Мультиплексная амплификация зонда, зависящая от лигирования
Зависимая от мультиплексного лигирования амплификация зонда ( MLPA ) представляет собой разновидность мультиплексной полимеразной цепной реакции , которая позволяет амплифицировать несколько мишеней только с одной парой праймеров . [1] Он обнаруживает изменения числа копий на молекулярном уровне, и для анализа используются компьютерные программы. Идентификация делеций или дупликаций может указывать на патогенные мутации, поэтому MLPA является важным диагностическим инструментом, используемым в лабораториях клинической патологии во всем мире.
Зависимая от мультиплексного лигирования зондовая амплификация была изобретена Яном Схоутеном , голландским ученым. [1] Впервые метод был описан в 2002 году в научном журнале Nucleic Acid Research . [2] Первые приложения включали обнаружение делеций экзонов в генах человека BRCA1 , MSH2 и MLH1 , которые связаны с наследственным раком молочной железы и толстой кишки. Сейчас MLPA используется для выявления сотен наследственных заболеваний, а также для профилирования опухолей.
MLPA количественно определяет наличие определенных последовательностей в образце ДНК, используя специально разработанную пару зондов для каждой интересующей последовательности-мишени. Процесс состоит из нескольких шагов: [3]
Каждая пара зондов состоит из двух олигонуклеотидов с последовательностью, которая распознает соседние участки ДНК -мишени , сайта праймирования ПЦР и, необязательно, «наполнителя», чтобы придать продукту ПЦР уникальную длину по сравнению с другими парами зондов в анализе MLPA. Каждая полная пара зондов должна иметь уникальную длину, чтобы ее результирующие ампликоны можно было однозначно идентифицировать во время количественного определения, избегая ограничений разрешения мультиплексной ПЦР . Поскольку прямой праймер, используемый для амплификации зонда, является флуоресцентным .меченый, каждый ампликон генерирует флуоресцентный пик, который можно обнаружить с помощью капиллярного секвенатора. Сравнивая форму пика, полученную на данном образце, с диаграммой, полученной на различных эталонных образцах, можно определить относительное количество каждого ампликона. Это соотношение является мерой соотношения, в котором целевая последовательность присутствует в образце ДНК.
Различные методы, включая DGGE ( денатурирующий градиентный гель-электрофорез ), DHPLC ( денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография ) и SSCA (анализ конформации одной нити), эффективно идентифицируют SNP, а также небольшие вставки и делеции. MLPA, однако, является одним из единственных точных, эффективных по времени методов для обнаружения геномных делеций и вставок (одного или нескольких полных экзонов), которые являются частыми причинами рака, такого как наследственный неполипозный колоректальный рак ( HNPCC ), молочной железы и рак яичников. MLPA может успешно и легко определить относительное количество копий всех экзонов в гене одновременно с высокой чувствительностью.
Важным применением MLPA является определение относительной плоидности . Например, зонды могут быть предназначены для нацеливания на различные области хромосомы 21 клетки человека. Силы сигналов зондов сравнивают с таковыми, полученными из эталонного образца ДНК, о котором известно, что он содержит две копии хромосомы. Если в тестовом образце присутствует дополнительная копия, ожидается, что сигналы будут в 1,5 раза выше интенсивности соответствующих зондов из эталона. Если присутствует только одна копия, ожидается, что пропорция будет 0,5. Если образец имеет две копии, ожидается, что относительные силы зондов будут равными.
