Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Мультиплексная амплификация зонда, зависимая от лигирования ( MLPA ) [1], представляет собой разновидность мультиплексной полимеразной цепной реакции, которая позволяет амплифицировать множественные мишени только с одной парой праймеров . [1] Он обнаруживает изменения количества копий на молекулярном уровне, а для анализа используются программы. Выявление делеций или дупликаций может указывать на патогенные мутации, поэтому MLPA является важным диагностическим инструментом, используемым в лабораториях клинической патологии во всем мире.

Описание [ править ]

Пример делеций экзона, обнаруженных с помощью мультиплексной зависимой от лигирования амплификации зонда у пациента с мышечной дистрофией Дюшенна .

Каждый зонд состоит из двух олигонуклеотидов, которые распознают соседние сайты-мишени на ДНК . Один олигонуклеотид зонда содержит последовательность, распознаваемую прямым праймером, другой содержит последовательность, распознаваемую обратным праймером. Только когда оба олигонуклеотида зонда гибридизуются с соответствующими мишенями, они могут быть лигированы.в законченный зонд. Преимущество разделения зонда на две части состоит в том, что амплифицируются только лигированные олигонуклеотиды, но не несвязанные олигонуклеотиды зонда. Если бы зонды не были разделены таким образом, последовательности праймеров на любом конце заставили бы зонды амплифицироваться независимо от их гибридизации с матричной ДНК, и продукт амплификации не зависел бы от количества целевых сайтов, присутствующих в образце. ДНК. Каждый полный зонд имеет уникальную длину, поэтому полученные ампликоны можно разделить и идентифицировать с помощью (капиллярного) электрофореза . Это позволяет избежать ограничений разрешения мультиплексной ПЦР . Поскольку прямой праймер, используемый для амплификации зонда, флуоресцентнопомеченный, каждый ампликон генерирует флуоресцентный пик, который может быть обнаружен капиллярным секвенатором. Сравнивая картину пиков, полученную на данном образце, с картиной, полученной на различных контрольных образцах, можно определить относительное количество каждого ампликона. Это соотношение является мерой соотношения, в котором целевая последовательность присутствует в образце ДНК.

Различные методы, включая DGGE ( денатурирующий градиентный гель-электрофорез ), DHPLC ( денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография ) и SSCA (анализ однонитевой конформации), эффективно идентифицируют SNP, а также небольшие вставки и делеции. MLPA, однако, является одним из единственных точных и эффективных по времени методов для обнаружения делеций и вставок генома (одного или нескольких полных экзонов), которые являются частыми причинами рака, таких как наследственный неполипозный колоректальный рак ( HNPCC ), груди и рак яичников. MLPA может успешно и легко определить относительное количество копий всех экзонов в гене одновременно с высокой чувствительностью.

Относительная плоидность [ править ]

Важное применение MLPA - определение относительной плоидности . Например, зонды могут быть разработаны для нацеливания на различные области хромосомы 21 клетки человека. Сила сигнала зондов сравнивается с уровнем сигнала, полученным из эталонного образца ДНК, о котором известно, что он имеет две копии хромосомы. Если в тестовом образце присутствует дополнительная копия, ожидается, что сигналы будут в 1,5 раза превышать интенсивности соответствующих зондов от эталона. Если присутствует только одна копия, ожидается, что пропорция будет 0,5. Если образец имеет две копии, ожидается, что относительные силы зонда будут одинаковыми.

Анализ коэффициента дозировки [ править ]

Анализ коэффициента дозировки - это обычный метод интерпретации данных MLPA. [2] Если a и b - это сигналы от двух ампликонов в образце пациента, а A и B - соответствующие ампликоны в экспериментальном контроле, то коэффициент дозировки DQ = (a / b) / (A / B). Хотя коэффициенты дозировки могут быть рассчитаны для любой пары ампликонов, обычно один из них является внутренним эталонным зондом.

Приложения [ править ]

MLPA облегчает амплификацию и обнаружение нескольких мишеней с помощью одной пары праймеров. В стандартной мультиплексной реакции ПЦР каждому фрагменту требуется уникальная пара амплифицирующих праймеров. Эти праймеры, присутствующие в большом количестве, приводят к различным проблемам, таким как димеризация и ложное грунтование. С помощью MLPA можно добиться амплификации зондов. Таким образом, многие последовательности (до 40) можно амплифицировать и количественно оценить, используя только одну пару праймеров. Реакция MLPA быстрая, недорогая и очень простая в исполнении.

MLPA имеет множество применений [3], включая обнаружение мутаций и однонуклеотидных полиморфизмов , [4] анализ метилирования ДНК , [5] относительное количественное определение мРНК , [6] хромосомную характеристику клеточных линий и образцов тканей, [7] обнаружение число копий гена, [8] обнаружение дупликаций и делеций в генах предрасположенности к раку человека, таких как BRCA1 , BRCA2 , hMLH1 и hMSH2 [9] и анеуплоидиирешимость. [10] MLPA имеет потенциальное применение в пренатальной диагностике, как инвазивной [11], так и неинвазивной [12].

Недавние исследования показали, что MLPA (а также другие варианты, такие как iMLPA) являются надежным методом инверсионной характеристики. [13]

Варианты [ править ]

iMLPA [ править ]

Различия между MLPA и iMLPA

Гинер-Дельгадо, Карла и др. описал вариант MLPA, сочетающий его с iPCR. Они называют этот новый метод iMLPA [13], и его процедура такая же, как и у MLPA, но в начале необходимы два дополнительных шага:

  1. Во-первых, необходима обработка ДНК рестрикционными ферментами, которые разрезают интересующую область с обеих сторон.
  2. Фрагменты, полученные в результате переваривания, рециркуляризируются и связываются

Конструкция зонда очень похожа. Каждый зонд будет состоять из двух частей, которые имеют по крайней мере: целевую последовательность , которая представляет собой область, которая содержит последовательность, комплементарную интересующей области, так что может происходить правильная гибридизация. И последовательность праймера в конце, это последовательность, дизайн которой варьируется, и это то, что позволит конструировать праймеры и последующую амплификацию фрагментов. Кроме того, одна из частей зонда обычно содержит вставку между последовательностью-мишенью и последовательностью праймера. Использование разных вставок позволяет идентифицировать зонды с одинаковыми последовательностями праймеров, но с разными последовательностями-мишенями, что является ключевым моментом для многократной амплификации нескольких разных фрагментов в одной реакции.

Следующий шаг продолжается с типичным протоколом MLPA. [1]

Ссылки [ править ]

  1. ^ a b Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals G (2002). «Относительное количественное определение 40 последовательностей нуклеиновых кислот путем мультиплексной лигирования-зависимой амплификации зонда» . Nucleic Acids Res . 30 (12): 57e – 57. DOI : 10.1093 / NAR / gnf056 . PMC  117299 . PMID  12060695 .
  2. ^ Яу SC, Бобров M, Mathew CG, Abbs SJ (1996). «Точная диагностика носителей делеций и дупликаций при мышечной дистрофии Дюшенна / Беккера с помощью флуоресцентного анализа доз» . J. Med. Genet . 33 (7): 550–558. DOI : 10.1136 / jmg.33.7.550 . PMC 1050661 . PMID 8818939 .  
  3. ↑ Список статей, связанных с MLPA, заархивированных 20 февраля 2007 г. в Wayback Machine.
  4. ^ Volikos Е, Робинсон Дж, Aittomaki К, Mecklin ДП, Jarvinen Н, Уэстерман А.М., де Rooji FW, Vogel T, Moeslein G, V, Launonen Tomlinson IP, Silver AR, Аалтонен LA (2006). «Делеции экзонных и целых генов LKB1 являются частой причиной синдрома Пейтца-Егерса» . J. Med. Genet . 43 (5): e18. DOI : 10.1136 / jmg.2005.039875 . PMC 2564523 . PMID 16648371 .  
  5. Перейти ↑ Procter M, Chou LS, Tang W, Jama M, Mao R (2006). «Молекулярная диагностика синдромов Прадера-Вилли и Ангельмана с помощью анализа плавления, специфичного к метилированию, и амплификации зонда, зависящей от мультиплексного лигирования, специфичного к метилированию» (PDF) . Clin. Chem . 52 (7): 1276–1283. DOI : 10,1373 / clinchem.2006.067603 . PMID 16690734 .  
  6. ^ Венер М, Манголд Е, Sengteller М, Фридрихс N, S Арец, Фридл Вт, подпирая Р, Pagenstecher С (2005). «Наследственный неполипозный колоректальный рак: подводные камни при скрининге делеций в генах MSH2 и MLH1» . Евро. J. Hum. Genet . 13 (8): 983–986. DOI : 10.1038 / sj.ejhg.5201421 . PMID 15870828 . 
  7. ^ Wilting SM, Snijders PJ, Meijer GA, Ylstra B, Van den IJssel PR, Snijders AM, Albertson DG, Coffa J, Schouten JP, van de Wiel MA, Meijer CJ, Steenbergen RD (2006). «Повышенное количество копий гена на хромосоме 20q часто встречается как при плоскоклеточном раке, так и при аденокарциноме шейки матки». J. Pathol . 209 (2): 220–230. DOI : 10.1002 / path.1966 . PMID 16538612 . 
  8. ^ Введение в MLPA
  9. ^ Bunyan DJ, Эклс DM, Sillibourne J, Wilkins E, Томас С., Shea-Симондс J, Дункан PJ, Curtis CE, Робинсон DO, Харви JF, Cross NC (2004). «Дозировка генов предрасположенности к раку путем мультиплексной лигирования-зависимой амплификации зонда» . Br. J. Рак . 91 (6): 1155–1159. DOI : 10.1038 / sj.bjc.6602121 . PMC 2747696 . PMID 15475941 .  
  10. ^ Гердес Т., Кирхгоф М., Линд А.М., Ларсен Г.В., Шварц М., Лундстин С. (2005). «Компьютерный скрининг пренатальной анеуплоидии на хромосомы 13, 18, 21, X и Y на основе мультиплексной лигирования-зависимой амплификации зонда (MLPA)» . Евро. J. Hum. Genet . 13 (2): 171–175. DOI : 10.1038 / sj.ejhg.5201307 . PMID 15483643 . 
  11. ^ Хёхстенбах R, J Мейера, ван де Brug J, Vossebeld-Hoff I, R, Jansen ван - дер - Luijt РБ, Sinke RJ, Page-Christiaens GC, Ploos ван Амстел JK, JM де Патер (2005). «Быстрое обнаружение хромосомных анеуплоидий в некультивируемых амниоцитах с помощью мультиплексной лигирования-зависимой амплификации зонда (MLPA)». Пренат. Диаг . 25 (11): 1032–1039. DOI : 10.1002 / pd.1247 . PMID 16231311 . 
  12. ^ Ильяньеса S, Авент N, Soothill PW (2005). «Внеклеточная ДНК плода в материнской плазме: важный шаг вперед в увязке генетики плода с акушерским ультразвуком» . Ультразвуковой акушерство. Гинеколь . 25 (4): 317–322. DOI : 10.1002 / uog.1881 . PMID 15789415 . 
  13. ^ a b Гинер-Дельгадо, К., Вильяторо, С., Лерга-Хасо, Дж., Гая-Видаль, М., Олива, М., Кастеллано, Д., ... и Олальде, И. (2019) . Эволюционное и функциональное влияние обычных полиморфных инверсий в геноме человека. Природные коммуникации , 10 (1), 1-14. https://doi.org/10.1038/s41467-019-12173-x

Внешние ссылки [ править ]

  • Дальнейшие применения MLPA