В молекулярной биологии , вставка представляет собой фрагмент ДНК , который вставляется в большую ДНК вектор с помощью рекомбинантной ДНК - техники, таких , как лигирования или рекомбинации . Это позволяет его размножать, отбирать, дополнительно манипулировать или экспрессировать в организме-хозяине . [1]
Вставки могут варьироваться от добавления физических нуклеотидов с использованием технической системы до добавления искусственных структур в молекулу с помощью мутагенных химических веществ, таких как бромид этидия или кристаллы.
Вставки в геном организма обычно происходят по естественным причинам. Эти причины включают условия окружающей среды и внутриклеточные процессы. Вставки из окружающей среды варьируются от воздействия радиоактивного излучения, такого как ультрафиолет , мутагенных химикатов или ДНК-вирусов . Внутриклеточные вставки могут происходить из-за наследственных изменений в родительских клетках или ошибок в репликации ДНК или репарации ДНК .
Методы вставки генов можно использовать для характерных мутаций в организме для желаемой фенотипической экспрессии гена . Замена генной вставки может выражаться в большом количестве концов. Эти варианты могут варьироваться от потери или увеличения функции белка до изменений физической структуры, например цвета волос или глаз. Целью изменений в экспрессии является усиление функции белков для регуляции [2] или прекращение клеточной функции для предотвращения заболевания. [3] Результаты изменений зависят от места в геноме, в котором находится добавление или мутация. Цель состоит в том, чтобы изучить, понять и, возможно, предсказать выражение генетического материала в организмах с помощью физического и химического анализа. Чтобы увидеть результаты генетических мутаций или вставок, такие методы, как секвенирование ДНК , гель-электрофорез , иммуноанализ или микроскопия, позволяют наблюдать мутацию .
История
Эта область значительно расширилась с момента публикации в 1973 году биохимиков Стэнли Н. Коэна и Герберта В. Бойера с использованием бактерий E. coli, чтобы научиться разрезать фрагменты, соединять различные фрагменты и вставлять новые гены. [4] С тех пор эта область значительно расширилась с точки зрения точности и аккуратности. Компьютеры и технологии сделали технологически более простым достижение сужения ошибок и расширения понимания в этой области. Компьютеры, обладающие высокой производительностью для данных и вычислений, делали ощутимой обработку большого объема информации, то есть использование ChIP и генной последовательности .
Методы и протоколы
Гомологически направленная репарация (HDR) - это метод ремонта разрывов или повреждений в молекулах ДНК. Наиболее распространенным методом добавления вставок к желаемым последовательностям является использование гомологичной рекомбинации. [5] У этого метода есть особые требования: вставка может быть добавлена только после того, как она была введена в ядро клетки, что может быть добавлено в геном в основном во время фаз G2 и S в клеточном цикле . [6]
Редактирование генов CRISPR
Редактирование генов CRISPR на основе кластерных коротких палиндромных повторов с регулярными интервалами (CRISPR) - Cas9 - это фермент, который использует последовательности генов [7] для контроля, расщепления и разделения конкретных последовательностей ДНК, комплементарных последовательности CRISPR. [8] [9] Эти последовательности и ферменты были первоначально получены из бактериофагов. [10] Важность этого метода в области генной инженерии заключается в том, что он дает возможность проводить высокоточное целевое редактирование генов, а стоимость этого метода невысока по сравнению с другими инструментами. [11] [12] [13] Способность вставлять последовательности ДНК в организм легко и быстро, хотя это может вызвать проблемы с экспрессией в более сложных организмах. [14] [15]
Эффекторная нуклеаза, подобная активатору транскрипции
Эффекторная нуклеаза , подобная активатору транскрипции , TALEN, представляет собой набор рестрикционных ферментов, которые создаются для вырезания желаемых последовательностей ДНК. [16] Эти ферменты в основном используются в сочетании с CRISPR-CAS9, нуклеазой цинкового пальца или HDR. Основная причина этого - способность этих ферментов с точностью разрезать и разделять желаемую последовательность в гене.
Нуклеаза цинкового пальца
Цинковый палец нуклеаз генной инженерии ферменты , которые сочетают сплавления цинковый палец ДНК-связывающий домен на домен ДНК-расщепления . Они также комбинируются с CRISPR-CAS9 или TALEN для получения специфичного для последовательности добавления или удаления в геноме более сложных клеток и организмов. [17]
Генная пушка
Генной пушки , также известный как биолистической системы доставки частиц, используется для доставки трансгенов, белков или РНК в клетку. В нем используется система доставки микрочастиц, которая с высокой скоростью стреляет покрытыми частицами типичного тяжелого металла, содержащего интересующую ДНК, в клетки. Генетический материал проникает в клетку и доставляет содержимое по космической области. Использование систем доставки микрочастиц - это метод, известный как биолистический. [18]
Рекомендации
- ^ "insert - Терминология молекулярной биологии для вставки - GenScript" . www.genscript.com . Проверено 22 октября 2017 года .
- ^ Hahne JC, Lampis A, Valeri N (февраль 2021 г.). «РНК-хранилища: скрытые жемчужины в регуляции РНК и белков» . Клеточные и молекулярные науки о жизни . 78 (4): 1487–1499. DOI : 10.1007 / s00018-020-03675-9 . PMC 7904556 . PMID 33063126 .
- ^ Левин Б., Кремер Г. (январь 2019 г.). "Биологические функции генов аутофагии: перспектива болезни" . Cell . 176 (1–2): 11–42. DOI : 10.1016 / j.cell.2018.09.048 . PMC 6347410 . PMID 30633901 .
- ^ "Герберт В. Бойер и Стэнли Н. Коэн" . Институт истории науки . 2016-06-01 . Проверено 19 апреля 2021 .
- ^ Мальзан А., Лоудер Л., Ци И (2017-04-24). «Редактирование генома растений с помощью TALEN и CRISPR» . Cell & Bioscience . 7 (1): 21. DOI : 10,1186 / s13578-017-0148-4 . PMC 5404292 . PMID 28451378 .
- ^ Прилл К., Доусон Дж. Ф. (2020). "Ремонт, направленный на гомологию в Рыбках-данио: Колдовство и Волшебство?" . Границы молекулярных биологических наук . 7 : 595474. дои : 10,3389 / fmolb.2020.595474 . PMC 7793982 . PMID 33425990 .
- ^ Мохика Ф.Дж., Родригес-Валера Ф. (сентябрь 2016 г.). «Открытие CRISPR у архей и бактерий». Журнал FEBS . 283 (17): 3162–9. DOI : 10.1111 / febs.13766 . ЛВП : 10045/57676 . PMID 27234458 . S2CID 42827598 .
- ^ Баррангу Р. (февраль 2015 г.). «Роли систем CRISPR-Cas в адаптивном иммунитете и за его пределами». Текущее мнение в иммунологии . 32 : 36–41. DOI : 10.1016 / j.coi.2014.12.008 . PMID 25574773 .
- ^ О, Дж. Х., ван Пийкерен Дж. П. (29.09.2014). «CRISPR-Cas9-ассистированная рекомбинирование в Lactobacillus reuteri» . Исследования нуклеиновых кислот . 42 (17): e131. DOI : 10.1093 / NAR / gku623 . PMC 4176153 . PMID 25074379 .
- ^ Ишино Ю., Крупович М., Фортерре П. (апрель 2018 г.). Марголин В (ред.). «История CRISPR-Cas от встречи с таинственной повторяющейся последовательностью до технологии редактирования генома» . Журнал бактериологии . 200 (7): e00580–17, /jb/200/7/e00580–17.atom. DOI : 10.1128 / JB.00580-17 . PMC 5847661 . PMID 29358495 .
- ^ Эбрахими V, Хашеми A (август 2020 г.). «Проблемы редактирования генома in vitro с помощью CRISPR / Cas9 и возможные решения: обзор». Джин . 753 : 144813. дои : 10.1016 / j.gene.2020.144813 . PMID 32470504 .
- ^ Эйрд Э.Дж., Ловендал К.Н., Сент-Мартин А., Харрис Р.С., Гордон В.Р. (31.05.2018). «Повышение Cas9-опосредованной гомологически направленной эффективности репарации посредством ковалентного связывания матрицы репарации ДНК» . Биология коммуникации . 1 (1): 54. DOI : 10.1038 / s42003-018-0054-2 . PMC 6123678 . PMID 30271937 .
- ^ Маганти HB, Бейли А.Дж., Киркхэм А.М., Шорр Р., Пино Н., Аллан Д.С. (март 2021 г.). «Устойчивость гена CRISPR / Cas9, отредактированного гемопоэтическими стволовыми клетками после трансплантации: систематический обзор и метаанализ доклинических исследований» . Трансляционная медицина стволовых клеток . н / д (н / д). DOI : 10.1002 / sctm.20-0520 . PMID 33666363 .
- ^ Би Х, Фей Кью, Ли Р., Лю Б., Ся Р., Чар С. Н. и др. (Июль 2020 г.). «Нарушение последовательностей miRNA с помощью TALEN и CRISPR / Cas9 индуцирует продукцию miRNA различной длины» . Журнал биотехнологии растений . 18 (7): 1526–1536. DOI : 10.1111 / pbi.13315 . PMC 7292542 . PMID 31821678 .
- ^ Шарпантье Э., Марраффини Л.А. (июнь 2014 г.). «Использование иммунитета CRISPR-Cas9 для генной инженерии» . Текущее мнение в микробиологии . 19 : 114–119. DOI : 10.1016 / j.mib.2014.07.001 . PMC 4155128 . PMID 25048165 .
- ^ Boch J (февраль 2011 г.). «СКАЗКИ о нацеливании на геном». Природа Биотехнологии . 29 (2): 135–6. DOI : 10.1038 / nbt.1767 . PMID 21301438 . S2CID 304571 .
- ^ Мейдер М.Л., Тибодо-Беганни С., Осиак А., Райт Д.А., Энтони Р.М., Эйхтингер М. и др. (Июль 2008 г.). «Быстрая» разработка с открытым исходным кодом индивидуальных нуклеаз «цинковые пальцы» для высокоэффективной модификации генов » . Молекулярная клетка . 31 (2): 294–301. DOI : 10.1016 / j.molcel.2008.06.016 . PMC 2535758 . PMID 18657511 .
- ^ О'Брайен Дж. А., Ламмис СК (июнь 2011 г.). «Нанобиолистика: метод биолистической трансфекции клеток и тканей с использованием генной пушки с новыми снарядами нанометрового размера» . BMC Biotechnology . 11 (1): 66. DOI : 10,1186 / 1472-6750-11-66 . PMC 3144454 . PMID 21663596 .