Из Википедии, свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Анализ кривой плавления представляет собой оценку характеристик диссоциации двухцепочечной ДНК во время нагревания. При повышении температуры двойная нить начинает диссоциировать, что приводит к увеличению интенсивности поглощения и гиперхромности . Температура, при которой денатурируется 50% ДНК, известна как температура плавления .

Собранная информация может быть использована для вывода о наличии и идентичности однонуклеотидных полиморфизмов (SNP). Это связано с тем, что пары оснований GC имеют 3 водородные связи между ними, в то время как пары оснований AT имеют только 2. ДНК с более высоким содержанием GC, будь то из-за ее источника (содержание GC: E. coli 0.50, M. luteus 0.72, poly d (AT ) 0,00) или, как упоминалось ранее, из-за SNP будет иметь более высокую температуру плавления, чем ДНК с более высоким содержанием АТ.

Информация также дает важные подсказки о способе взаимодействия молекулы с ДНК. Молекулы, такие как интеркаляторы, вставляются между парами оснований и взаимодействуют посредством наложения пи . Это оказывает стабилизирующее действие на структуру ДНК, что приводит к повышению температуры ее плавления. Точно так же увеличение концентрации соли помогает рассеять отрицательное отталкивание между фосфатами в основной цепи ДНК. Это также приводит к повышению температуры плавления ДНК. И наоборот, pH может отрицательно влиять на стабильность ДНК, что может привести к снижению температуры ее плавления.

Реализация [ править ]

Графики, показывающие взаимосвязь между флуоресценцией и температурой для меченого зонда, разработанного для последовательности Wt, гомозиготных ситуаций Wt, гетерозиготных и гомозиготных мутантов

Энергия, необходимая для разрыва водородной связи основание-основание между двумя цепями ДНК, зависит от их длины, содержания GC и их комплементарности. Эти атрибуты можно вывести путем нагревания реакционной смеси, содержащей последовательности двухцепочечной ДНК, и измерения диссоциации в зависимости от температуры.

Первоначально диссоциация цепей наблюдалась с использованием измерений УФ-поглощения [1], но сейчас наиболее распространенным подходом являются методы, основанные на измерениях флуоресценции [2] .

Температурно-зависимую диссоциацию между двумя цепями ДНК можно измерить с помощью флуорофора, интеркалирующего ДНК, такого как SYBR green , EvaGreen или ДНК-зонды , меченные флуорофором . В случае зеленого SYBR (который флуоресцирует в 1000 раз более интенсивно при интеркалировании в малую бороздку двух цепей ДНК), диссоциацию ДНК во время нагревания можно измерить по значительному уменьшению флуоресценции в результате. [3] Альтернативно, сопоставленные зонды (один с флуорофором, а другой с подходящим гасителем ) можно использовать для определения комплементарности зонда целевой последовательности. [3]

График отрицательной первой производной кривой плавления может облегчить определение температуры диссоциации (определяемой как диссоциация 50%) благодаря пикам, образованным таким образом.

SYBR Green позволил дифференцировать продукты в LightCycler в 1997 году. [4] Также было продемонстрировано, что зонды гибридизации (или зонды FRET) обеспечивают очень специфические кривые плавления одноцепочечного (ss) гибрида зонда и ампликона. Idaho Technology и Roche много сделали для популяризации этого использования прибора LightCycler.

Приложения [ править ]

С конца 1990-х годов анализ продуктов с помощью SYBR Green, других двухцепочечных специфических красителей или анализ кривой плавления на основе зонда стал почти повсеместным. Метод на основе зондов достаточно чувствителен для обнаружения однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) и может различать гомозиготный дикий тип , гетерозиготный и гомозиготный мутант.аллели в силу произведенных паттернов диссоциации. Без зондов плавление ампликона (плавление и анализ всего продукта ПЦР) обычно не было успешным при обнаружении вариантов с одним основанием по профилям плавления. Благодаря приборам с более высоким разрешением и усовершенствованным красителям анализ плавления ампликонов одного варианта основания теперь возможен с помощью нескольких имеющихся в продаже приборов. Например: Applied Biosystems 7500 Fast System и 7900HT Fast Real-Time PCR System, LightScanner Idaho Technology (первое плавильное устройство с высоким разрешением на основе планшетов), инструменты Qiagen Rotor-Gene и инструменты Roche LightCycler 480.

В литературе существует множество исследований и клинических примеров [5], которые демонстрируют использование анализа кривой плавления, чтобы избежать или дополнить усилия по секвенированию и, таким образом, снизить затраты.

Хотя большинство машин для количественной ПЦР имеют возможность построения и анализа кривой плавления, уровень анализа и программного обеспечения варьируется. Расплав высокого разрешения (известный как плавление с высоким разрешением или HRM) является развитием этой общей технологии и начал предлагать более высокую чувствительность для обнаружения SNP в пределах всего окрашенного красителем ампликона. Менее затратно и проще по конструкции разрабатывать системы кривых плавления без зондов. Однако для приложений генотипирования, где необходимо обрабатывать большие объемы образцов, стоимость разработки может быть менее важной, чем общая производительность и простота интерпретации, поэтому предпочтение отдается методам генотипирования на основе зондов.

См. Также [ править ]

Ссылки [ править ]

  1. ^ Ансевин, AT; Визард, DL; Коричневый, черно-белый; McConathy, J. (1976), " с высокой разрешающей способностью термической денатурации ДНК I. Теоретические и практические соображения для разрешения тепловых subtransitions.", Биополимеры , 15 (1): 153-74, дой : 10.1002 / bip.1976.360150111 , PMID  1244898
  2. ^ Рири, км; Расмуссен, Р.П .; Wittwer, CT (1997), "Дифференциация продуктов путем анализа кривых плавления ДНК во время полимеразной цепной реакции", Anal. Биохим. , 245 (2): 154-60, DOI : 10,1006 / abio.1996.9916 , PMID 9056205 
  3. ^ а б Хоу, Шоу (2010). Биокатализ и биомолекулярная инженерия . Джон Вили и сыновья. С. 314–317.
  4. ^ Ririe, 1997
  5. ^ Lay MJ, Виттвер КТ. (1997) Флуоресцентное генотипирование фактора V Лейдена в реальном времени во время быстрой ПЦР. Clin Chem. 1997 декабрь; 43 (12): 2262-7
  6. ^ Wienken CJ, Baaske P, Duhr S, Braun D (2011), «Термофоретические кривые плавления количественно определяют конформацию и стабильность РНК и ДНК» , Nucleic Acids Research , 39 (8): e52 – e52, doi : 10.1093 / nar / gkr035 , PMC 3082908 , PMID 21297115 .  

Внешние ссылки [ править ]

  • Рири, км; Расмуссен, Р.П .; Виттвер, Коннектикут (1997). «Дифференциация продуктов путем анализа кривых плавления ДНК в ходе полимеразной цепной реакции». Анальная биохимия . 245 (2): 154–160. DOI : 10.1006 / abio.1996.9916 . PMID  9056205 .
  • Ло, Патчик СН (2014-10-21). «Моменты: Анализ кривой плавления» . Биотехнологии . Проверено 21 октября 2014 .