секвенирования по Сэнгеру к базам данных генома и не только» . Биотехнологии . 66 (2): 60–63. DOI : 10.2144 / БТН-2019-0011 . PMID  30744413 . Технологии секвенирования нового поколения (NGS) произвели революцию в геномных исследованиях. (вступительное предложение статьи)

Ссылки [ править ]

  1. ^ «Представляем« темную ДНК »- явление, которое может изменить наше представление об эволюции» .
  2. ^ Behjati S, Tarpey PS (декабрь 2013 года). "Что такое секвенирование следующего поколения?" . Архив болезней детства. Выпуск "Образование и практика" . 98 (6): 236–8. DOI : 10.1136 / archdischild-2013-304340 . PMC 3841808 . PMID 23986538 .  
  3. ^ Chmielecki Дж, Меерсон М (14 января 2014). «Секвенирование ДНК рака: что мы узнали?». Ежегодный обзор медицины . 65 (1): 63–79. DOI : 10.1146 / annurev-med-060712-200152 . PMID 24274178 . 
  4. ^ a b c d Abate AR, Hung T., Sperling RA, Mary P, Rotem A, Agresti JJ, et al. (Декабрь 2013). «Анализ последовательности ДНК с помощью капельной микрофлюидики» . Лаборатория на чипе . 13 (24): 4864–9. DOI : 10.1039 / c3lc50905b . PMC 4090915 . PMID 24185402 .  
  5. ^ Пекин Д., Схири Ю., Барет Дж. К., Ле Корре Д., Мазутис Л., Салем С. Б. и др. (Июль 2011 г.). «Количественное и чувствительное обнаружение редких мутаций с использованием капельной микрофлюидики». Лаборатория на чипе . 11 (13): 2156–66. DOI : 10.1039 / c1lc20128j . PMID 21594292 . 
  6. ^ Olsvik О, Уохлберг Дж, Petterson В, Uhlén М, Т Поповича, Wachsmuth И.К., Поля ПИ (январь 1993 г.). «Использование автоматизированного секвенирования ампликонов, генерируемых полимеразной цепной реакцией, для идентификации трех типов субъединицы В холерного токсина в штаммах Vibrio cholerae O1» . J. Clin. Microbiol. 31 (1): 22–25. DOI : 10.1128 / JCM.31.1.22-25.1993 . PMC 262614 . PMID 7678018 .   
  7. ^ Петерсон E, Lundeberg J, Ahmadian A (февраль 2009). «Поколения технологий секвенирования». Геномика . 93 (2): 105–11. DOI : 10.1016 / j.ygeno.2008.10.003 . PMID 18992322 . 
  8. ^ a b c Кастро, Кристина; Марин, Рэйчел; Рамос, Эдвард; Нг, Терри Фей Фан (2019). «Влияние вариантной интерференции на сборку de novo для глубокого секвенирования вирусов» . BMC Genomics . 21 (1): 421. bioRxiv 10.1101 / 815480 . DOI : 10,1186 / s12864-020-06801-ш . PMC 7306937 . PMID 32571214 .   
  9. ^ а б Уол, Ширли; Шаффнер, Стивен Ф .; Сабети, Пардис К. (2016). «Геномный анализ вирусных вспышек» . Ежегодный обзор вирусологии . 3 (1): 173–195. DOI : 10.1146 / annurev-virology-110615-035747 . PMC 5210220 . PMID 27501264 .  
  10. ^ Schleusener В, Koser CU, Беккерт Р, Ниманн S, Feuerriegel S (2017). « Прогнозирование устойчивости Mycobacterium tuberculosis и классификация клонов на основе секвенирования генома: сравнение инструментов автоматического анализа» . Sci Rep . 7 : 46327. Bibcode : 2017NatSR ... 746327S . DOI : 10.1038 / srep46327 . PMC 7365310 . PMID 28425484 .  
  11. ^ Маэ Р, Эль Адзами М, Barlas Р, Tournoud М (2019). «Крупномасштабная оценка TBProfiler и Mykrobe для прогнозирования устойчивости Mycobacterium tuberculosis к антибиотикам » . PeerJ . 7 : e6857. DOI : 10,7717 / peerj.6857 . PMC 6500375 . PMID 31106066 .  
  12. ^ Mykrobe predictor - прогнозирование устойчивости к антибиотикам для S. aureus и M. tuberculosis на основе данных последовательности всего генома
  13. ^ Быстрые прогнозы устойчивости к антибиотикам на основе данных последовательности генома для Staphylococcus aureus и Mycobacterium tuberculosis
  14. ^ Майкл Мосли против супербактерий
  15. ^ Mykrobe Predictor github
  16. ↑ Curtis C, Hereward J (29 августа 2017 г.). «От места преступления до зала суда: путешествие образца ДНК» . Разговор .
  17. ^ Мореры S, Larivière л, Kurzeck Дж, Aschke-Sonnenborn U, Freemont ПС, Янин Дж, Рюгер Вт (август 2001 г.). «Кристаллические структуры с высоким разрешением бета-глюкозилтрансферазы фага Т4: индуцированное соответствие и эффект связывания субстрата и металла». Журнал молекулярной биологии . 311 (3): 569–77. DOI : 10.1006 / jmbi.2001.4905 . PMID 11493010 . 
  18. ↑ Эрлих М., Гама-Соса М.А., Хуанг Л.Х., Миджетт Р.М., Куо К.С., МакКьюн Р.А., Герке С. (апрель 1982 г.). «Количество и распределение 5-метилцитозина в ДНК человека из различных типов тканей клеток» . Исследования нуклеиновых кислот . 10 (8): 2709–21. DOI : 10.1093 / NAR / 10.8.2709 . PMC 320645 . PMID 7079182 .  
  19. ↑ Эрлих М., Ван Р. Я. (июнь 1981 г.). «5-Метилцитозин в эукариотической ДНК». Наука . 212 (4501): 1350–7. Bibcode : 1981Sci ... 212.1350E . DOI : 10.1126 / science.6262918 . PMID 6262918 . 
  20. ↑ Song CX, Clark TA, Lu XY, Kislyuk A, Dai Q, Turner SW и др. (Ноябрь 2011 г.). «Чувствительное и специфическое секвенирование одной молекулы 5-гидроксиметилцитозина» . Природные методы . 9 (1): 75–7. DOI : 10.1038 / nmeth.1779 . PMC 3646335 . PMID 22101853 .  
  21. ^ Ватсон JD, Крик FH (1953). «Строение ДНК». Холодная весна Харб. Symp. Quant. Биол . 18 : 123–31. DOI : 10.1101 / SQB.1953.018.01.020 . PMID 13168976 . 
  22. ^ Маркс, L, Путь к секвенированию ДНК: жизнь и работа Фредерика Сэнгера .
  23. ^ Мин Жу W, Haegeman G, M Исебаерт, Фирс W (май 1972). «Нуклеотидная последовательность гена, кодирующего белок оболочки бактериофага MS2». Природа . 237 (5350): 82–8. Bibcode : 1972Natur.237 ... 82J . DOI : 10.1038 / 237082a0 . PMID 4555447 . S2CID 4153893 .  
  24. ^ Fiers W, Contreras R, Duerinck F, Haegeman G, Iserentant D, Merregaert J, Min Jou W, Molemans F, Raeymaekers A, Van den Berghe A, Volckaert G, Ysebaert M (апрель 1976). «Полная нуклеотидная последовательность РНК бактериофага MS2: первичная и вторичная структура гена репликазы». Природа . 260 (5551): 500–7. Bibcode : 1976Natur.260..500F . DOI : 10.1038 / 260500a0 . PMID 1264203 . S2CID 4289674 .  
  25. ^ Ozsolak F, Милош PM (февраль 2011). «Секвенирование РНК: достижения, проблемы и возможности» . Природа Обзоры Генетики . 12 (2): 87–98. DOI : 10.1038 / nrg2934 . PMC 3031867 . PMID 21191423 .  
  26. ^ "Профиль факультета Рэя Ву" . Корнелл Университет. Архивировано из оригинала 4 марта 2009 года.
  27. ^ Падманабхан R, Jay E, Wu R (июнь 1974). «Химический синтез праймера и его использование в анализе последовательности гена лизоцима бактериофага Т4» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 71 (6): 2510–4. Bibcode : 1974PNAS ... 71.2510P . DOI : 10.1073 / pnas.71.6.2510 . PMC 388489 . PMID 4526223 .  
  28. ^ Онага LA (июнь 2014). «Рэй Ву как пятый бизнес: демонстрация коллективной памяти в истории секвенирования ДНК». Исследования по истории и философии науки . Часть C. 46 : 1–14. DOI : 10.1016 / j.shpsc.2013.12.006 . PMID 24565976 . 
  29. ↑ Wu R (1972). «Анализ нуклеотидной последовательности ДНК». Природа Новая Биология . 236 (68): 198–200. DOI : 10.1038 / newbio236198a0 . PMID 4553110 . 
  30. ^ Падманабхан R, В R (1972). «Анализ нуклеотидной последовательности ДНК. IX. Использование олигонуклеотидов определенной последовательности в качестве праймеров в анализе последовательности ДНК». Biochem. Биофиз. Res. Commun . 48 (5): 1295–302. DOI : 10.1016 / 0006-291X (72) 90852-2 . PMID 4560009 . 
  31. ↑ Wu R, Tu CD, Padmanabhan R (1973). «Анализ нуклеотидной последовательности ДНК. XII. Химический синтез и анализ последовательности додекадеоксинуклеотида, который связывается с геном эндолизина бактериофага лямбда». Biochem. Биофиз. Res. Commun . 55 (4): 1092–99. DOI : 10.1016 / S0006-291X (73) 80007-5 . PMID 4358929 . 
  32. Перейти ↑ Jay E, Bambara R, Padmanabhan R, Wu R (март 1974). «Анализ последовательности ДНК: общий, простой и быстрый метод секвенирования больших олигодезоксирибонуклеотидных фрагментов путем картирования» . Исследования нуклеиновых кислот . 1 (3): 331–53. DOI : 10.1093 / NAR / 1.3.331 . PMC 344020 . PMID 10793670 .  
  33. ^ a b Сэнгер Ф, Никлен С, Колсон А. Р. (декабрь 1977 г.). «Секвенирование ДНК с помощью ингибиторов обрыва цепи» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 74 (12): 5463–77. Bibcode : 1977PNAS ... 74.5463S . DOI : 10.1073 / pnas.74.12.5463 . PMC 431765 . PMID 271968 .  
  34. ^ a b c Максам AM, Гилберт W (февраль 1977 г.). «Новый метод секвенирования ДНК» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 74 (2): 560–64. Bibcode : 1977PNAS ... 74..560M . DOI : 10.1073 / pnas.74.2.560 . PMC 392330 . PMID 265521 .  
  35. ^ Гилберт, W. Секвенирование ДНК и структура гена . Нобелевская лекция, 8 декабря 1980 г.
  36. ↑ Gilbert W, Maxam A (декабрь 1973). «Нуклеотидная последовательность оператора lac» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 70 (12): 3581–84. Bibcode : 1973PNAS ... 70.3581G . DOI : 10.1073 / pnas.70.12.3581 . PMC 427284 . PMID 4587255 .  
  37. ↑ Sanger F, Air GM, Barrell BG, Brown NL, Coulson AR, Fiddes CA, Hutchison CA, Slocombe PM, Smith M (февраль 1977). «Нуклеотидная последовательность ДНК бактериофага phi X174». Природа . 265 (5596): 687–95. Bibcode : 1977Natur.265..687S . DOI : 10.1038 / 265687a0 . PMID 870828 . S2CID 4206886 .  
  38. ^ "The Next Frontier: Human Viruses" , whatisbiotechnology.org, дата обращения 3 мая 2017 г.
  39. Перейти ↑ Beck S, Pohl FM (1984). «Секвенирование ДНК с помощью прямого блоттингового электрофореза» . EMBO J . 3 (12): 2905–09. DOI : 10.1002 / j.1460-2075.1984.tb02230.x . PMC 557787 . PMID 6396083 .  
  40. ^ Патент США 4631122 (1986)
  41. ^ Feldmann H, et al. (1994). «Полная последовательность ДНК хромосомы II дрожжей» . EMBO J . 13 (24): 5795–809. DOI : 10.1002 / j.1460-2075.1994.tb06923.x . PMC 395553 . PMID 7813418 .  
  42. ^ Смит Л. М., Сандерс Дж. З., Кайзер Р. Дж., Хьюз П., Додд С., Коннелл С. Р., Хайнер С., Кент С. Б., Худ LE (12 июня 1986 г.). «Обнаружение флуоресценции в автоматическом анализе последовательности ДНК». Природа . 321 (6071): 674–79. Bibcode : 1986Natur.321..674S . DOI : 10.1038 / 321674a0 . PMID 3713851 . S2CID 27800972 .  
  43. ^ Prober JM, Трейнор GL, Dam RJ, Hobbs FW, Robertson CW, Загурский RJ, Cocuzza AJ, Jensen MA, Баумейстер K (16 октября 1987). «Система для быстрого секвенирования ДНК с флуоресцентными дидезоксинуклеотидами, завершающими цепь». Наука . 238 (4825): 336–41. Bibcode : 1987Sci ... 238..336P . DOI : 10.1126 / science.2443975 . PMID 2443975 . 
  44. ^ Адамс М. Д., Келли Ю.М., Gocayne JD, Dubnick М, Polymeropoulos МН, Сяо Н, Меррил CR, Ву А, Б Olde, Морено РФ (июнь 1991). «Комплементарное секвенирование ДНК: метки экспрессированной последовательности и проект генома человека». Наука . 252 (5013): 1651–56. Bibcode : 1991Sci ... 252.1651A . DOI : 10.1126 / science.2047873 . PMID 2047873 . S2CID 13436211 .  
  45. ^ Флейшман RD, Adams MD, белый O, Clayton RA, Kirkness EF, Kerlavage AR, Bult CJ, Tomb JF, Догертите Б.А., Меррик JM (июль 1995). «Полногеномное случайное секвенирование и сборка Haemophilus influenzae Rd ». Наука . 269 (5223): 496–512. Bibcode : 1995Sci ... 269..496F . DOI : 10.1126 / science.7542800 . PMID 7542800 . 
  46. ^ Lander ES, Linton LM, Birren B, Nusbaum C, Zody MC и др. (Февраль 2001 г.). «Первоначальное секвенирование и анализ генома человека» (PDF) . Природа . 409 (6822): 860–921. Bibcode : 2001Natur.409..860L . DOI : 10.1038 / 35057062 . PMID 11237011 .  
  47. ^ Venter JC, Adams MD, et al. (Февраль 2001 г.). «Последовательность генома человека» . Наука . 291 (5507): 1304–51. Bibcode : 2001Sci ... 291.1304V . DOI : 10.1126 / science.1058040 . PMID 11181995 . 
  48. ^ «Espacenet - Библиографические данные» . world.espacenet.com .
  49. ^ Ronaghi М, Karamohamed S, Петерсон В, Uhlén М, Р Nyren (1996). «Секвенирование ДНК в реальном времени с использованием обнаружения высвобождения пирофосфата». Аналитическая биохимия . 242 (1): 84–89. DOI : 10.1006 / abio.1996.0432 . PMID 8923969 . 
  50. ^ a b Кавасима, Эрик Х .; Лоран Фаринелли; Паскаль Майер (12 мая 2005 г.). «Патент: Метод амплификации нуклеиновых кислот» . Архивировано из оригинального 22 февраля 2013 года . Проверено 22 декабря 2012 года .
  51. ↑ Ewing B, Green P (март 1998 г.). «Базовый вызов трассировок автоматического секвенсора с использованием phred. II. Вероятности ошибок» . Genome Res . 8 (3): 186–94. DOI : 10.1101 / gr.8.3.186 . PMID 9521922 . 
  52. ^ «Показатели качества для секвенирования следующего поколения» (PDF) . Illumina . 31 октября 2011 . Проверено 8 мая 2018 .
  53. ^ a b Бреннер С., Джонсон М., Бриджем Дж., Голда Дж., Ллойд Д.Х., Джонсон Д., Луо С., МакКарди С., Фой М., Эван М., Рот Р., Джордж Д., Элетр С., Альбрехт Дж., Вермаас Е., Уильямс С. Р. , Moon K, Burcham T, Pallas M, DuBridge RB, Kirchner J, Fearon K, Mao J, Corcoran K (2000). «Анализ экспрессии генов путем массового параллельного секвенирования сигнатур (MPSS) на массивах микрогранул». Природа Биотехнологии . 18 (6): 630–34. DOI : 10.1038 / 76469 . PMID 10835600 . S2CID 13884154 .  
  54. Перейти ↑ Sanger F, Coulson AR (май 1975 г.). «Экспресс-метод определения последовательностей в ДНК путем примированного синтеза ДНК-полимеразой». J. Mol. Биол . 94 (3): 441–48. DOI : 10.1016 / 0022-2836 (75) 90213-2 . PMID 1100841 . 
  55. ^ Wetterstrand, Крис. «Затраты на секвенирование ДНК: данные Программы секвенирования генома NHGRI (GSP)» . Национальный институт исследования генома человека . Проверено 30 мая 2013 года .
  56. Перейти ↑ Quail MA, Gu Y, Swerdlow H, Mayho M (2012). «Оценка и оптимизация препаративных полуавтоматических систем электрофореза для подготовки библиотеки Illumina». Электрофорез . 33 (23): 3521–28. DOI : 10.1002 / elps.201200128 . PMID 23147856 . S2CID 39818212 .  
  57. ^ Duhaime MB, Дэн L, Поулос BT, Sullivan MB (2012). «К количественной метагеномике диких вирусов и других образцов ДНК сверхнизкой концентрации: тщательная оценка и оптимизация метода амплификации линкера» . Environ. Microbiol . 14 (9): 2526–37. DOI : 10.1111 / j.1462-2920.2012.02791.x . PMC 3466414 . PMID 22713159 .  
  58. ^ Петерсон Б. К., Вебер JN, Кей EH, Fisher HS, Хоекстра HE (2012). «Двойной дайджест RADseq: недорогой метод обнаружения de novo SNP и генотипирования у модельных и немодельных видов» . PLOS ONE . 7 (5): e37135. Bibcode : 2012PLoSO ... 737135P . DOI : 10.1371 / journal.pone.0037135 . PMC 3365034 . PMID 22675423 .  
  59. ^ Уильямс Р., Пейсайович С.Г., Миллер О.Дж., Магдасси С., Тауфик Д.С., Гриффитс А.Д. (2006). «Амплификация сложных библиотек генов методом эмульсионной ПЦР». Природные методы . 3 (7): 545–50. DOI : 10.1038 / nmeth896 . PMID 16791213 . S2CID 27459628 .  
  60. ^ а б Маргулис М., Эгхолм М. и др. (Сентябрь 2005 г.). «Секвенирование генома в открытых микроподготовленных пиколитерных реакторах высокой плотности» . Природа . 437 (7057): 376–80. Bibcode : 2005Natur.437..376M . DOI : 10,1038 / природа03959 . PMC 1464427 . PMID 16056220 .  
  61. ^ Shendure J, Porreca GJ, Reppas Н.Б., Лин X, Маккатчеон JP, Розенбаум М., Ван MD, Чжан K, Митра RD, церковь GM (2005). «Точное мультиплексное секвенирование полонии эволюционировавшего бактериального генома». Наука . 309 (5741): 1728–32. Bibcode : 2005Sci ... 309.1728S . DOI : 10.1126 / science.1117389 . PMID 16081699 . S2CID 11405973 .  
  62. ^ «Прикладные биосистемы - файл не найден (ошибка 404)» . 16 мая 2008 года Архивировано из оригинала 16 мая 2008 года.
  63. ↑ Goodwin S, McPherson JD, McCombie WR (май 2016 г.). «Достигнув совершеннолетия: десять лет технологий секвенирования следующего поколения». Природа Обзоры Генетики . 17 (6): 333–51. DOI : 10.1038 / nrg.2016.49 . PMID 27184599 . S2CID 8295541 .  
  64. ↑ Staden R (11 июня 1979 г.). «Стратегия секвенирования ДНК с использованием компьютерных программ» . Исследования нуклеиновых кислот . 6 (7): 2601–10. DOI : 10.1093 / NAR / 6.7.2601 . PMC 327874 . PMID 461197 .  
  65. ^ де Magalhães JP, Finch CE, Janssens G (2010). «Секвенирование следующего поколения в исследованиях старения: новые приложения, проблемы, подводные камни и возможные решения» . Обзоры исследований старения . 9 (3): 315–23. DOI : 10.1016 / j.arr.2009.10.006 . PMC 2878865 . PMID 19900591 .  
  66. ^ Град A (август 2013). «Секвенирование следующего поколения: методология и применение» . J Invest Dermatol . 133 (8): e11. DOI : 10.1038 / jid.2013.248 . PMID 23856935 . 
  67. Перейти ↑ Hall N (май 2007 г.). «Передовые технологии секвенирования и их более широкое влияние на микробиологию» . J. Exp. Биол. 210 (Pt 9): 1518–25. DOI : 10,1242 / jeb.001370 . PMID 17449817 .  
  68. ^ Церковь GM (январь 2006 г.). «Геномы для всех». Sci. Являюсь. 294 (1): 46–54. Bibcode : 2006SciAm.294a..46C . DOI : 10.1038 / Scientificamerican0106-46 . PMID 16468433 .  (требуется подписка)
  69. ^ a b c Schuster SC (январь 2008 г.). «Секвенирование следующего поколения меняет сегодняшнюю биологию». Nat. Методы . 5 (1): 16–18. DOI : 10.1038 / nmeth1156 . PMID 18165802 . S2CID 1465786 .  
  70. ^ Kalb, Гилберт; Моксли, Роберт (1992). Массовые параллельные, оптические и нейронные вычисления в США . IOS Press . ISBN 978-90-5199-097-3.[ требуется страница ]
  71. ^ десять Bosch JR, Grody WW (2008). «Идти в ногу со следующим поколением» . Журнал молекулярной диагностики . 10 (6): 484–92. DOI : 10,2353 / jmoldx.2008.080027 . PMC 2570630 . PMID 18832462 .  
  72. Перейти ↑ Tucker T, Marra M, Friedman JM (2009). «Массивно параллельное секвенирование: следующая большая вещь в генетической медицине» . Американский журнал генетики человека . 85 (2): 142–54. DOI : 10.1016 / j.ajhg.2009.06.022 . PMC 2725244 . PMID 19679224 .  
  73. ^ a b Straiton J, Free T, Sawyer A, Martin J (февраль 2019 г.). «От секвенирования по Сэнгеру до баз данных генома и не только» . Биотехнологии . Будущее науки. 66 (2): 60–63. DOI : 10.2144 / БТН-2019-0011 . PMID 30744413 . 
  74. Перейти ↑ Quail MA, Smith M, Coupland P, Otto TD, Harris SR, Connor TR, Bertoni A, Swerdlow HP, Gu Y (1 января 2012 г.). «Рассказ о трех платформах секвенирования следующего поколения: сравнение секвенсоров Ion Torrent, Pacific Biosciences и illumina MiSeq» . BMC Genomics . 13 (1): 341. DOI : 10.1186 / 1471-2164-13-341 . PMC 3431227 . PMID 22827831 .  
  75. ↑ Liu L, Li Y, Li S, Hu N, He Y, Pong R, Lin D, Lu L, Law M (1 января 2012 г.). «Сравнение систем секвенирования нового поколения» . Журнал биомедицины и биотехнологии . 2012 : 251364. дои : 10,1155 / 2012/251364 . PMC 3398667 . PMID 22829749 .  
  76. ^ a b c «Новое программное обеспечение, полимераза для увеличения пропускной способности и доступности системы сиквелов - PacBio» . 7 марта 2018.
  77. ^ «После года тестирования два первых клиента PacBio ожидают более регулярного использования RS Sequencer в 2012 году» . GenomeWeb. 10 января 2012 г.( требуется регистрация )
  78. ^ Inc., Pacific Biosciences (2013). «Pacific Biosciences представляет новую химию с большей длиной считывания для обнаружения новых особенностей в последовательности ДНК и продвинутых исследований генома крупных организмов» .
  79. ^ Чин CS, Александр DH, Маркс P, Кламмер AA, Дрейк J, Хайнер C, Клам A, Коупленд A, Хаддлстон J, Эйхлер EE, Тернер SW, Корлач J (2013). «Негибридные, готовые сборки микробного генома на основе данных секвенирования SMRT с длинным считыванием». Nat. Методы . 10 (6): 563–69. DOI : 10.1038 / nmeth.2474 . PMID 23644548 . S2CID 205421576 .  
  80. ^ a b "Сборка бактериального генома De novo: решенная проблема?" . 5 июля 2013 г.
  81. ^ Rasko Д.А., Webster Д.Р., Сахл JW, Башир А, Boisen Н, Scheutz Ж, Paxinos Е.Е., Sebra R, Chin CS, Илиопулос D, Кламмер А, Peluso Р, Ли L, Кислюк А.О., Буллард Дж, Kasarskis А, Ван S, Eid J, Rank D, Redman JC, Steyert SR, Frimodt-Møller J, Struve C, Petersen AM, Krogfelt KA, Nataro JP, Schadt EE, Waldor MK (25 августа 2011 г.). «Истоки штамма, вызвавшего вспышку гемолитико-уремического синдрома в Германии» . N Engl J Med . 365 (8): 709–17. DOI : 10.1056 / NEJMoa1106920 . PMC 3168948 . PMID 21793740 .  
  82. ^ Тран Б, Браун А.М., Бедард П.Л., Винквист Э, Госс Г.Д., Хотте С.Дж., Велч С.А., Хирте Х.В., Чжан Т., Штейн Л.Д. , Ферретти В., Ватт С, Цзяо В., Нг К., Гай С., Шоу П., Петрочелли. Т., Хадсон Т.Дж. , Нил Б.Г., Онетто Н., Сиу Л.Л., Макферсон Д.Д., Камел-Рид С., Дэнси Дж. Э. (1 января 2012 г.). «Возможность секвенирования в реальном времени генов рака следующего поколения, связанных с ответом на лекарства: результаты клинических испытаний» . Int. J. Рак . 132 (7): 1547–55. DOI : 10.1002 / ijc.27817 . PMID 22948899 . S2CID 72705 .  (требуется подписка)
  83. ^ Мюррей И.А., Кларк Т.А., Морган Р.Д., Бойтано М., Антон Б.П., Луонг К., Фоменков А., Тернер С.В., Корлах Дж., Робертс Р.Дж. (2 октября 2012 г.). «Метиломы шести бактерий» . Исследования нуклеиновых кислот . 40 (22): 11450–62. DOI : 10.1093 / NAR / gks891 . PMC 3526280 . PMID 23034806 .  
  84. ^ "Ion 520 & Ion 530 ExT Kit-Chef - Thermo Fisher Scientific" . www.thermofisher.com .
  85. ^ "Архивная копия" . Архивировано из оригинала на 30 марта 2018 года . Проверено 29 марта 2018 .CS1 maint: archived copy as title (link)
  86. ↑ van Vliet AH (1 января 2010 г.). «Секвенирование следующего поколения микробных транскриптомов: проблемы и возможности» . Письма о микробиологии FEMS . 302 (1): 1–7. DOI : 10.1111 / j.1574-6968.2009.01767.x . PMID 19735299 . 
  87. ^ "BGI и MGISEQ" . en.mgitech.cn . Проверено 5 июля 2018 .
  88. ^ а б Хуан Ю.Ф., Чен С.К., Чан Ю.С., Чен Т.Х., Чиу КП (2012). «Палиндромная последовательность препятствует механизму секвенирования путем лигирования» . BMC Systems Biology . 6 Приложение 2: S10. DOI : 10.1186 / 1752-0509-6-S2-S10 . PMC 3521181 . PMID 23281822 .  
  89. ^ Свободный, Мэтью; Ракьян, Вардхман; Холмс, Надин; Пейн, Александр (3 мая 2018 г.). «Наблюдение за китами с BulkVis: графический просмотрщик для файлов Oxford Nanopore bulk fast5». bioRxiv 10.1101 / 312256 . 
  90. ^ «Продажи PacBio начинают расти по мере того, как компания расширяет возможности продукта» .
  91. ^ "Био-IT Мир" . www.bio-itworld.com .
  92. ^ "PacBio запускает высокопроизводительную и недорогую систему секвенирования одной молекулы" .
  93. Перейти ↑ Clarke J, Wu HC, Jayasinghe L, Patel A, Reid S, Bayley H (апрель 2009 г.). «Непрерывная идентификация оснований для секвенирования одномолекулярных нанопор ДНК». Природа Нанотехнологии . 4 (4): 265–70. Bibcode : 2009NatNa ... 4..265C . DOI : 10.1038 / nnano.2009.12 . PMID 19350039 . 
  94. ^ a b dela Torre R, Larkin J, Singer A, Meller A (2012). «Изготовление и характеристика массивов твердотельных нанопор для высокопроизводительного секвенирования ДНК» . Нанотехнологии . 23 (38): 385308. Bibcode : 2012Nanot..23L5308D . DOI : 10.1088 / 0957-4484 / 23/38/385308 . PMC 3557807 . PMID 22948520 .  
  95. ^ а б Патхак Б., Лофас Х, Прасонгкит Дж., Григорьев А, Ахуджа Р., Шайхер Р. Х. (2012). «Double-функционализированные нанопористых встраиваемый золотые электроды для быстрого секвенирования ДНК» . Письма по прикладной физике . 100 (2): 023701. Bibcode : 2012ApPhL.100b3701P . DOI : 10.1063 / 1.3673335 .
  96. ^ Корлах Дж, Маркс П.Дж., Цицерон Р.Л., Грей Дж.Дж., Мерфи Д.Л., Ройтман Д.Б., Фам Т.Т., Отто Г.А., Фокет М., Тернер С.В. «Селективная пассивация алюминием для направленной иммобилизации одиночных молекул ДНК-полимеразы в волноводных наноструктурах с нулевой модой» . Труды Национальной академии наук . 105 (4): 1176–81. Bibcode : 2008PNAS..105.1176K . DOI : 10.1073 / pnas.0710982105 . PMC 2234111 . PMID 18216253 .  
  97. ^ a b Шендуре Дж., Поррека Дж. Дж., Реппас Н. Б., Лин Х, МакКатчеон Дж. П., Розенбаум А. М., Ван М. Д., Чжан К., Митра Р. Д., Чёрч Г. М. (9 сентября 2005 г.) «Точное мультиплексное секвенирование полонии эволюционировавшего бактериального генома». Наука . 309 (5741): 1728–32. Bibcode : 2005Sci ... 309.1728S . DOI : 10.1126 / science.1117389 . PMID 16081699 . S2CID 11405973 .  
  98. ^ Bentley DR, Balasubramanian S и др. (2008). «Точное секвенирование всего человеческого генома с использованием химии обратимых терминаторов» . Природа . 456 (7218): 53–59. Bibcode : 2008Natur.456 ... 53В . DOI : 10,1038 / природа07517 . PMC 2581791 . PMID 18987734 .  
  99. ^ Канард В, С Sarfati (13 октября 1994 года), Новые производные , пригодные дл секвенировани нуклеиновых кислот , получены 9 марта +2016
  100. ^ Утка B, Sarfati RS (октябрь 1994). «Флуоресцентные субстраты ДНК-полимеразы с обратимыми 3'-метками». Джин . 148 (1): 1–6. DOI : 10.1016 / 0378-1119 (94) 90226-7 . PMID 7523248 . 
  101. ^ Mardis ER (2008). «Методы секвенирования ДНК нового поколения». Анну Рев Геном Хум Генет . 9 : 387–402. DOI : 10.1146 / annurev.genom.9.081307.164359 . PMID 18576944 . 
  102. ^ a b c Drmanac R, Sparks AB, Callow MJ, Halpern AL, Burns NL, Kermani BG и др. (Январь 2010 г.). «Секвенирование генома человека с использованием несвязанного основания считывает самособирающиеся наномассивы ДНК». Наука . 327 (5961): 78–81. Bibcode : 2010Sci ... 327 ... 78D . DOI : 10.1126 / science.1181498 . PMID 19892942 . S2CID 17309571 .  
  103. ^ brandonvd. «О нас - полная геномика» . Полная геномика . Проверено 2 июля 2018 .
  104. ^ а б Хуанг Дж, Лян Х, Сюань И, Гэн Ц, Ли И, Лу Х и др. (Май 2017). «Эталонный набор данных генома человека секвенатора BGISEQ-500» . GigaScience . 6 (5): 1–9. DOI : 10,1093 / gigascience / gix024 . PMC 5467036 . PMID 28379488 .  
  105. ^ Valouev А, Итикава Дж, Tonthat T, Стюарт J, S, Ranade Пекхам H, K, Zeng Malek JA, Коста - G, K, Маккернан Sidow A, A, пожарной Johnson SM (июль 2008 г.). «Карта положения нуклеосом C. elegans с высоким разрешением показывает отсутствие универсального позиционирования, определяемого последовательностью» . Genome Res . 18 (7): 1051–63. DOI : 10.1101 / gr.076463.108 . PMC 2493394 . PMID 18477713 .  
  106. Перейти ↑ Rusk N (2011). «Торренты последовательности». Нат методы . 8 (1): 44. DOI : 10.1038 / nmeth.f.330 . S2CID 41040192 . 
  107. ^ a b Drmanac R, Sparks AB и др. (2010). «Секвенирование генома человека с использованием считываний несвязанных оснований в самосборных ДНК-нанометрах». Наука . 327 (5961): 78–81. Bibcode : 2010Sci ... 327 ... 78D . DOI : 10.1126 / science.1181498 . PMID 19892942 . S2CID 17309571 .  
  108. ^ Porreca GJ (2010). «Секвенирование генома на наношарах». Природа Биотехнологии . 28 (1): 43–44. DOI : 10.1038 / nbt0110-43 . PMID 20062041 . S2CID 54557996 .  
  109. ^ Complete Genomics Прессрелиз 2010
  110. ^ «Система секвенирования генов / генетического анализатора HeliScope: Helicos BioSciences» . 2 ноября 2009 года Архивировано из оригинала 2 ноября 2009 года.
  111. ^ Томпсон JF, Steinmann KE (октябрь 2010). Секвенирование отдельной молекулы с помощью системы генетического анализа HeliScope . Текущие протоколы в молекулярной биологии . Глава 7. С. Unit7.10. DOI : 10.1002 / 0471142727.mb0710s92 . ISBN 978-0471142720. PMC  2954431 . PMID  20890904 .
  112. ^ "Техническое объяснение tSMS SeqLL" . SeqLL. Архивировано из оригинала 8 -го августа 2014 года . Дата обращения 9 августа 2015 .
  113. ^ Хизер, Джеймс М .; Цепь, Бенджамин (январь 2016 г.). «Последовательность секвенаторов: история секвенирования ДНК» . Геномика . 107 (1): 1–8. DOI : 10.1016 / j.ygeno.2015.11.003 . ISSN 1089-8646 . PMC 4727787 . PMID 26554401 .   
  114. ^ Сара Эль-Метвали; Усама М. Уда; Мохамед Хельми (2014). «Новые горизонты в секвенировании следующего поколения». Технологии секвенирования нового поколения и проблемы сборки последовательностей . Технологии секвенирования следующего поколения и проблемы сборки последовательностей, Springer Briefs in Systems Biology Volume 7 . SpringerBriefs по системной биологии. 7 . С. 51–59. DOI : 10.1007 / 978-1-4939-0715-1_6 . ISBN 978-1-4939-0714-4.
  115. ^ a b Ярмарка РБ, Хлыстов А., Портной Т.Д., Иванов В., Эванс Р.Д., Сринивасан В., Памула В.К., Поллак М.Г., Гриффин ПБ, Чжоу Дж. (январь 2007 г.). «Химические и биологические применения цифровых микрофлюидных устройств». IEEE Design & Test of Computers . 24 (1): 10–24. CiteSeerX 10.1.1.559.1440 . DOI : 10,1109 / MDT.2007.8 . ЛВП : 10161/6987 . S2CID 10122940 .  
  116. ^ а б Боулс Д.И., Бентон Дж. Л., Сью Дж. Дж., Леви М. Х., Твар П. К., Сандал М. А. и др. (Ноябрь 2011 г.). «Пиросеквенирование капель с использованием цифровой микрофлюидики» . Аналитическая химия . 83 (22): 8439–47. DOI : 10.1021 / ac201416j . PMC 3690483 . PMID 21932784 .  
  117. ^ Zilionis R, Nainys Дж, Верес А, Савовой В, D Заммур, Клейн А.М., Mazutis л (январь 2017 г.). «Штрих-кодирование одной клетки и секвенирование с использованием капельной микрофлюидики». Протоколы природы . 12 (1): 44–73. DOI : 10.1038 / nprot.2016.154 . PMID 27929523 . S2CID 767782 .  
  118. ^ "Гарвардская группа нанопор" . Mcb.harvard.edu. Архивировано из оригинального 21 февраля 2002 года . Проверено 15 ноября 2009 года .
  119. ^ «Секвенирование нанопор может сократить расходы на анализ ДНК» .
  120. ^ Патент США 20060029957 , ZS Генетика, «Система и методы анализа кислотных полимеров нуклеиновых и связанные с ними компоненты», выдаются 2005-07-14 
  121. ^ Xu M, Fujita D, Hanagata N (декабрь 2009). «Перспективы и проблемы новых технологий секвенирования одномолекулярной ДНК». Маленький . 5 (23): 2638–49. DOI : 10.1002 / smll.200900976 . PMID 19904762 . 
  122. ^ Schadt EE, Turner S, Kasarskis A (2010). «Окно в секвенирование третьего поколения» . Молекулярная генетика человека . 19 (R2): R227–40. DOI : 10,1093 / HMG / ddq416 . PMID 20858600 . 
  123. Перейти ↑ Xu M, Endres RG, Arakawa Y (2007). «Электронные свойства основ ДНК». Маленький . 3 (9): 1539–43. DOI : 10.1002 / smll.200600732 . PMID 17786897 . 
  124. ^ Di Ventra M (2013). «Быстрое секвенирование ДНК электрическими средствами на несколько дюймов ближе» . Нанотехнологии . 24 (34): 342501. Bibcode : 2013Nanot..24H2501D . DOI : 10.1088 / 0957-4484 / 24/34/342501 . PMID 23899780 . 
  125. ^ Ohshiro Т, Мацубар К, Цуцуй М, Furuhashi М, Танигучите М, Kawai Т (2012). «Электрическое случайное переупорядочение одной молекулы ДНК и РНК» . Sci Rep . 2 : 501. Bibcode : 2012NatSR ... 2E.501O . DOI : 10.1038 / srep00501 . PMC 3392642 . PMID 22787559 .  
  126. ^ Ханна ГДж, Джонсон В. А., Kuritzkes ДР, Richman ДД, Мартинес-Пикадо Дж, Саттон л, Хейзелвуд JD, D'Aquila РТ (1 июля 2000 года). «Сравнение секвенирования посредством гибридизации и циклического секвенирования для генотипирования обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека типа 1» . J. Clin. Microbiol . 38 (7): 2715–21. DOI : 10.1128 / JCM.38.7.2715-2721.2000 . PMC 87006 . PMID 10878069 .  
  127. ^ a b Морей М., Фернандес-Мармиесс А., Кастиньейрас Д., Фрага Дж. М., Куш М. Л., Кочо Дж. А. (2013). «Взгляд в прошлое, настоящее и будущее секвенирования ДНК». Молекулярная генетика и метаболизм . 110 (1–2): 3–24. DOI : 10.1016 / j.ymgme.2013.04.024 . PMID 23742747 . 
  128. Перейти ↑ Qin Y, Schneider TM, Brenner MP (2012). Гибас С (ред.). «Секвенирование путем гибридизации длинных мишеней» . PLOS ONE . 7 (5): e35819. Bibcode : 2012PLoSO ... 735819Q . DOI : 10.1371 / journal.pone.0035819 . PMC 3344849 . PMID 22574124 .  
  129. ^ Эдвардса JR, Ruparel Н, Ю. J (2005). «Масс-спектрометрическое секвенирование ДНК». Мутационные исследования . 573 (1–2): 3–12. DOI : 10.1016 / j.mrfmmm.2004.07.021 . PMID 15829234 . 
  130. ^ Холл Т.А., Бадоул Б., Цзян Ю., Блин Л., Эшу М., Саннес-Лоури К.А., Сампат Р., Дрейдер Дж. Дж., Ханнис Дж. К., Харрелл П., Самант В., Уайт Н., Эккер Д. Д., Хофстадлер С. А. (2005) «Анализ основного состава митохондриальной ДНК человека с использованием масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением: новый инструмент для идентификации и дифференциации людей». Аналитическая биохимия . 344 (1): 53–69. DOI : 10.1016 / j.ab.2005.05.028 . PMID 16054106 . 
  131. ^ Ховард Р., Энчева В., Томсон Дж., Бач К., Чан Ю. Т., Коуэн С., Дебенхэм П., Диксон А., Краузе Дж. Ю, Кришан Е., Мур Д., Мур В., Оджо М., Родригес С., Стокс П., Уокер Дж., Циммерманн W, Barallon R (15 июня 2011 г.). «Сравнительный анализ митохондриальной ДНК человека из образцов костей времен Первой мировой войны с помощью секвенирования ДНК и масс-спектрометрии ESI-TOF». Международная судебная медицина: генетика . 7 (1): 1–9. DOI : 10.1016 / j.fsigen.2011.05.009 . PMID 21683667 . 
  132. ↑ Monforte JA, Becker CH (1 марта 1997 г.). «Высокопроизводительный анализ ДНК методом времяпролетной масс-спектрометрии». Природная медицина . 3 (3): 360–62. DOI : 10.1038 / nm0397-360 . PMID 9055869 . S2CID 28386145 .  
  133. ^ Берес С.Б., Кэрролл Р.К., Ши PR, Ситкевич I, Мартинес-Гутьеррес JC, Низкий DE, МакГир А, Вилли Б.М., Грин К, Тиррелл Г.Дж., Голдман Т.Д., Фелдгарден М., Биррен Б.В., Фофанов Ю., Боос Дж., Уитон В.Д. , Honisch C, Musser JM (8 февраля 2010 г.). «Молекулярная сложность последовательных бактериальных эпидемий, деконволютированных сравнительной патогеномикой» . Труды Национальной академии наук . 107 (9): 4371–76. Bibcode : 2010PNAS..107.4371B . DOI : 10.1073 / pnas.0911295107 . PMC 2840111 . PMID 20142485 .  
  134. ^ Kan CW, Fredlake CP, Doherty Е.А., Barron А.Е. (1 ноября 2004). «Секвенирование ДНК и генотипирование в миниатюрных системах электрофореза». Электрофорез . 25 (21–22): 3564–88. DOI : 10.1002 / elps.200406161 . PMID 15565709 . S2CID 4851728 .  
  135. ^ Chen YJ, Roller EE, Huang X (2010). «Секвенирование ДНК денатурацией: экспериментальное подтверждение концепции со встроенным жидкостным устройством» . Лаборатория на чипе . 10 (9): 1153–59. DOI : 10.1039 / b921417h . PMC 2881221 . PMID 20390134 .  
  136. ↑ Bell DC, Thomas WK, Murtagh KM, Dionne CA, Graham AC, Anderson JE, Glover WR (9 октября 2012 г.). «Идентификация оснований ДНК с помощью электронной микроскопии». Микроскопия и микроанализ . 18 (5): 1049–53. Bibcode : 2012MiMic..18.1049B . DOI : 10.1017 / S1431927612012615 . PMID 23046798 . 
  137. ^ Pareek CS, Smoczynski R, Tretyn A (ноябрь 2011). «Технологии секвенирования и секвенирование генома» . Журнал прикладной генетики . 52 (4): 413–35. DOI : 10.1007 / s13353-011-0057-х . PMC 3189340 . PMID 21698376 .  
  138. ^ Pareek CS, Smoczynski R, Tretyn A (2011). «Технологии секвенирования и секвенирование генома» . Журнал прикладной генетики . 52 (4): 413–35. DOI : 10.1007 / s13353-011-0057-х . PMC 3189340 . PMID 21698376 .  
  139. ^ Фуджимори S, Хираи Н, Охаши Н, Масуока К, Nishikimi А, Фукуи Y, Washio Т, Oshikubo Т, Т Ямашита, Миямото-Сато Е (2012). «Секвенирование нового поколения в сочетании с бесклеточной технологией отображения для высокопроизводительного получения надежных данных для взаимодействия» . Научные отчеты . 2 : 691. Bibcode : 2012NatSR ... 2E.691F . DOI : 10.1038 / srep00691 . PMC 3466446 . PMID 23056904 .  
  140. ^ Харберс M (2008). «Текущее состояние клонирования кДНК». Геномика . 91 (3): 232–42. DOI : 10.1016 / j.ygeno.2007.11.004 . PMID 18222633 . 
  141. ^ Альберти А., Белсер С., Энгелен С., Бертран Л., Орвен С., Бринас Л., Круод С. и др. (2014). «Сравнение методов подготовки библиотек показывает их влияние на интерпретацию метатранскриптомических данных» . BMC Genomics . 15 : 912–12. DOI : 10.1186 / 1471-2164-15-912 . PMC 4213505 . PMID 25331572 .  
  142. ^ «Масштабируемая оценка качества нуклеиновых кислот для подготовки библиотеки секвенирования нового поколения Illumina» (PDF) . Проверено 27 декабря 2017 года .
  143. ^ "Archon Genomics XPRIZE" . Archon Genomics XPRIZE .
  144. ^ «Информация о гранте» . Национальный институт исследования генома человека (NHGRI) .
  145. ^ Северин Дж, Lizio М, Харшбаргер Дж, Kawaji Н, Дауб СО, Хаясидзаки Y, Бертин N, Форрест АР (2014). «Интерактивная визуализация и анализ крупномасштабных наборов данных секвенирования с использованием ZENBU». Nat. Biotechnol . 32 (3): 217–19. DOI : 10.1038 / nbt.2840 . PMID 24727769 . S2CID 26575621 .  
  146. ^ Shmilovici А, Бен-Галь I (2007). «Использование модели VOM для реконструкции потенциальных кодирующих областей в последовательностях EST» (PDF) . Вычислительная статистика . 22 (1): 49–69. DOI : 10.1007 / s00180-007-0021-8 . S2CID 2737235 .  
  147. ^ Del Fabbro C, Scalabrin S, M Morgante Гиорги FM (2013). «Обширная оценка влияния обрезки считывания на анализ данных Illumina NGS» . PLOS ONE . 8 (12): e85024. Bibcode : 2013PLoSO ... 885024D . DOI : 10.1371 / journal.pone.0085024 . PMC 3871669 . PMID 24376861 .  
  148. ^ Мартин, Марсель (2 мая 2011 г.). «Cutadapt удаляет последовательности адаптеров из операций чтения с высокой пропускной способностью». EMBnet.journal . 17 (1): 10. DOI : 10,14806 / ej.17.1.200 .
  149. ^ Smeds L, Künstner A (19 октября 2011). «ConDeTri - зависимый от содержимого триммер чтения данных Illumina» . PLOS ONE . 6 (10): e26314. Bibcode : 2011PLoSO ... 626314S . DOI : 10.1371 / journal.pone.0026314 . PMC 3198461 . PMID 22039460 .  
  150. ^ Prezza Н, Дель Fabbro С, Вецци Ж, Де Паоли Е, Policriti А (2012). ERNE-BS5: Выравнивание обработанных BS последовательностей с помощью множественных ударов по 5-буквенному алфавиту . Материалы конференции ACM по биоинформатике, вычислительной биологии и биомедицине . 12 . С. 12–19. DOI : 10.1145 / 2382936.2382938 . ISBN 9781450316705. S2CID  5673753 .
  151. ↑ Шмидер Р., Эдвардс Р. (март 2011 г.). «Контроль качества и предварительная обработка наборов метагеномных данных» . Биоинформатика . 27 (6): 863–4. DOI : 10.1093 / биоинформатики / btr026 . PMC 3051327 . PMID 21278185 .  
  152. Перейти ↑ Bolger AM, Lohse M, Usadel B (август 2014). «Trimmomatic: гибкий триммер для данных последовательности Illumina» . Биоинформатика . 30 (15): 2114–20. DOI : 10.1093 / биоинформатики / btu170 . PMC 4103590 . PMID 24695404 .  
  153. Перейти ↑ Cox MP, Peterson DA, Biggs PJ (сентябрь 2010 г.). «SolexaQA: Краткая оценка качества данных секвенирования второго поколения Illumina» . BMC Bioinformatics . 11 (1): 485. DOI : 10,1186 / 1471-2105-11-485 . PMC 2956736 . PMID 20875133 .  
  154. ^ Мюррей TH (январь 1991). «Этические вопросы исследования генома человека». Журнал FASEB . 5 (1): 55–60. DOI : 10.1096 / fasebj.5.1.1825074 . PMID 1825074 . S2CID 20009748 .  
  155. ^ a b c Робертсон JA (август 2003 г.). «Геном за 1000 долларов: этические и юридические вопросы при секвенировании всего генома людей». Американский журнал биоэтики . 3 (3): W – IF1. DOI : 10.1162 / 152651603322874762 . PMID 14735880 . S2CID 15357657 .  
  156. ^ a b Хендерсон, Марк (9 сентября 2013 г.). «Секвенирование генома человека: настоящие этические дилеммы» . Хранитель . Дата обращения 20 мая 2015 .
  157. ↑ Хармон, Эми (24 февраля 2008 г.). «Страховые страхи заставляют многих избегать тестов ДНК» . Нью-Йорк Таймс . Дата обращения 20 мая 2015 .
  158. ↑ Заявление об административной политике , Исполнительная канцелярия президента, Управление и бюджет, 27 апреля 2007 г.
  159. ^ Национальный институт исследования генома человека (21 мая 2008 г.). «Президент Буш подписывает Закон о недискриминации в области генетической информации 2008 года» . Проверено 17 февраля 2014 года .
  160. ↑ Бейкер, Моня. «Комиссия по этике США сообщает о секвенировании ДНК и конфиденциальности» . Новый блог Nature . Дата обращения 20 мая 2015 .
  161. ^ «Конфиденциальность и прогресс в секвенировании всего генома» (PDF) . Президентская комиссия по изучению вопросов биоэтики. Архивировано из оригинального (PDF) 12 июня 2015 года . Дата обращения 20 мая 2015 .
  162. ^ ДНК в вашем мусоре: готово
  163. ^ Гольденберг AJ, Sharp RR (февраль 2012). «Этические опасности и программные проблемы геномного скрининга новорожденных» . JAMA . 307 (5): 461–2. DOI : 10,1001 / jama.2012.68 . PMC 3868436 . PMID 22298675 .  
  164. ↑ Хьюз, Вирджиния (7 января 2013 г.). «Пора перестать зацикливаться на опасности генетической информации» . Журнал Slate . Дата обращения 22 мая 2015 .
  165. ^ a b Bloss CS, Schork NJ, Topol EJ (февраль 2011 г.). «Эффект прямого геномного профилирования для оценки риска заболевания» . Медицинский журнал Новой Англии . 364 (6): 524–34. DOI : 10.1056 / NEJMoa1011893 . PMC 3786730 . PMID 21226570 .  
  166. ^ Rochman, Бонни (25 октября 2012). «Что ваш доктор не говорит вам о вашей ДНК» . Time.com . Дата обращения 22 мая 2015 .

Внешние ссылки [ править ]

Библиотечные ресурсы о
секвенировании ДНК
  • Ресурсы в вашей библиотеке
  • Ресурсы в других библиотеках
  • Wikibook на следующей последовательности поколения
  • Бесплатно дидактический справочник для анализа секвенирования ДНК.
  • Путь к последовательности ДНК: Жизнь и работа Fred Sanger
  • США Карта секвенсоры нового поколения