Из Википедии, свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Анализ расплава с высоким разрешением ( HRM ) - это мощный метод в молекулярной биологии для обнаружения мутаций , полиморфизмов и эпигенетических различий в образцах двухцепочечной ДНК . Он был открыт и разработан компанией Idaho Technology и Университетом Юты. [1] Он имеет преимущества перед другими технологиями генотипирования , а именно:

  • Это экономически выгодно по сравнению с другими технологиями генотипирования, такими как секвенирование и типирование TaqMan SNP. Это делает его идеальным для крупномасштабных проектов генотипирования.
  • Он быстрый и мощный, что позволяет быстро и точно генотипировать многие образцы.
  • Это просто. С помощью высококачественного HRM-анализа негенетики могут провести мощное генотипирование в любой лаборатории, имеющей доступ к HRM-аппарату для ПЦР в реальном времени.

Метод [ править ]

HRM-анализ выполняется на образцах двухцепочечной ДНК. Обычно пользователь будет использовать полимеразную цепную реакцию (ПЦР) перед HRM-анализом для амплификации участка ДНК, в котором находится его интересующая мутация. В пробирке с образцом теперь находится много копий интересующей области ДНК. Эта область, которая усиливается, известна как ампликон. После процесса ПЦР начинается HRM-анализ. Этот процесс представляет собой просто точное нагревание ДНК ампликона от примерно 50 ˚C до примерно 95 ˚C. В какой-то момент во время этого процесса достигается температура плавления ампликона, и две цепи ДНК разделяются или «плавятся».

Ключ к HRM - отслеживать это разделение цепочек в режиме реального времени. Это достигается с помощью флуоресцентного красителя. Красители, которые используются для HRM, известны как интеркалирующие красители и обладают уникальным свойством. Они специфически связываются с двухцепочечной ДНК, и когда они связаны, они ярко флуоресцируют. В отсутствие двухцепочечной ДНК им не с чем связываться, и они флуоресцируют только на низком уровне. В начале HRM-анализа в образце наблюдается высокий уровень флуоресценции из-за миллиардов копий ампликона. Но по мере того, как образец нагревается и две цепи ДНК расплавляются, присутствие двухцепочечной ДНК уменьшается, и, таким образом, уменьшается флуоресценция. В HRM-машине есть камера, которая наблюдает за этим процессом, измеряя флуоресценцию.Затем машина просто строит эти данные в виде графика, известного как кривая плавления, показывающего уровень флуоресценции в зависимости от температуры:

Сравнение кривых плавления [ править ]

Температура плавления ампликона, при которой две нити ДНК расходятся, вполне предсказуема. Это зависит от последовательности оснований ДНК. Если вы сравниваете два образца, полученные от двух разных людей, они должны дать кривую плавления точно такой же формы. Однако, если у одного человека есть мутация в области ДНК, которую вы амплифицировали, это изменит температуру, при которой цепи ДНК расплавляются. Итак, теперь две кривые плавления выглядят по-разному. Разница может быть лишь незначительной, возможно, доли градуса, но поскольку HRM-машина имеет возможность отслеживать этот процесс в «высоком разрешении», можно точно задокументировать эти изменения и, следовательно, определить, присутствует ли мутация или нет. .

Дикий тип, гетерозигота или гомозигота? [ редактировать ]

Все становится немного сложнее, чем это, потому что организмы содержат две ( или более ) копии каждого гена, известные как два аллеля . Таким образом, если образец взят у пациента и амплифицирован с помощью ПЦР, обе копии интересующей области ДНК (аллели) амплифицируются. Итак, если мы ищем мутацию, теперь есть три возможности:

  1. Ни один из аллелей не содержит мутации
  2. Тот или иной аллель содержит мутацию
  3. Оба аллеля содержат мутацию.

Эти три сценария известны как «Дикий тип», «Гетерозигота» или «Гомозигота» соответственно. Каждый дает кривую плавления, которая немного отличается. С помощью высококачественного анализа HRM можно различить все три сценария.

Гомозиготные аллельные варианты могут характеризоваться температурным сдвигом на полученной кривой плавления, полученной с помощью HRM-анализа. Для сравнения, гетерозиготы характеризуются изменением формы кривой плавления. Это происходит из-за несовпадения пар оснований, возникающего в результате дестабилизированного отжига гетеродуплекса между цепями дикого типа и вариантными цепями. Эти различия можно легко увидеть на полученной кривой плавления, а различия в профилях плавления между разными генотипами можно усилить визуально, построив кривую различия [2]

Приложения [ править ]

Типирование SNP / обнаружение точечных мутаций [ править ]

Обычные методы типирования SNP обычно трудоемки и дороги, требуя мультиплексирования нескольких анализов на основе зондов или использования микрочипов ДНК. HRM более экономичен и снижает необходимость в разработке нескольких пар праймеров и необходимости покупки дорогостоящих зондов. Метод HRM был успешно использован для обнаружения единственной замены G на A в гене Vssc (Voltage Sensitive Sodium Channel), который придает устойчивость к акарицидному перметрину у чесоточного клеща. Эта мутация приводит к изменению кодирования белка (G1535D). Анализ чесоточных клещей, собранных из популяций с подозрением на восприимчивость и толерантность к перметрину, с помощью HRM показал различные профили плавления. В ампликонахот чувствительных клещей наблюдалась более высокая температура плавления по сравнению с толерантными клещами, как и ожидалось из-за более высокой термостабильности пары оснований GC [3]

В области, более соответствующей клинической диагностике, было показано, что HRM в принципе подходит для обнаружения мутаций в генах предрасположенности к раку груди BRCA1 и BRCA2. В этих генах идентифицировано более 400 мутаций.
Секвенирование генов - золотой стандарт для выявления мутаций. Секвенирование занимает много времени и трудозатратно, и ему часто предшествуют методы, используемые для идентификации гетеродуплексной ДНК, которые затем еще больше усиливают эти проблемы. HRM предлагает более быстрый и удобный метод закрытой пробирки для оценки наличия мутаций и дает результат, который может быть дополнительно исследован, если он представляет интерес. В исследовании, проведенном Скоттом и соавт. в 2006 г. [4]3 клеточные линии, несущие различные мутации BRCA, были использованы для оценки методологии HRM. Было обнаружено, что профили плавления полученных продуктов ПЦР можно использовать для определения наличия или отсутствия мутации в ампликоне. Аналогичным образом в 2007 году Krypuy et al. [5]показали, что тщательный дизайн HRM-анализов (в отношении размещения праймеров) может быть успешно использован для обнаружения мутаций в гене TP53, который кодирует белок-супрессор опухоли p53 в клинических образцах рака груди и яичников. Оба этих исследования подчеркнули тот факт, что изменения в профиле плавления могут быть в форме сдвига температуры плавления или очевидного различия в форме кривой плавления. Оба эти параметра являются функцией последовательности ампликона. Все согласны с тем, что HRM - это рентабельный метод, который можно использовать в качестве начального скрининга образцов, подозреваемых в наличии полиморфизмов или мутаций. Это уменьшит количество образцов, которые необходимо исследовать более традиционными методами.

Zygosity testing [ править ]

В настоящее время существует множество методов определения зиготности.статус гена в определенном локусе. Эти методы включают использование ПЦР со специально разработанными зондами для обнаружения вариантов генов (простейшим случаем является типирование SNP). В случаях, когда речь идет о более длительных вариациях, может потребоваться анализ ампликонов после ПЦР. Изменения в ферментативном ограничении, электрофоретическом и хроматографическом профилях могут быть измерены. Эти методы обычно требуют больше времени и увеличивают риск заражения ампликонов в лаборатории из-за необходимости работать с высокими концентрациями ампликонов в лабораторных условиях после ПЦР. Использование HRM сокращает время, необходимое для анализа, и риск заражения. HRM - более экономичное решение, а элемент с высоким разрешением позволяет не только определять гомо- и гетерозиготность., он также разрешает информацию о типе гомо- и гетерозиготности, при этом разные варианты генов приводят к различным формам кривой плавления. Исследование Gundry et al. 2003, [6] показали , что флуоресцентные маркировки одного праймера (в паре) было показано, что благоприятно по сравнению с использованием интеркалирующего красителя , такие как SYBR Green I . Однако был достигнут прогресс в разработке и использовании улучшенных интеркалирующих красителей [7], которые уменьшают проблему ингибирования ПЦР и опасения по поводу ненасыщающей интеркаляции красителя.

Эпигенетика [ править ]

Методология HRM также использовалась для обеспечения надежного анализа статуса метилирования ДНК. Это важно, поскольку изменения статуса метилирования генов-супрессоров опухолей, генов, регулирующих апоптоз и репарацию ДНК, являются характеристиками рака, а также имеют значение для ответа на химиотерапию. Например, больные раком могут быть более чувствительны к лечению ДНК-алкилирующими агентами, если промотор гена репарации ДНК MGMT пациента метилирован. В исследовании, которое проверяло статус метилирования промотора MGMT на 19 образцах толстой кишки, было обнаружено, что 8 образцов метилированы. [8] В другом исследовании сравнивалась предсказательная силаМетилирование промотора MGMT у 83 пациентов с глиомой высокой степени злокачественности, полученное методами MSP , пиросеквенирования и HRM. Было обнаружено, что метод HRM по крайней мере эквивалентен пиросеквенированию при количественном определении уровня метилирования. [9]

Метилированную ДНК можно обработать би-сульфитной модификацией, которая превращает неметилированные цитозины в урацил . Следовательно, продукты ПЦР, полученные из матрицы, которая изначально была неметилированной, будут иметь более низкую температуру плавления, чем продукты, полученные из метилированной матрицы. HRM также предлагает возможность определения доли метилирования в данном образце путем сравнения ее со стандартной кривой, которая создается путем смешивания различных соотношений метилированной и неметилированной ДНК. Это может предоставить информацию о степени метилирования, которое может иметь опухоль, и, таким образом, дать представление о характере опухоли и о том, насколько далеко она отклоняется от того, что является «нормальным».

HRM также практически полезен для использования в диагностике из-за его способности адаптироваться к высокопроизводительным скрининговым тестам, и, опять же, он сводит к минимуму возможность распространения ампликонов и контаминации в лаборатории благодаря своему формату закрытой пробирки.

Интеркалирующие красители [ править ]

Для отслеживания перехода дцДНК (двухцепочечной) в оцДНК (одноцепочечной) используются интеркалирующие красители. Эти красители демонстрируют дифференциальную флуоресценцию в зависимости от их ассоциации с двухцепочечной или одноцепочечной ДНК. SYBR Green I - краситель первого поколения для HRM. Он флуоресцирует при интеркаляции в дцДНК, а не в оцДНК. Поскольку он может ингибировать ПЦР при высоких концентрациях, он используется при концентрациях ниже уровня насыщения. В последнее время некоторые исследователи не одобряют использование SYBR Green I для HRM [10], утверждая, что требуются существенные модификации протокола. Это связано с тем, что предполагается, что отсутствие точности может быть результатом "прыжка красителя", когда краситель из расплавленного дуплекса может повторно включиться в области дцДНК, которые еще не расплавились. [6][10] Новые насыщающие красители, такие как LC Green и LC Green Plus, ResoLight, EvaGreen, Chromofy и SYTO 9, доступны на рынке и успешно используются для HRM. Однако некоторые группы успешно использовали SYBR Green I для HRM с инструментами Corbett Rotorgene [11] и выступают за использование SYBR Green I для HRM приложений.

Дизайн экспериментов по плавлению с высоким разрешением [ править ]

Анализы плавления с высоким разрешением обычно включают амплификацию кПЦР с последующим построением кривой плавления с использованием флуоресцентного красителя. Из-за чувствительности анализа плавления с высоким разрешением необходимо тщательно учитывать условия цикла ПЦР, качество ДНК-матрицы и параметры кривой плавления. [12] Для получения точных и воспроизводимых результатов необходимо оптимизировать условия термоциклирования ПЦР, чтобы гарантировать, что желаемый участок ДНК амплифицируется с высокой специфичностью и минимальным смещением между вариантами последовательностей. Кривая плавления обычно строится в широком диапазоне температур небольшими (~ 0,3 ° C) приращениями, которых достаточно (~ 10 секунд) для того, чтобы ДНК достигла равновесия на каждом температурном шаге.

В дополнение к типичным грунтовочных конструктивных соображений, дизайн праймеров для анализов плавления с высокой разрешающей способностью включает в себя максимально термодинамические различия между продуктами ПЦР , принадлежащими к различным генотипов. Меньшие ампликоны обычно дают большее изменение температуры плавления, чем более длинные ампликоны, но изменчивость нельзя предсказать на глаз. По этой причине очень важно точно предсказать кривую плавления продуктов ПЦР при разработке праймеров, которые будут различать варианты последовательностей. Специальное программное обеспечение, такое как uMelt [13] и DesignSignatures , [14] , доступно для помощи в разработке праймеров, которые максимально увеличивают вариабельность кривой плавления, особенно для анализов плавления с высоким разрешением.

См. Также [ править ]

  • Конструктор маяков
  • Анализ кривой плавления

Ссылки [ править ]

  1. ^ Для академического изучения истории HRM см. Http://www.dna.utah.edu/Hi-Res/TOP_Hi-Res%20Melting.html
  2. ^ S Taylor et al., 2010. Практическое руководство по генотипированию анализа расплава с высоким разрешением. BioRad Tech Note 6004.
  3. ^ Пасайте С, АРЛИАН л, Морган М., и др. (Март 2008 г.). «Анализ расплава с высоким разрешением для обнаружения мутации, связанной с устойчивостью к перметрину в популяции чесоточных клещей». Med. Вет. Энтомол . 22 (1): 82–8. DOI : 10.1111 / j.1365-2915.2008.00716.x . PMID  18380658 .
  4. ^ Джеймс П.А., Доэрти Р., Харрис М. и др. (Февраль 2006 г.). «Оптимальный отбор людей для тестирования мутации BRCA: сравнение доступных методов» . J. Clin. Онкол . 24 (4): 707–15. DOI : 10.1200 / JCO.2005.01.9737 . PMID 16446345 . 
  5. ^ Krypuy МЫ, Ахмед А. А., Etemadmoghadam D и др. (2007). «Плавление с высоким разрешением для сканирования мутаций 5-8 экзонов TP53» . BMC Рак . 7 : 168. DOI : 10.1186 / 1471-2407-7-168 . PMC 2025602 . PMID 17764544 .  
  6. ^ a b Gundry CN, Vandersteen JG, Reed GH, Pryor RJ, Chen J, Wittwer CT (март 2003 г.). «Анализ плавления ампликона с помеченными праймерами: метод закрытой пробирки для дифференциации гомозигот и гетерозигот» . Clin. Chem . 49 (3): 396–406. DOI : 10.1373 / 49.3.396 . PMID 12600951 . 
  7. ^ Виттвер CT, Рид GH, Gundry CN, Vandersteen JG, Прайор RJ (июнь 2003). «Генотипирование с высоким разрешением с помощью анализа плавления ампликонов с использованием LCGreen» . Clin. Chem . 49 (6 Pt 1): 853–60. DOI : 10.1373 / 49.6.853 . PMID 12765979 . 
  8. ^ Wojdacz Т.К., Dobrovic A (2007). «Чувствительное к метилированию плавление с высоким разрешением (MS-HRM): новый подход к чувствительной и высокопроизводительной оценке метилирования» . Nucleic Acids Res . 35 (6): e41. DOI : 10.1093 / NAR / gkm013 . PMC 1874596 . PMID 17289753 .  
  9. ^ Switzeny, Olivier J .; Кристманн, Маркус; Ренованц, Мирьям; Гизе, Альф; Соммер, Клеменс; Каина, Бернд (05.05.2016). «Метилирование промотора MGMT, определенное с помощью HRM в сравнении с MSP и пиросеквенированием для прогнозирования ответа глиомы высокой степени» . Клиническая эпигенетика . 8 : 49. DOI : 10,1186 / s13148-016-0204-7 . ISSN 1868-7083 . PMC 4858829 . PMID 27158275 .   
  10. ^ a b Рид Г. Х., Кент Дж. О., Виттвер, Коннектикут (июнь 2007 г.). «Анализ плавления ДНК с высоким разрешением для простой и эффективной молекулярной диагностики». Фармакогеномика . 8 (6): 597–608. DOI : 10.2217 / 14622416.8.6.597 . PMID 17559349 .  как PDF
  11. ^ Pornprasert S, Phusua А, Suanta S, R Saetung, Sanguansermsri Т (июнь 2008 г.). «Обнаружение альфа-талассемии-1 типа Юго-Восточной Азии с использованием гэп-ПЦР в реальном времени с SYBR Green1 и анализа плавления с высоким разрешением». Евро. J. Haematol . 80 (6): 510–4. CiteSeerX 10.1.1.509.2403 . DOI : 10.1111 / j.1600-0609.2008.01055.x . PMID 18284625 .  
  12. ^ Монтгомери JL, Sanford Л.Н., Виттвер CT (2010). «Анализ плавления ДНК высокого разрешения в клинических исследованиях и диагностике». Эксперт Rev Mol Diagn . 10 (2): 219–240. DOI : 10,1586 / erm.09.84 . PMID 20214540 . 
  13. ^ Дуайт Z, R Пале, Виттвер CT (2011). «uMELT: прогнозирование кривых плавления с высоким разрешением и динамических профилей плавления продуктов ПЦР в многофункциональном веб-приложении» . Биоинформатика . 27 (7): 1019–1020. DOI : 10.1093 / биоинформатики / btr065 . PMID 21300699 . 
  14. ^ Райт Е.С., Vetsigian КН (2016). «DesignSignatures: инструмент для разработки праймеров, которые дают ампликоны с различными сигнатурами» . Биоинформатика . 32 (10): 1565–1567. DOI : 10.1093 / биоинформатики / btw047 . PMID 26803162 . 

Внешние ссылки [ править ]

  • HRM технологии