Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

ПЦР с горячим стартом - это модифицированная форма обычной полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая снижает присутствие нежелательных продуктов и димеров праймеров из-за неспецифической амплификации ДНК при комнатной (или более низкой) температуре. [1] [2] Поскольку результаты ПЦР очень полезны, было разработано множество вариантов и модификаций процедуры для достижения более высоких выходов, ПЦР с горячим стартом является одной из них. [3] ПЦР с горячим стартом следует тем же принципам, что и обычная ПЦР - в ней используется ДНК-полимераза для синтеза ДНК из одноцепочечной матрицы, [4] однако используются дополнительные методы нагрева и разделения, такие как инактивация или ингибирование связывания. изПолимераза Taq и позднее добавление полимеразы Taq для увеличения выхода продукта, а также обеспечения более высокой специфичности и чувствительности. [5] Неспецифическое связывание и праймирование или образование димеров праймеров сводятся к минимуму за счет завершения реакционной смеси после денатурации [6] Некоторые способы завершения реакционной смеси при высоких температурах включают модификации, которые блокируют активность ДНК-полимеразы при низких температурах, [1] [ 7] использование модифицированных дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (dNTP) [8] и физическое добавление одного из основных реагентов после денатурации. [9]Результаты этой процедуры имеют множество применений как в медицине, так и в промышленности. Например, приложения ПЦР, включая судебную экспертизу, тестирование отцовства, биологическую защиту, клонирование, обнаружение мутаций, генетическое тестирование и секвенирование ДНК. [10]

Благодаря этим дополнительным методам ПЦР с горячим стартом может уменьшить количество неспецифических амплификаций, которые естественным образом возникают при более низких температурах, что остается проблемой для традиционной ПЦР. Эти модификации работают в целом, чтобы гарантировать, что определенные ферменты в растворе останутся неактивными или будут подавлены до тех пор, пока не будет достигнута оптимальная температура отжига. [10] Подавление образования неспецифических продуктов ПЦР, особенно на ранних этапах, приводит к значительному увеличению чувствительности обнаружения с помощью ПЦР. Это чрезвычайно важно для диагностических приложений ПЦР или ОТ-ПЦР.

Фон [ править ]

Методика традиционной полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это метод молекулярной биологии , используемый для амплификации определенных сегментов ДНК на несколько порядков. Конкретные сегменты ДНК амплифицируются в ходе трех процессов: денатурации, отжига и удлинения - при этом цепи ДНК разделяются путем повышения температуры до оптимальной от комнатной до того, как праймеры свяжутся и полимераза выровняет нуклеотиды с цепью матрицы. Он использует ДНК-полимеразу , которая малоактивна при низких температурах. [1] В обычной ПЦР реакционная смесь завершается при комнатной температуре, и из-за активности ДНК-полимеразы праймеры могут образовывать димеры праймеров.или неспецифический отжиг с ДНК. Во время процедуры ПЦР ДНК-полимераза будет расширять любой фрагмент ДНК связанными праймерами, генерируя целевые продукты, а также неспецифические продукты, которые снижают выход. В ПЦР с горячим стартом некоторые реагенты хранятся отдельно до тех пор, пока смесь не нагреется до определенной температуры отжига. Это сокращает время отжига, что, в свою очередь, снижает вероятность неспецифического удлинения ДНК и влияние неспецифического связывания праймера до денатурации. [6] [5]

В традиционной ПЦР более низкие температуры ниже оптимальной температуры отжига (50-65 ° C) приводят к модификациям вне мишени, таким как неспецифические амплификации, при которых праймеры неспецифично связываются с нуклеиновой кислотой. [5] Эти неспецифические комплексы праймеров, которые присутствуют в избытке в смеси, являются причиной синтеза побочных продуктов, таких как димер праймера и неправильное праймирование. [10] Неправильное праймирование сильно затрудняет и снижает эффективность ПЦР-амплификации из-за активной конкуренции с целевыми последовательностями за амплификацию. Точно так же димеры праймеров образуют комплексы, которые уменьшают количество полученных амплификаций числа копий. [10]Это можно контролировать с помощью ПЦР с горячим стартом, которая позволяет блокировать удлинения праймера до достижения оптимальных температур. [2]

В ПЦР с горячим стартом предотвращается взаимодействие важных реагентов (таких как ДНК-полимераза и кофакторы магния ) в смеси для ПЦР до достижения оптимальных температур посредством физического разделения или химических модификаций. [5] [2] ПЦР с горячим стартом также может происходить, когда Taq-полимераза ингибируется / инактивирована или ее добавление задерживается до достижения оптимальных температур отжига, посредством модификаций дезоксирибонуклеотидтрифосфата или путем модификации праймеров посредством манипуляции с клетками и вторичной структурой .

Горячий старт ПЦР часто является лучшим подходом в отличие от традиционной ПЦР в условиях , когда существует недостаток ДНК в реакционной смеси (> 10 4 копий), ДНК - матрица является очень сложным , или если есть несколько пар олигонуклеотидных праймеров в ПЦР . [3]

Методы [ править ]

ПЦР против ПЦР с горячим стартом: сравнение ПЦР с ПЦР с горячим стартом путем демонстрации их методов и результирующего продукта ПЦР на геле.

ПЦР с горячим стартом - это метод, который предотвращает удлинение ДНК-полимеразы при более низкой температуре, чтобы предотвратить неспецифическое связывание и минимизировать потерю урожая. ПЦР с горячим стартом снижает количество неспецифического связывания за счет ограничивающих реагентов до стадий нагрева ПЦР - ограничивает реакцию на ранней стадии, ограничивая ДНК-полимеразу Taq в реакции. Неспецифическое связывание часто приводит к димерам праймеров и ошибочно примированным / ложно примированным мишеням. [11] Их можно исправить модифицированными методами, такими как:

Инактивация / ингибирование ДНК-полимеразы Taq [ править ]

Ферментно-связанные антитела / ДНК-полимераза Taq в комплексе с антителами к ДНК-полимеразе Taq:

Антитела, связанные с ферментом, инактивируют ДНК-полимеразу Taq. Антитела связываются и связываются с полимеразой, предотвращая раннюю амплификацию ДНК, которая может происходить при более низких температурах. Как только будет достигнута оптимальная температура отжига, антитела начнут разлагаться и диссоциировать, высвобождая ДНК-полимеразу Taq в реакцию и позволяя начать процесс амплификации. [2] [12] ДНК-полимераза Platinum Taq и ДНК-полимераза AccuStart Taq (обе разработаны Аюбом Раштчианом из Life Technologies и Quanta BioSciences, соответственно) являются примерами коммерчески доступных ДНК-полимераз Taq на основе антител с горячим запуском. Эти ДНК-полимеразы Taq предварительно соединены со смесью моноклональных антител, специфичных к ДНК-полимеразе Taq. [13]

Восковые бусины:

Физический барьер создается между ДНК-полимеразой Taq и остальными компонентами ПЦР с помощью шариков воска, которые зависят от температуры. Когда температура поднимается выше 70 ° C, во время стадии денатурации в первом цикле восковая гранула плавится, позволяя ДНК-полимеразе Taq выйти за барьер и высвободиться в реакцию - запуск процесса амплификации. Затем восковой слой перемещается к верхней части реакционной смеси во время стадии амплификации, чтобы позже действовать как пароизоляция. [2]

Высокоспецифичные олигонуклеотиды:

Олигонуклеотиды - это короткие полимеры нуклеиновой кислоты, которые легко связываются. Высокоспецифичные олигонуклеотиды, такие как аптамеры, связываются с ДНК-полимеразой Taq при более низких температурах, что делает ее неактивной в смеси. Только при более высоких температурах олигонуклеотиды отделяются от Taq, позволяя ему реагировать. [5]

Это наиболее эффективные методы для ПЦР с горячим стартом, методы с использованием ферментно-связанных антител и высокоспецифичных олигонуклеотидов, в частности, наиболее подходят во время процедур, требующих более короткого времени инактивации. [14] Однако известны и другие методы, такие как:

Позднее добавление ДНК-полимеразы Taq [ править ]

Предварительный нагрев:

Аппарат для ПЦР нагревается заранее, в то время как компоненты смешиваются на льду, а затем сразу же помещается в аппарат для ПЦР, когда он достигает оптимальной температуры. Это устранит необходимый процесс разогрева, уменьшит неспецифический отжиг праймеров и обеспечит разделение любых пропущенных пар праймеров в смеси. [15]

Замораживание:

Замораживание действует как форма физического разделения, как и восковые шарики. Реакционную смесь, содержащую праймеры, матричную цепь, воду и дезоксирибонуклеотидтрифосфат (dNTP), замораживают перед полимеразой Taq, а остальные компоненты ПЦР добавляют поверх замороженной смеси. Это предотвращает неспецифическое связывание. [15]

Позднее добавление Taq:

Компоненты ПЦР в реакционной смеси готовят и нагревают без добавления Taq. Taq вводится в смесь только после достижения оптимальной температуры. Однако этот метод наименее надежен и может привести к загрязнению компонентов. [15]

Другой метод - это опосредованная дезоксирибонуклеотидтрифосфатом ПЦР с горячим стартом, которая модифицирует нуклеотидные основания через защитную группу.

Модификации дезоксирибонуклеотидтрифосфата (dNTP) [ править ]

Горячий старт dNTP может быть химически модифицирован для включения термочувствительной защитной группы на 3 основных концах. Эта модификация предотвратит взаимодействие нуклеотидов с полимеразой Taq для связывания с цепью-матрицей до тех пор, пока не будут достигнуты оптимальные температуры, поэтому защитная группа будет удалена во время стадии тепловой активации. Горячие dNTP, dA, dT, dC и dG заменяют природные нуклеотиды. [16] [17] Рекомендуется использовать все четыре модифицированных нуклеотида, однако предыдущие исследования показали, что замены одного или двух природных нуклеотидов на модифицированные dNTP было бы достаточно для предотвращения неспецифической амплификации. [16] [17]Другая химическая модификация нуклеиновой кислоты - это термообратимая ковалентная модификация, которая препятствует гибридизации праймеров с интересующей матрицей. Аминогруппа гуанозина взаимодействует с глиоксалем с образованием dG. [18]

Модифицированные праймеры [ править ]

Вторичный состав:

Определенная вторичная структура может препятствовать работе праймеров. Например, олигонуклеотиды со структурой шпильки не могут эффективно действовать как праймер. Однако после нагревания реакционной смеси до температуры отжига праймер претерпит изменение конформации, позволяя праймеру вместо этого образовывать линейную структуру, что позволяет праймеру прикрепиться к целевому сегменту и начать ПЦР. [19] [20]

Фотохимически снимаемые клетки:

Клеточная группа, которая является фотохимически удаляемой защитной группой, такая как заключенные в каркас тимидинфосфорамидиты, включается в олигонуклеотидный праймер. Это позволяет активировать и деактивировать функцию праймера с помощью УФ-излучения (365 нм). Следовательно, праймеры можно активировать после достижения температуры отжига. [21]

Контролируемое добавление магния [ править ]

Магний необходим в ПЦР и действует как кофактор, поскольку полимераза Taq зависит от магния. [22] Повышение концентрации магния и фосфата до стандартных буферных реагентов приводит к образованию осадка магния , обеспечивая горячий старт реакции, так как магний для ДНК-полимеразы отсутствует до стадии термоциклирования. Во время термоциклирования магний снова растворяется в растворе и становится доступным для использования полимеразой, позволяя ей нормально функционировать. [23]

Преимущества [ править ]

Преимущество ПЦР с горячим стартом состоит в том, что она требует меньшего обращения и снижает риск контаминации. ПЦР с горячим стартом может быть химически модифицирована или основана на антителах, что обеспечивает различные преимущества данной процедуры. В химически модифицированной ПЦР с горячим стартом процедуру можно проводить при комнатной температуре, и она значительно снижает образование димеров праймеров, предотвращая связывание праймеров друг с другом до начала процесса ПЦР, а также ограничивая неспецифическое праймирование. Точно так же ПЦР с горячим стартом ингибирует связывание праймеров с матричными последовательностями, которые имеют низкую гомологию, что приводит к ошибочному запуску. Он также может улучшить специфичность и чувствительность из-за жестких условий, а также увеличить выход продукта целевого фрагмента. [5]В ПЦР с горячим стартом на основе антител полимераза активируется после начальной стадии денатурации во время цикла, что сокращает необходимое время. Это также приводит к высокой специфичности . [14]

Ограничения [ править ]

Наряду со своими преимуществами, ПЦР с горячим стартом также имеет ограничения, которые необходимо учитывать перед реализацией метода. ПЦР с горячим стартом требует добавления тепла в течение более длительных периодов времени, чем обычная ПЦР, поэтому матричная ДНК более подвержена повреждению. Увеличенное время нагревания также означает, что процедура несовместима с некоторыми процедурами, такими как метод обратной транскрипции-ПЦР с одной пробиркой и одним буфером, который требует более низкой температуры для прохождения стадии обратной транскрипции. [12] В химически модифицированной ПЦР с горячим стартом процесс амплификации ДНК может быть негативно затронут, во-первых, из-за значительного увеличения времени реактивации, необходимого для активации полимеразы, а во-вторых, если длина целевой ДНК-матрицы слишком велика. [14]В процедурах на основе антител для каждого фермента требуются разные антитела, и поэтому стоимость выполнения процедуры выше [15]

Ссылки [ править ]

  1. ^ a b c Sharkey DJ, Scalice ER, Christy KG, Atwood SM, Daiss JL (май 1994). «Антитела как термолабильные переключатели: высокотемпературный запуск полимеразной цепной реакции». Био / Технологии . 12 (5): 506–9. DOI : 10.1038 / nbt0594-506 . PMID  7764710 . S2CID  2885453 .
  2. ^ а б в г д Пол Н, Шум Дж, Ле Т (2010). «Горячий старт ПЦР». Протоколы ОТ-ПЦР . Методы молекулярной биологии. 630 . Humana Press. С. 301–18. DOI : 10.1007 / 978-1-60761-629-0_19 . ISBN 9781607616283. PMID  20301005 .
  3. ^ a b Грин, Майкл Р .; Самбрук, Джозеф (май 2018 г.). «Горячий старт полимеразной цепной реакции (ПЦР)». Протоколы Колд-Спринг-Харбор . 2018 (5): pdb.prot095125. DOI : 10,1101 / pdb.prot095125 . ISSN 1940-3402 . PMID 29717052 .  
  4. ^ Aryal, Сагар (2015-04-23). «Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - принцип, процедура, типы, применения и анимация» . Микробиология Info.com . Проверено 29 мая 2020 .
  5. ^ a b c d e f Birch DE (май 1996 г.). «Упрощенная ПЦР с горячим стартом». Природа . 381 (6581): 445–6. Bibcode : 1996Natur.381..445B . DOI : 10.1038 / 381445a0 . PMID 8632804 . S2CID 4267296 .  
  6. ^ a b van Pelt-Verkuil E, van Belkum A, Hays JP, ред. (2008). «Варианты и адаптации стандартного протокола ПЦР». Принципы и технические аспекты амплификации ПЦР . Springer Нидерланды. С. 231–276. DOI : 10.1007 / 978-1-4020-6241-4_12 . ISBN 9781402062414.
  7. ^ «Чем полезна технология горячего старта для вашего ПЦР» . Термофишер . Проверено 3 октября 2019 .
  8. ^ "DNTP - Школа биомедицинских наук Wiki" . training.ncl.ac.uk . Проверено 9 октября 2019 .
  9. ^ Coleman WB (2016). Диагностическая молекулярная патология . [Лондон]: Elsevier Academic Press. ISBN 9780128011577. OCLC  960448665 .
  10. ^ a b c d Лебедев, Александр В .; Пол, Наташа; Да, Джойклин; Тимощук Виктор А .; Шум, Джонатан; Мияги, Кей; Келлум, Джек; Hogrefe, Ричард I .; Зон, Джеральд (ноябрь 2008 г.). «Горячий старт ПЦР с активируемыми нагреванием праймерами: новый подход к повышению эффективности ПЦР» . Исследования нуклеиновых кислот . 36 (20): e131. DOI : 10.1093 / NAR / gkn575 . ISSN 1362-4962 . PMC 2582603 . PMID 18796527 .   
  11. ^ Кермекчиев, Милко Б .; Цеков Анатолий; Барнс, Уэйн М. (01.11.2003). «Чувствительные к холоду мутанты ДНК-полимеразы Taq обеспечивают горячий старт ПЦР» . Исследования нуклеиновых кислот . 31 (21): 6139–6147. DOI : 10.1093 / NAR / gkg813 . ISSN 0305-1048 . PMC 275455 . PMID 14576300 .   
  12. ^ a b Шенбруннер, Нэнси Дж; Гупта, Амар П.; Янг, Карен К.Ю .; Уилл, Стивен Дж. (2017-01-01). «Ковалентная модификация праймеров улучшает специфичность и выход ПЦР-амплификации» . Биологические методы и протоколы . 2 (1): bpx011. DOI : 10.1093 / biomethods / bpx011 . ISSN 2396-8923 . PMC 6994073 . PMID 32161793 .   
  13. ^ Westfall et.al. (1997), Focus 19.3, стр. 46.
  14. ^ a b c «Чем полезна технология горячего старта для вашего ПЦР - Австралия» . www.thermofisher.com . Проверено 29 мая 2020 .
  15. ^ a b c d "Что такое ПЦР с горячим стартом?" . Генетическое образование . 2019-03-03 . Проверено 29 мая 2020 .
  16. ^ a b Кухарева, Инна; Лебедев, Александр (15.06.2009). «3'-Защищенные 2'-дезоксинуклеозид-5'-трифосфаты как инструмент для инициируемой нагреванием активации полимеразной цепной реакции» . Аналитическая химия . 81 (12): 4955–4962. DOI : 10.1021 / ac8026977 . ISSN 0003-2700 . PMC 2712722 . PMID 19438248 .   
  17. ^ а б Кухарева, И .; Haoqiang, H .; Yee, J .; Shum, J .; Paul, N .; Хогрефе, Род-Айленд; Лебедев А.В. (01.09.2008). «Активируемые нагреванием 3'-модифицированные дНТФ: синтез и применение для ПЦР с горячим стартом» . Серия симпозиумов по нуклеиновым кислотам . 52 (1): 259–260. DOI : 10.1093 / насса / nrn131 . ISSN 0261-3166 . PMID 18776352 .  
  18. ^ [1] , «Обратимая химическая модификация нуклеиновых кислот и улучшенный метод гибридизации нуклеиновых кислот», выпущенный 2002-10-03 
  19. ^ Айленберг, М. и Сильверман, М., 2000-11-1, Контролируемый горячий старт и улучшенная специфичность при проведении ПЦР с использованием праймеров с ретушью и петлей (TULIPS), Biotechniques, 29 (5): 1018-1022, doi: 10.2144 / 00295st03, PMID: 11084864
  20. ^ Кабоев, ОК; Лучкина Л.А.; Третьяков АН; Бахрманд, АР (2000-11-01). «Горячий старт ПЦР с использованием праймеров со структурой молекулярных маяков (структура шпильки)» . Исследования нуклеиновых кислот . 28 (21): e94. DOI : 10.1093 / NAR / 28.21.e94 . ISSN 0305-1048 . PMC 113163 . PMID 11058144 .   
  21. ^ Янг, Дуглас Д .; Эдвардс, Уэсли Ф .; Lusic, Hrvoje; Живо, Марк О .; Дейтерс, Александр (10 января 2008 г.). «Полимеразная цепная реакция, запускаемая светом» . Химические коммуникации (4): 462–464. DOI : 10.1039 / B715152G . ISSN 1364-548X . PMC 3760149 . PMID 18188468 .   
  22. ^ Маркулатос, P .; Siafakas, N .; Монкани, М. (2002). «Мультиплексная полимеразная цепная реакция: практический подход» . Журнал клинического лабораторного анализа . 16 (1): 47–51. DOI : 10.1002 / jcla.2058 . ISSN 0887-8013 . PMC 6808141 . PMID 11835531 .   
  23. ^ Барнс, Уэйн М; Роулик, Кэтрин Р. (июнь 2002 г.). «Метод горячего старта осадка магния для ПЦР». Молекулярные и клеточные зонды . 16 (3): 167–171. DOI : 10.1006 / mcpr.2002.0407 . PMID 12219733 .