Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Микрофотография гистологического среза кожи человека, подготовленного для прямой иммунофлуоресценции с использованием антитела против IgA. Кожа пациента с пурпурой Геноха – Шенлейна : отложения IgA обнаруживаются в стенках мелких поверхностных капилляров (желтые стрелки). Бледно-волнистая зеленая область сверху - это эпидермис , нижняя фиброзная область - дерма .
Эти рисунки демонстрируют основной механизм иммунофлуоресценции. Первичная иммунофлуоресценция изображена слева, что показывает антитело со связанной с ним флуорофорной группой, напрямую связывающейся с эпитопом антигена, для которого оно специфично. Как только антитело связывается с эпитопом, образец можно рассматривать под флуоресцентным микроскопом, чтобы подтвердить присутствие антигена в образце. Напротив, вторичная иммунофлуоресценция изображена справа, что показывает, что сначала немаркированное первичное антитело связывается с эпитопом антигена по механизму, аналогичному описанному выше. Однако после связывания первичных антител со своей мишенью появляется вторичное антитело (помеченное флуорофором). Сайты связывания этого вторичного антитела специфичны для первичного антитела, которое уже связано с антигеном,и, следовательно, вторичное антитело связывается с первичным антителом. Этот метод позволяет большему количеству меченных флуорофором антител прикрепиться к их мишени, тем самым увеличивая флуоресцентный сигнал во время микроскопии.

Иммунофлуоресценция - это метод, используемый для световой микроскопии с помощью флуоресцентного микроскопа и используется в основном для микробиологических образцов. Этот метод использует специфичность антител к их антигену для нацеливания флуоресцентных красителей на конкретные биомолекулы- мишени внутри клетки и, следовательно, позволяет визуализировать распределение целевой молекулы в образце. Специфическая область, которую антитело распознает на антигене, называется эпитопом. [1]Были предприняты попытки картирования эпитопов, поскольку многие антитела могут связывать один и тот же эпитоп, а уровни связывания между антителами, распознающими один и тот же эпитоп, могут варьироваться. [2] Кроме того, связывание флуорофора с антителом само по себе не может влиять на иммунологическую специфичность антитела или связывающую способность его антигена. [3] Иммунофлуоресценция - широко используемый пример иммуноокрашивания (с использованием антител для окрашивания белков) и специфический пример иммуногистохимии (использование взаимосвязи антитело-антиген в тканях). В этом методе в основном используются флуорофоры для визуализации местоположения антител. [4]

Иммунофлуоресценция может использоваться на срезах тканей, культивируемых клеточных линиях или отдельных клетках и может использоваться для анализа распределения белков , гликанов и небольших биологических и небиологических молекул. Этот метод можно использовать даже для визуализации таких структур, как волокна среднего размера. [5] Если топология клеточной мембраны еще не определена, вставка эпитопа в белки может использоваться в сочетании с иммунофлуоресценцией для определения структур. [6]Иммунофлуоресценция также может использоваться как «полуколичественный» метод для понимания уровней и моделей локализации метилирования ДНК, поскольку это более трудоемкий метод, чем истинные количественные методы, и есть некоторая субъективность в анализе уровней метилирование. [7] Иммунофлуоресценцию можно использовать в сочетании с другими методами флуоресцентного окрашивания, не связанными с антителами, например, с использованием DAPI для мечения ДНК . Для анализа иммунофлуоресцентных образцов можно использовать несколько конструкций микроскопов; Самым простым из них является эпифлуоресцентный микроскоп , также широко используется конфокальный микроскоп . Различное супер-разрешениеМожно также использовать конструкции микроскопов с гораздо более высоким разрешением. [8]

Типы [ править ]

Микрофотография гистологического среза кожи человека, подготовленного для прямой иммунофлуоресценции с использованием антитела против IgG. Кожа пациента с системной красной волчанкой показывает отложения IgG в двух разных местах: первое - это отложение в виде ленты вдоль базальной мембраны эпидермиса («тест на волчанку» положительный). Второй - в ядрах эпидермальных клеток (антиядерные антитела).

Подготовка к флуоресценции [ править ]

Чтобы получить антитела, меченные флуорохромом, флуорохром должен быть конъюгирован («помечен») с антителом. Точно так же антиген также может быть конъюгирован с антителом с помощью флуоресцентного зонда с помощью метода, называемого методом флуоресцентного антигена. Процедуры окрашивания могут применяться как к фиксированным антигенам в цитоплазме, так и к антигенам клеточной поверхности живых клеток, что называется «иммунофлуоресценцией мембраны». Также возможно пометить комплемент комплекса антитело-антиген флуоресцентным зондом. В дополнение к элементу, к которому прикреплены флуоресцентные зонды, существует два основных класса иммунофлуоресцентных методов: первичные и вторичные. Следующие ниже описания будут сосредоточены в первую очередь на этих классах с точки зрения конъюгированных антител. [3]

Существует два класса иммунофлуоресцентных методов: первичные (или прямые) и вторичные (или непрямые).

Первичный (прямой) [ править ]

Первичная (прямая) иммунофлуоресценция использует одно первичное антитело, химически связанное с флуорофором . Первичное антитело распознает целевую молекулу (антиген) и связывается с определенной областью, называемой эпитопом. Это достигается с помощью процесса, который манипулирует иммунным ответом организма с помощью адаптивного иммунитета. Присоединенный флуорофор можно обнаружить с помощью флуоресцентной микроскопии, которая, в зависимости от используемого мессенджера, при возбуждении будет излучать свет определенной длины волны. [9] Прямая иммунофлюоресценция, хотя и встречается несколько реже, имеет заметные преимущества перед вторичной (непрямой) процедурой. Прямое прикрепление мессенджера к антителу сокращает количество этапов процедуры, экономя время и уменьшая неспецифический фоновый сигнал. [10]Это также ограничивает возможность перекрестной реактивности антител и возможных ошибок на протяжении всего процесса. Однако у этого метода есть некоторые недостатки. Поскольку количество флуоресцентных молекул, которые могут быть связаны с первичным антителом, ограничено, прямая иммунофлуоресценция существенно менее чувствительна, чем непрямая иммунофлуоресценция, и может давать ложноотрицательные результаты. Прямая иммунофлуоресценция также требует использования гораздо большего количества первичных антител, что чрезвычайно дорого, иногда до 400 долларов США / мл.

Вторичный (косвенный) [ править ]

Флуоресцентный краситель для актина в гладких мышцах кожи.

Вторичная (непрямая) иммунофлуоресценция использует два антитела; немеченое первое (первичное) антитело специфически связывает молекулу-мишень, а вторичное антитело, несущее флуорофор, распознает первичное антитело и связывается с ним. Множественные вторичные антитела могут связывать одно первичное антитело. Это обеспечивает усиление сигнала за счет увеличения количества молекул флуорофора на антиген. [10] Этот протокол является более сложным и трудоемким, чем первичный (или прямой) протокол, описанный выше, но обеспечивает большую гибкость, поскольку для данного первичного антитела можно использовать множество различных вторичных антител и методов обнаружения. [10]

Этот протокол возможен, потому что антитело состоит из двух частей: вариабельной области (которая распознает антиген) и константной области (которая составляет структуру молекулы антитела). Важно понимать, что это деление является искусственным, и на самом деле молекула антитела состоит из четырех полипептидных цепей: двух тяжелых цепей и двух легких цепей. Исследователь может создать несколько первичных антител, которые распознают различные антигены (имеют разные вариабельные области), но все имеют одну и ту же константную область. Следовательно, все эти антитела могут распознаваться одним вторичным антителом. Это экономит затраты на модификацию первичных антител для прямого переноса флуорофора.

Различные первичные антитела с разными константными областями обычно генерируются путем повышения уровня антител у разных видов. Например, исследователь может создать у козы первичные антитела, которые распознают несколько антигенов, а затем использовать связанные с красителем вторичные антитела кролика, которые распознают константную область козьих антител («кроличьи антикозьи» антитела). Затем исследователь может создать второй набор первичных антител у мыши, который может распознаваться отдельным вторичным антителом «ослиные антимышиные». Это позволяет повторно использовать сложные для изготовления антитела, связанные с красителем, в нескольких экспериментах.

Ограничения [ править ]

Как и в случае с большинством методов флуоресценции, значительной проблемой иммунофлуоресценции является фотообесцвечивание . Снижение активности, вызванное фотообесцвечиванием, можно контролировать, уменьшая или ограничивая интенсивность или продолжительность воздействия света, увеличивая концентрацию флуорофоров или используя более надежные флуорофоры, которые менее склонны к обесцвечиванию (например, Alexa Fluors , Seta Fluors , или DyLight Fluors). Некоторые проблемы, которые могут возникнуть при использовании этого метода, включают автофлуоресценцию, постороннюю нежелательную специфическую флуоресценцию и неспецифическую флуоресценцию. Автофлуоресценция включает флуоресценцию, испускаемую самой тканью или клеткой образца. Посторонняя нежелательная специфическая флуоресценция возникает, когда целевой антиген не чистый и содержит антигенные примеси. Неспецифическая флуоресценция связана с потерей специфичности зонда из-за флуорофора, из-за неправильной фиксации или из-за высохшего образца. [3]

Иммунофлуоресценция ограничивается только фиксированными (т. Е. Мертвыми) клетками, когда структуры внутри клетки должны быть визуализированы, потому что антитела не проникают через клеточную мембрану при реакции с флуоресцентными метками. Антигенный материал должен быть прочно закреплен на месте его естественной локализации внутри клетки. [3] Интактные антитела также могут быть слишком большими, чтобы окрашивать раковые клетки in vivo . [11] Их размер приводит к медленному проникновению в опухоль и длительному периоду полураспада. Было проведено исследование использования диател для обхода этого ограничения. [11]Белки в супернатанте или вне клеточной мембраны могут связываться антителами; это позволяет окрашивать живые клетки. В зависимости от используемого фиксатора, представляющие интерес белки могут стать перекрестно-связанными, и это может привести к ложноположительным или ложноотрицательным сигналам из-за неспецифического связывания.

Альтернативный подход заключается в использовании рекомбинантных белков, содержащих домены флуоресцентных белков, например зеленого флуоресцентного белка (GFP). Использование таких «меченых» белков позволяет определить их локализацию в живых клетках. Несмотря на то, что это кажется изящной альтернативой иммунофлуоресценции, клетки необходимо трансфицировать или трансдуктировать с помощью GFP-метки, и, как следствие, они становятся организмами, по крайней мере, S1 или выше, которые требуют более строгих стандартов безопасности в лаборатории. Этот метод включает изменение генетической информации клеток. [12]

Авансы [ править ]

Многие улучшения этого метода заключаются в улучшении флуоресцентных микроскопов и флуорофоров. Методы сверхвысокого разрешения обычно относятся к способности микроскопа обеспечивать разрешение ниже предела Аббе (предел, налагаемый на свет из-за его длины волны). Этот дифракционный предел составляет около 200-300 нм в поперечном направлении и 500-700 нм в осевом направлении. Этот предел сопоставим или больше, чем у некоторых структур в клетке, и, следовательно, этот предел не позволял ученым определить детали их структуры. [13] Сверхразрешение флуоресценции, в частности, относится к способности микроскопа предотвращать одновременную флуоресценцию соседних спектрально идентичных флуорофоров. [14]Этот процесс эффективно улучшает функцию рассеяния точки микроскопа. [13] Примеры недавно разработанных методов флуоресцентного микроскопа сверхвысокого разрешения включают микроскопию истощения с помощью стимулированного излучения (STED), микроскопию с насыщенным структурированным освещением (SSIM), микроскопию локализации флуоресцентной фотоактивации (FPALM) и микроскопию стохастической оптической реконструкции (STORM). [15]

См. Также [ править ]

  • Кожные заболевания по данным иммунофлуоресценции
  • Иммунохимия
  • Патч и укупорка

Ссылки [ править ]

  1. ^ Мандрелл, RE; Гриффисс, Дж. М.; Macher, BA (1988-07-01). «Липоолигосахариды (LOS) Neisseria gonorrhoeae и Neisseria meningitidis имеют компоненты, иммунохимически подобные предшественникам антигенов группы крови человека. Специфичность углеводной последовательности моноклональных антител мыши, которые распознают перекрестно реагирующие антигены на LOS и эритроцитах человека» . Журнал экспериментальной медицины . 168 (1): 107–126. DOI : 10.1084 / jem.168.1.107 . ISSN  0022-1007 . PMC  2188965 . PMID  2456365 .
  2. ^ Ladner, Роберт К. (2007-01-01). «Картирование эпитопов антител». Обзоры биотехнологии и генной инженерии . 24 (1): 1–30. CiteSeerX 10.1.1.536.6172 . DOI : 10.1080 / 02648725.2007.10648092 . ISSN 0264-8725 .  
  3. ^ a b c d Akiyoshi., Кавамура (1983-01-01). Иммунофлуоресценция в медицине: с 28 таб . Springer ua ISBN 978-3540124832. OCLC  643714056 .
  4. ^ «Иммунофлуоресценция» . Протокол онлайн .
  5. ^ Franke, WW; Schmid, E .; Осборн, М .; Вебер, К. (1978-10-01). «Различные волокна среднего размера, различимые с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 75 (10): 5034–5038. DOI : 10.1073 / pnas.75.10.5034 . ISSN 0027-8424 . PMC 336257 . PMID 368806 .   
  6. ^ Ван, Хунган; Ли, Ын-Ву; Цай, Сяокунь; Ни, Чжанлинь; Чжоу, Линь; Мао Цинчэн (30 декабря 2008 г.). «Мембранная топология белка устойчивости к раку молочной железы человека (BCRP / ABCG2), определяемая вставкой эпитопа и иммунофлуоресценцией» . Биохимия . 47 (52): 13778–13787. DOI : 10.1021 / bi801644v . ISSN 0006-2960 . PMC 2649121 . PMID 19063604 .   
  7. ^ Челик, Selcen (2015-01-01). «Понимание сложности восстановления антигена метилирования ДНК для измерения на основе иммунофлуоресценции и подход к решению проблемы». Журнал иммунологических методов . 416 : 1–16. DOI : 10.1016 / j.jim.2014.11.011 . PMID 25435341 . 
  8. ^ «Метод иммунофлуоресценции» . Дэвидсон-колледж.
  9. ^ «Методы иммуногистохимического окрашивания» (PDF) . Руководство IHC (Шестое изд.). Dako Denmark A / S, компания Agilent Technologies. 2013.
  10. ^ a b c Fritschy J, Härtig W (2001). Иммунофлуоресценция . eLS . DOI : 10.1038 / npg.els.0001174 .
  11. ^ а б Сонн Г.А., Бехеснилиан А.С., Цзян З.К., Зеттлиц К.А., Лепин Э.Дж., Бентолила Л.А., Ноулз С.М., Лоуренс Д., Ву А.М., Рейтер Р.Э. (2016). «Флуоресцентная хирургия под контролем изображения с диателом против антигена стволовых клеток простаты (PSCA) позволяет прицельную резекцию ксенотрансплантатов рака предстательной железы мыши в реальном времени» . Клинические исследования рака . 22 (6): 1403–12. DOI : 10.1158 / 1078-0432.CCR-15-0503 . PMC 4794340 . PMID 26490315 .  
  12. ^ Чалй, Martin (1995-10-01). «Зеленый флуоресцентный белок». Фотохимия и фотобиология . 62 (4): 651–656. DOI : 10.1111 / j.1751-1097.1995.tb08712.x . ISSN 1751-1097 . 
  13. ^ а б Хуанг, Бо; Бейтс, Марк; Чжуан, Сяовэй (02.06.2009). «Флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения» . Ежегодный обзор биохимии . 78 : 993–1016. DOI : 10.1146 / annurev.biochem.77.061906.092014 . PMC 2835776 . PMID 19489737 .  
  14. ^ 1959-, Диаспро, Альберто; Ван, Зандвоорт, Марк AMJ (2016-11-03). Визуализация сверхвысокого разрешения в биомедицине . ISBN 9781482244359. OCLC  960719686 .CS1 maint: числовые имена: список авторов ( ссылка )
  15. ^ Leung, Бонни O .; Чоу, Кенг К. (01.09.2011). "Обзор флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения для биологии" . Прикладная спектроскопия . 65 (9): 967–980. DOI : 10.1366 / 11-06398 . ISSN 0003-7028 . PMID 21929850 .  

Внешние ссылки [ править ]

  • Изображения, связанные с аутоиммунными заболеваниями в Университете Бирмингема
  • Протокол иммунофлуоресцентного окрашивания
  • Обзор в Davidson College
  • Иммунофлуоресценция в Национальной медицинской библиотеке США по медицинским предметным рубрикам (MeSH)
  • SynD - автоматическое обнаружение синапсов и нейритов на иммуно-флуоресцентных изображениях