Флуоресцентный микроскоп представляет собой оптический микроскоп , который использует флюоресценции вместо или в дополнение к нему рассеяния , отражения и затухания или поглощения , чтобы исследовать свойства органических или неорганических веществ. [1] [2] «Флуоресцентный микроскоп» относится к любому микроскопу, который использует флуоресценцию для создания изображения, будь то более простая установка, такая как эпифлуоресцентный микроскоп, или более сложная конструкция, такая как конфокальный микроскоп , в котором используется оптическое сечение для получить лучшее разрешение флуоресцентного изображения.[3]
Принцип [ править ]
Образец освещается светом определенной длины волны (или длин волн), который поглощается флуорофорами , заставляя их излучать свет с большей длиной волны (т. Е. Другого цвета, чем поглощенный свет). Освещающий свет отделяется от гораздо более слабой излучаемой флуоресценции с помощью спектрального эмиссионного фильтра. Типичными компонентами флуоресцентного микроскопа являются источник света (распространены ксеноновая дуговая лампа или ртутная лампа ; более совершенные формы - мощные светодиоды и лазеры ), фильтр возбуждения , дихроичное зеркало (или дихроичный светоделитель ) иэмиссионный фильтр (см. рисунок ниже). Фильтры и дихроичный светоделитель выбираются в соответствии со спектральными характеристиками возбуждения и излучения флуорофора, используемого для маркировки образца. [1] Таким образом, одновременно отображается распределение одного флуорофора (цвета). Многоцветные изображения нескольких типов флуорофоров необходимо составлять путем объединения нескольких одноцветных изображений. [1]
Большинство используемых флуоресцентных микроскопов - это эпифлуоресцентные микроскопы, в которых возбуждение флуорофора и обнаружение флуоресценции осуществляются через один и тот же световой путь (то есть через объектив). Эти микроскопы широко используются в биологии и являются основой для более совершенных конструкций микроскопов, таких как конфокальный микроскоп и флуоресцентный микроскоп полного внутреннего отражения (TIRF).
Эпифлуоресцентная микроскопия [ править ]
Большинство флуоресцентных микроскопов, особенно используемых в биологических науках , имеют эпифлуоресцентную конструкцию, показанную на диаграмме. Свет с длиной волны возбуждения освещает образец через объективную линзу. Флуоресценции , испускаемые образец фокусируются на детектор с помощью одной и тех же целей , который используется для возбуждения , который для разрешения большего потребуется объектив с более высокой числовой апертурой. Поскольку большая часть возбуждающего света проходит через образец, только отраженный возбуждающий свет достигает объектива вместе с испускаемым светом, и поэтому метод эпифлуоресценции дает высокое отношение сигнал / шум. Дихроичный светоделитель действует как фильтр для определенной длины волны, пропускающий флуоресцентный свет через окуляр или детектор, но отражающий оставшийся возбуждающий свет обратно к источнику.
Источники света [ править ]
Флуоресцентная микроскопия требует интенсивного, почти монохроматического освещения, которое не могут обеспечить некоторые широко распространенные источники света, такие как галогенные лампы . [4] Используются четыре основных типа источников света, в том числе ксеноновые дуговые лампы или ртутные лампы с фильтром возбуждения , лазеры , источники суперконтинуума и мощные светодиоды . Лазеры наиболее широко используются для более сложных методов флуоресцентной микроскопии, таких как конфокальная микроскопия и флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения, в то время как ксеноновые лампы, ртутные лампы и светодиоды с дихроичнойвозбуждающий фильтр обычно используется для широкопольных эпифлуоресцентных микроскопов. Поместив две решетки микролинз на путь освещения широкопольного эпифлуоресцентного микроскопа [5], можно достичь очень однородного освещения с коэффициентом вариации 1-2%.
Подготовка образца [ править ]
Отображает наложения с четырех флуоресцентных каналов
(b) Голубой: [флуоресценция PLL-A546] - общий контрастный краситель для визуализации поверхностей эукариотических клеток
(c) Синий: [флуоресценция Hoechst] - окрашивает ДНК, идентифицирует ядра
(d) Красный: [автофлуоресценция хлорофилла] - рассасывает хлоропласты [6]
Чтобы образец подходил для флуоресцентной микроскопии, он должен быть флуоресцентным. Есть несколько методов создания флуоресцентного образца; основные методы маркировки с флуоресцентными пятнами , или, в случае биологических образцов, экспрессии в виде флуоресцентного белка . В качестве альтернативы может использоваться собственная флуоресценция образца (например, автофлуоресценция ). [1] В биологических науках флуоресцентная микроскопия является мощным инструментом, позволяющим специфическое и чувствительное окрашивание образца для обнаружения распределения белков или других интересующих молекул. В результате существует широкий спектр методов флуоресцентного окрашивания биологических образцов.
Биологические флуоресцентные пятна [ править ]
Многие флуоресцентные красители были разработаны для ряда биологических молекул. Некоторые из них представляют собой небольшие молекулы, которые по своей природе флуоресцентны и связывают интересующую биологическую молекулу. Основными примерами из них являются окрашивания нуклеиновых кислот, такие как DAPI и Hoechst (возбуждаемые УФ-светом) и DRAQ5 и DRAQ7 (оптимально возбуждаемые красным светом), которые связывают малую бороздку ДНК , маркируя, таким образом, ядра клеток. Другие - лекарства, токсины или пептиды, которые связывают определенные клеточные структуры и были модифицированы с помощью флуоресцентного репортера. Основным примером этого класса флуоресцентных красителей является фаллоидин , который используется для окрашивания актина.волокна в клетках млекопитающих . Новый пептид, известный как пептид гибридизации коллагена , также можно конъюгировать с флуорофорами и использовать для окрашивания денатурированных волокон коллагена. Окрашивание стенок растительных клеток осуществляется красителями или красителями, связывающими целлюлозу или пектин . Поиски флуоресцентных зондов с высокой специфичностью, которые также позволяют получать изображения растительных клеток в реальном времени, продолжаются. [7]
Существует множество флуоресцентных молекул, называемых флуорофорами или флуорохромами, таких как флуоресцеин , Alexa Fluors или DyLight 488 , которые могут быть химически связаны с другой молекулой, которая связывает интересующую мишень в образце.
Иммунофлуоресценция [ править ]
Иммунофлуоресценция - это метод, который использует высокоспецифичное связывание антитела с его антигеном для мечения определенных белков или других молекул внутри клетки. Образец обрабатывают первичным антителом, специфичным для интересующей молекулы. Флуорофор можно напрямую конъюгировать с первичным антителом. В качестве альтернативы можно использовать вторичное антитело , конъюгированное с флуорофором, которое специфически связывается с первым антителом. Например, первичное антитело, вырабатываемое у мышей, которое распознает тубулин, в сочетании с вторичным антимышиным антителом, дериватизированным с флуорофором, можно использовать для мечения микротрубочек в клетке.
Флуоресцентные белки [ править ]
Современное понимание генетики и доступных методов модификации ДНК позволяет ученым генетически модифицировать белки, чтобы они также несли флуоресцентный белок-репортер. В биологических образцах это позволяет ученому непосредственно сделать интересующий белок флуоресцентным. Затем можно напрямую отслеживать местоположение белка, в том числе в живых клетках.
Ограничения [ править ]
Флуорофоры теряют способность к флуоресценции, когда они освещаются в процессе, называемом фотообесцвечиванием . Фотообесцвечивание происходит, когда флуоресцентные молекулы накапливают химические повреждения от электронов, возбужденных во время флуоресценции. Фотообесцвечивание может сильно ограничить время, в течение которого образец можно наблюдать с помощью флуоресцентной микроскопии. Существует несколько методов уменьшения фотообесцвечивания, таких как использование более надежных флуорофоров, минимизация освещения или использование фотозащитных химикатов- поглотителей .
Флуоресцентная микроскопия с использованием флуоресцентных репортерных белков позволила анализировать живые клетки с помощью флуоресцентной микроскопии, однако клетки чувствительны к фототоксичности, особенно при использовании коротковолнового света. Кроме того, флуоресцентные молекулы имеют тенденцию генерировать химически активные химические вещества при освещении, что усиливает фототоксический эффект.
В отличие от методов микроскопии в проходящем и отраженном свете, флуоресцентная микроскопия позволяет наблюдать только определенные структуры, помеченные как флуоресцентные. Например, наблюдение за образцом ткани, приготовленным с флуоресцентным окрашиванием ДНК, с помощью флуоресцентной микроскопии показывает только организацию ДНК внутри клеток и ничего не говорит о морфологии клеток.
Методы субдифракции [ править ]
Волновая природа света ограничивает размер пятна, в которое может быть сфокусирован свет из-за дифракционного предела . Это ограничение было описано в XIX веке Эрнстом Аббе и «ограничивает разрешение оптического микроскопа примерно половиной длины волны используемого света». Флуоресцентная микроскопия занимает центральное место во многих методах, которые стремятся преодолеть этот предел с помощью специализированных оптических конфигураций.
В 20-м веке были изобретены несколько усовершенствований в методах микроскопии, которые в некоторой степени привели к увеличению разрешения и контрастности. Однако они не преодолели дифракционный предел. В 1978 году были разработаны первые теоретические идеи по преодолению этого барьера с использованием 4Pi микроскопа в качестве конфокального лазерного сканирующего флуоресцентного микроскопа, в котором свет идеально фокусируется со всех сторон в общий фокус, который используется для сканирования объекта «точка за- точечное возбуждение в сочетании с обнаружением «точка за точкой». [8] Однако первая экспериментальная демонстрация микроскопа 4pi состоялась в 1994 году. [9] Микроскопия 4Pi максимизирует количество доступных направлений фокусировки за счет использования двух противоположных линз объектива илимикроскопия с двухфотонным возбуждением с использованием света с красным смещением и многофотонного возбуждения.
Встроенная корреляционная микроскопия объединяет флуоресцентный микроскоп с электронным микроскопом. Это позволяет визуализировать ультраструктуру и контекстную информацию с помощью электронного микроскопа, используя данные флуоресцентного микроскопа в качестве инструмента маркировки. [10]
Первой техникой, которая действительно достигла субдифракционного разрешения, была STED-микроскопия , предложенная в 1994 году. Этот метод и все методы, следующие концепции RESOLFT, основаны на сильном нелинейном взаимодействии между светом и флуоресцирующими молекулами. Молекулы сильно движутся между различимыми молекулярными состояниями в каждом конкретном месте, так что, наконец, свет может испускаться только в небольшой части пространства, следовательно, повышенное разрешение.
Также в 1990-х годах был разработан другой метод микроскопии сверхвысокого разрешения, основанный на широко-полевой микроскопии. Существенно улучшенное разрешение по размеру клеточных наноструктур, окрашенных флуоресцентным маркером, было достигнуто за счет развития микроскопии локализации SPDM и структурированного лазерного освещения (пространственно-модулированное освещение, SMI). [11] Сочетание принципа SPDM с SMI привело к разработке микроскопа Vertico SMI . [12] [13] Одномолекулярное обнаружение нормально мигающих флуоресцентных красителей, таких как зеленый флуоресцентный белок.(GFP) может быть достигнута за счет дальнейшего развития SPDM, так называемой технологии SPDMphymod, которая позволяет обнаруживать и подсчитывать два разных типа флуоресцентных молекул на молекулярном уровне (эта технология называется двухцветной микроскопией локализации или 2CLM. ). [14]
С другой стороны, появление фотоактивированной микроскопии с локализацией могло бы дать аналогичные результаты, полагаясь на мигание или переключение отдельных молекул, где доля флуоресцирующих молекул в каждый момент времени очень мала. Этот стохастический отклик молекул на приложенный свет также соответствует сильно нелинейному взаимодействию, ведущему к субдифракционному разрешению.
Галерея флуоресцентных микрофотографий [ править ]
Z-проекция клетки остеосаркомы, окрашенная фаллоидином для визуализации актиновых нитей. Изображение было снято на конфокальном микроскопе, а последующая деконволюция была выполнена с использованием экспериментально полученной функции рассеяния точки.
Эпифлуоресцентное изображение трех компонентов делящейся раковой клетки человека. ДНК окрашена в синий цвет, белок под названием INCENP - в зеленый, а микротрубочки - в красный цвет. Каждый флуорофор визуализируется отдельно с использованием различной комбинации фильтров возбуждения и излучения, и изображения снимаются последовательно с помощью цифровой камеры CCD , а затем накладываются друг на друга, чтобы получить полное изображение.
Эндотелиальные клетки под микроскопом. Ядра окрашены в синий цвет с помощью DAPI, микротрубочки помечены зеленым цветом по антителу, связанному с FITC, а филаменты актина помечены красным цветом с фаллоидином, связанным с TRITC. Эндотелиальные клетки легочной артерии крупного рогатого скота (BPAE)
Двухцветная трехмерная микроскопия сверхвысокого разрешения с Her2 и Her3 в клетках молочной железы, стандартные красители: Alexa 488, Alexa 568. Микроскопия LIMON
Ядро лимфоцитов человека, окрашенное DAPI, с гибридизацией центромерного зонда 13 (зеленый) и 21 (красный) хромосомы ( флуоресцентная гибридизация in situ (FISH))
Мембрана дрожжевых клеток визуализируется некоторыми мембранными белками, слитыми с флуоресцентными маркерами RFP и GFP. Наложение света от обоих маркеров приводит к желтому цвету.
Микроскопия сверхвысокого разрешения: обнаружение одной молекулы YFP в раковой клетке человека. Типичные измерения расстояний в диапазоне 15 нм, измеренные с помощью микроскопа Vertico-SMI / SPDMphymod
Микроскопия сверхвысокого разрешения: Совместная локализационная микроскопия (2CLM) с белками слияния GFP и RFP (ядро клетки рака кости) 120 000 локализованных молекул в широкой области (470 мкм 2 ), измеренной с помощью микроскопа Vertico-SMI / SPDMphymod
Флуоресцентная микроскопия экспрессии ДНК в области человеческого дикого типа и мутантного P239S Палладина .
На изображениях с помощью флуоресцентной микроскопии патологии солнечных бликов в клетке крови пораженные участки показаны красным цветом.
См. Также [ править ]
- Флуоресцентная визуализация
- Флуоресценция в науках о жизни
- Корреляционная свето-электронная микроскопия
- Элизабет Гарри , пионер методов флуоресцентной микроскопии для визуализации бактериальных субклеточных белков
- Зеленый флуоресцентный белок (GFP)
- Лампа ртутно-паровая
- Микроскоп
- Сканирующий электронный микроскоп # Катодолюминесценция
- Стоксов сдвиг
- Ксеноновая дуговая лампа
Ссылки [ править ]
- ^ а б в г Весна KR, Дэвидсон MW. «Введение в флуоресцентную микроскопию» . Nikon MicroscopyU . Проверено 28 сентября 2008 года .
- ^ "Флуоресцентный микроскоп" . Микроскопы - помогите ученым исследовать скрытые миры . Нобелевский фонд . Проверено 28 сентября 2008 года .
- ^ Хуан Карлос Штокерт, Альфонсо Бласкес-Кастро (2017). Флуоресцентная микроскопия в науках о жизни . Издательство Bentham Science. ISBN 978-1-68108-519-7. Проверено 17 декабря 2017 года .
- ↑ Хуан Б. (март 2010 г.). «Флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения» . Ежегодный обзор биохимии. DOI : 10.1146 / annurev.biochem.77.061906.092014 . PMC 2835776 . PMID 19489737 . Проверено 29 сентября 2020 . Цитировать журнал требует
|journal=( помощь ) - ^ FAW Coumans; Э. ван дер Поль; LWMM Terstappen (2012). «Плоский профиль освещения в эпифлуоресцентном микроскопе с помощью двух массивов микролинз» . Цитометрии Часть A . 81 (4): 324–331. DOI : 10.1002 / cyto.a.22029 . PMID 22392641 . S2CID 13812696 .
- ^ Колин, С., Коэльо, Л.П., Сунагава, С., Боулер, К., Карсенти, Э., Борк, П., Пепперкок, Р. и Де Варгас, К. (2017) "Количественное трехмерное изображение клеток биология и экология экологических микробных эукариот ». eLife , 6 : e26066. DOI : 10.7554 / eLife.26066.002 .Материал был скопирован из этого источника, который доступен по международной лицензии Creative Commons Attribution 4.0 .
- ^ Бидхенди, AJ; Chebli, Y; Гайтманн, А (май 2020 г.). «Визуализация флуоресценции целлюлозы и пектина в первичной клеточной стенке растений». Журнал микроскопии . 278 (3): 164–181. DOI : 10.1111 / jmi.12895 . PMID 32270489 .
- ^ Кремер, C; Кремер Т. (1978). «Соображения по поводу лазерного сканирующего микроскопа с высоким разрешением и глубиной резкости» (PDF) . Microscopica Acta . 81 (1): 31–44. PMID 713859 .
- ^ SW Ад, EHK Stelzer, С. Линдек, К. Кремер; Штельцер; Линдек; Кремер (1994). «Конфокальная микроскопия с увеличенной апертурой обнаружения: конфокальная микроскопия типа B 4Pi». Письма об оптике . 19 (3): 222–224. Bibcode : 1994OptL ... 19..222H . CiteSeerX 10.1.1.501.598 . DOI : 10.1364 / OL.19.000222 . PMID 19829598 . CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
- ^ Baarle, Кейтлин ван. «Корреляционная микроскопия: открытие мира информации с помощью флуоресценции» . Проверено 16 февраля 2017 года .
- ^ Хаусманн, Майкл; Шнайдер, Бернхард; Брадл, Иоахим; Кремер, Кристоф Г. (1997), «Высокоточная дистанционная микроскопия трехмерных наноструктур с помощью флуоресцентного микроскопа с пространственно модулированным возбуждением» (PDF) , в Bigio, Irving J; Шнекенбургер, Герберт; Славик, Ян; и другие. (ред.), Оптическая биопсия и микроскопические методы II , Оптическая биопсия и микроскопические методы II, 3197 , стр. 217, DOI : 10,1117 / 12,297969 , S2CID 49339042
- ^ Рейманн, J; Баддели, Д.; Гункель, М; Lemmer, P; Стадтер, Вт; Jegou, T; Риппе, К; Cremer, C; Бирк, У (2008). «Высокоточный структурный анализ субъядерных комплексов в фиксированных и живых клетках с помощью микроскопии с пространственно модулированным освещением (SMI)» (PDF) . Хромосомные исследования . 16 (3): 367–82. DOI : 10.1007 / s10577-008-1238-2 . PMID 18461478 . S2CID 22811346 .
- ^ Baddeley, D; Батрам, C; Вейланд, Y; Cremer, C; Бирк, UJ (2003). «Наноструктурный анализ с использованием микроскопии с пространственно модулированным освещением» (PDF) . Протоколы природы . 2 (10): 2640–6. DOI : 10.1038 / nprot.2007.399 . PMID 17948007 . S2CID 22042676 . [ мертвая ссылка ]
- ^ Гункель, М; Erdel, F; Риппе, К; Lemmer, P; Кауфманн, Р. Hörmann, C; Amberger, R; Кремер, С. (2009). «Двухцветная локализационная микроскопия клеточных наноструктур» (PDF) . Биотехнологический журнал . 4 (6): 927–38. DOI : 10.1002 / biot.200900005 . PMID 19548231 . S2CID 18162278 .
Внешние ссылки [ править ]
 | Викискладе есть медиафайлы, связанные с флуоресцентной микроскопией . |
| Библиотечные ресурсы по флуоресцентной микроскопии |
|
- Fluorophores.org [ постоянная мертвая ссылка ] , база данных флуоресцентных красителей
- Ресурсный центр по микроскопии
- анимации и пояснения к различным типам микроскопов, включая флуоресцентные и конфокальные микроскопы (Université Paris Sud)
