Гель-электрофорез в температурном градиенте
Гель-электрофорез в температурном градиенте ( TGGE ) и денатурирующий градиентный гель-электрофорез ( DGGE ) представляют собой формы электрофореза , в которых используется либо температурный, либо химический градиент для денатурации образца при его перемещении через акриламидный гель. TGGE и DGGE можно применять к нуклеиновым кислотам, таким как ДНК и РНК , и (реже) белкам. TGGE основан на температурно-зависимых изменениях структуры для разделения нуклеиновых кислот . DGGE разделяет гены одинакового размера на основе их разной денатурирующей способности, которая определяется их последовательностью пар оснований. DGGE был оригинальной техникой, а TGGE — ее усовершенствованием.
То же самое оборудование можно использовать для анализа белка , что впервые было сделано Томасом Э. Крейтоном из Лаборатории молекулярной биологии MRC , Кембридж, Англия. [4] Аналогично выглядящие паттерны создаются белками и нуклеиновыми кислотами, но фундаментальные принципы совершенно разные.
TGGE был впервые описан Тэтчер и Ходсоном [5] и Роджером Уортеллом из Технологического института Джорджии. Большую работу проделала группа Риснера в Германии. Коммерческое оборудование для DGGE можно приобрести у компаний Bio-Rad, INGENY и CBS Scientific; система для TGGE доступна от Biometra.
ДНК имеет отрицательный заряд и поэтому будет двигаться к положительному электроду в электрическом поле. Гель представляет собой молекулярную сетку с отверстиями примерно того же размера, что и диаметр нити ДНК. Когда приложено электрическое поле, ДНК начнет двигаться через гель со скоростью, примерно обратно пропорциональной длине молекулы ДНК (более короткие ДНК движутся быстрее) - это основа для разделения в зависимости от размера в стандартном электрофорезе . .
В TGGE также существует температурный градиент поперек геля. При комнатной температуре ДНК будет стабильно существовать в двухцепочечной форме. При повышении температуры нити начинают разделяться ( плавиться ), а скорость их движения через гель резко снижается. Критически важно, что температура, при которой происходит плавление, зависит от последовательности (пары оснований GC более стабильны, чем AT, из-за стекинговых взаимодействий, а не из-за разницы в водородных связях [ нужна ссылка ] (существует три водородных связи между парой оснований цитозина и гуанина ). , но только два между аденином и тимином )), поэтому TGGE обеспечивает«зависимый от последовательности и независимый от размера метод» разделения молекул ДНК. TGGE разделяет молекулы и дает дополнительную информацию о плавлении и стабильности (Biometra, 2000).
Денатурирующий градиентный гель-электрофорез (DGGE) работает путем нанесения небольшого образца ДНК (или РНК) на гель для электрофореза, содержащий денатурирующий агент. Исследователи обнаружили, что некоторые денатурирующие гели способны вызывать плавление ДНК на разных стадиях. В результате этого плавления ДНК распространяется по гелю и может быть проанализирована на отдельные компоненты, даже такие маленькие, как 200-700 пар оснований .
