Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Современный оптический микроскоп с ртутной колбой для флуоресцентной микроскопии . В микроскопе есть цифровая камера, подключенная к компьютеру .

Оптический микроскоп , также называемый световым микроскопом , представляет собой тип микроскопа , который обычно использует видимый свет и систему линз для генерирования увеличенных изображений малых объектов. Оптические микроскопы - это старейшая конструкция микроскопов, и, возможно, в их нынешней сложной форме они были изобретены в 17 веке. Базовые оптические микроскопы могут быть очень простыми, хотя многие сложные конструкции направлены на улучшение разрешения и контрастности образца .

Объект помещается на столик, и его можно непосредственно рассматривать через один или два окуляра на микроскопе. В мощных микроскопах оба окуляра обычно показывают одно и то же изображение, но в стереомикроскопе для создания трехмерного эффекта используются несколько разные изображения. Для захвата изображения ( микрофотографии ) обычно используется камера .

Образец можно зажечь разными способами. Прозрачные объекты можно освещать снизу, а твердые объекты можно освещать светом, проходящим через ( светлое поле ) или вокруг ( темное поле ) линзы объектива. Поляризованный свет можно использовать для определения кристаллической ориентации металлических объектов. Фазово-контрастное изображение можно использовать для увеличения контрастности изображения за счет выделения мелких деталей с различным показателем преломления.

Ряд объективных линз с разным увеличением, как правило , при условии , установленный на башне, что позволяет им вращаться на месте и обеспечивая возможность масштабирования в. Максимальное увеличение оптических микроскопов обычно ограничивается примерно 1000x из-за ограниченной разрешающей способности видимого света. Увеличение составного оптического микроскопа является произведением увеличения окуляра (скажем, 10x) и линзы объектива (скажем, 100x), что дает общее увеличение в 1000 раз. Измененная среда, такая как использование масла или ультрафиолетового света, может увеличить увеличение.

Альтернативы оптической микроскопии, которые не используют видимый свет, включают сканирующую электронную микроскопию и просвечивающую электронную микроскопию и сканирующую зондовую микроскопию, и, как следствие, можно достичь гораздо большего увеличения.

Типы [ править ]

Схема простого микроскопа

Есть два основных типа оптических микроскопов: простые микроскопы и составные микроскопы. В простом микроскопе для увеличения используется оптическая сила одной линзы или группы линз. В составном микроскопе используется система линз (один набор увеличивает изображение, создаваемое другим) для достижения гораздо большего увеличения объекта. Подавляющее большинство современных исследовательских микроскопов являются составными микроскопами, в то время как некоторые более дешевые коммерческие цифровые микроскопы представляют собой простые микроскопы с одной линзой. Составные микроскопы можно далее разделить на множество других типов микроскопов, которые различаются своей оптической конфигурацией, стоимостью и назначением.

Простой микроскоп [ править ]

В простом микроскопе используется линза или набор линз для увеличения объекта только за счет углового увеличения, давая зрителю прямое увеличенное виртуальное изображение . [1] [2] Использование одной выпуклой линзы или группы линз можно найти в простых устройствах увеличения, таких как увеличительное стекло , лупы и окуляры для телескопов и микроскопов.

Составной микроскоп [ править ]

Схема составного микроскопа

Соединение микроскоп использует объектив близко к объекту просматриваемого для сбора света ( так называемых объективным объективом) , которая фокусируется на реальное изображение объекта внутри микроскопа (изображение 1). Затем это изображение увеличивается с помощью второй линзы или группы линз (называемых окуляром ), что дает зрителю увеличенное перевернутое виртуальное изображение объекта (изображение 2). [3] Использование комбинированной комбинации объектива и окуляра позволяет добиться гораздо большего увеличения. Обычные составные микроскопы часто оснащены сменными линзами объектива, что позволяет пользователю быстро регулировать увеличение. [3] Составной микроскоп также позволяет использовать более сложные настройки освещения, такие как фазовый контраст .

Другие варианты микроскопа [ править ]

Существует множество вариантов конструкции составного оптического микроскопа специального назначения. Некоторые из них являются физическими конструктивными различиями, позволяющими использовать специализацию для определенных целей:

  • Стереомикроскоп , маломощный микроскоп, обеспечивающий стереоскопическое изображение образца, обычно используемый для препарирования.
  • Микроскоп для сравнения с двумя отдельными световыми путями, позволяющими напрямую сравнивать два образца с помощью одного изображения в каждом глазу.
  • Инвертированный микроскоп для изучения образцов снизу; полезен для клеточных культур в жидкости или для металлографии.
  • Микроскоп для осмотра оптоволоконных разъемов, предназначенный для проверки торцевых поверхностей разъемов
  • Передвижной микроскоп для исследования образцов с высоким оптическим разрешением .

Остальные варианты микроскопов рассчитаны на разные техники освещения:

  • Петрографический микроскоп , конструкция которого обычно включает поляризационный фильтр, вращающийся столик и гипсовую пластину для облегчения изучения минералов или других кристаллических материалов, оптические свойства которых могут изменяться в зависимости от ориентации.
  • Поляризационный микроскоп , подобный петрографическому микроскопу.
  • Фазово-контрастный микроскоп , в котором применяется метод фазово-контрастного освещения.
  • Эпифлуоресцентный микроскоп , предназначенный для анализа проб, содержащих флуорофоры.
  • Конфокальный микроскоп , широко используемый вариант эпифлуоресцентного освещения, который использует сканирующий лазер для освещения образца для флуоресценции.
  • Двухфотонный микроскоп , используемый для более глубокого изображения флуоресценции в рассеивающих средах и уменьшения фотообесцвечивания, особенно в живых образцах.
  • Студенческий микроскоп - часто маломощный микроскоп с упрощенным управлением и иногда некачественной оптикой, предназначенный для использования в школе или в качестве стартового прибора для детей. [4]
  • Ультрамикроскоп , адаптированный оптический микроскоп, в котором используется рассеяние света, позволяющее наблюдать крошечные частицы, диаметр которых меньше или близок к длине волны видимого света (около 500 нанометров); в основном устарело с момента появления электронных микроскопов
  • Рамановский микроскоп с улучшенным наконечником - это вариант оптического микроскопа, основанный на рамановской спектроскопии с усиленным наконечником , без традиционных ограничений разрешения на основе длины волны. [5] [6] Этот микроскоп в основном реализован на платформах сканирующих зондовых микроскопов с использованием всех оптических инструментов.

Цифровой микроскоп [ править ]

Миниатюрный USB-микроскоп .
Основная статья: Цифровой микроскоп

Цифровой микроскоп является микроскоп оснащен цифровой камерой , позволяющей наблюдение образца с помощью компьютера . Микроскопы также могут частично или полностью управляться компьютером с различными уровнями автоматизации. Цифровая микроскопия позволяет лучше анализировать изображение микроскопа, например, измерять расстояния и площади, а также определять флуоресцентные или гистологические пятна.

Цифровые микроскопы с низким энергопотреблением, USB-микроскопы , также коммерчески доступны. По сути, это веб-камеры с мощным макрообъективом, в которых обычно не используется просвечивание . Камера подключается непосредственно к USB- порту компьютера, так что изображения отображаются прямо на мониторе. Они предлагают небольшое увеличение (примерно до 200 ×) без необходимости использования окуляров и по очень низкой цене. Освещение высокой мощности обычно обеспечивается светодиодным источником или источниками, примыкающими к объективу камеры.

Цифровая микроскопия с очень низким уровнем освещенности, позволяющая избежать повреждения уязвимых биологических образцов, доступна с использованием чувствительных цифровых камер для подсчета фотонов . Было продемонстрировано, что источник света, обеспечивающий пары запутанных фотонов, может минимизировать риск повреждения наиболее светочувствительных образцов. В этом применении фантомной визуализации к фотонно-разреженной микроскопии образец освещается инфракрасными фотонами, каждый из которых пространственно коррелирован с запутанным партнером в видимом диапазоне для эффективного получения изображения камерой для счета фотонов. [7]

История [ править ]

Смотрите также: История оптики и Хронология развития микроскопов.

Изобретение [ править ]

Самые ранние микроскопы были увеличительными стеклами с одной линзой и ограниченным увеличением, которые появились, по крайней мере, еще со времен широкого использования линз в очках в 13 веке. [8]

Составные микроскопы впервые появились в Европе около 1620 года [9] [10], включая один, продемонстрированный Корнелисом Дреббелем в Лондоне (около 1621 года), и один выставленный в Риме в 1624 году. [11] [12]

Фактический изобретатель составного микроскопа неизвестен, хотя за эти годы было сделано много заявлений. Сюда входит заявление голландского производителя очков Йоханнеса Захариассена через 35 [13] лет после их появления о том, что его отец, Захариас Янссен , изобрел составной микроскоп и / или телескоп еще в 1590 году. Йоханнес (некоторые утверждения сомнительны) [14] [15] [16] свидетельства отодвигают дату изобретения так далеко назад, что Захария был ребенком в то время, что привело к предположению, что для того, чтобы утверждение Йоханнеса было правдой, составной микроскоп должен был быть изобретен Йоханнесом » дедушка, Ганс Мартенс. [17] Согласно другому утверждению, конкурент Янссена,Ганс Липперши ( подавший заявку на первый патент на телескоп в 1608 году) также изобрел составной микроскоп. [18] Другие историки указывают на голландского новатора Корнелиса Дреббеля с его составным микроскопом 1621 года. [11] [12]

Галилео Галилей также иногда упоминается как изобретатель сложного микроскопа. После 1610 года он обнаружил, что может близко сфокусировать свой телескоп, чтобы рассмотреть мелкие объекты, такие как мухи, крупным планом [19] и / или мог смотреть не с того конца в обратном направлении, чтобы увеличить мелкие объекты. [20] Единственным недостатком было то, что его телескоп длиной 2 фута пришлось удлинить до 6 футов, чтобы видеть объекты с близкого расстояния. [21] Увидев составной микроскоп, построенный Дреббелем, выставленный в Риме в 1624 году, Галилей построил свою собственную улучшенную версию. [11] [12] В 1625 году Джованни Фабер придумал название микроскопа для составного микроскопа Galileo, представленного в Accademia dei Lincei.в 1624 г. [22] (Галилей называл его « окчиолино » или « глазком »). Фабер придумал это название от греческих слов μικρόν (микрон), означающих «маленький», и σκοπεῖν (skopein), означающих «смотреть на», имя, которое должно быть аналогично « телескопу », другому слову, придуманному линиейцами. [23]

Христиан Гюйгенс , другой голландец, в конце 17 века разработал простую двухлинзовую окулярную систему, которая подвергалась ахроматической коррекции, что стало огромным шагом вперед в развитии микроскопов. Окуляр Гюйгенса все еще производится по сей день, но он страдает небольшим размером поля зрения и другими незначительными недостатками.

Популяризация [ править ]

Самый старый опубликованный снимок, сделанный с помощью микроскопа: пчелы Франческо Стеллути , 1630 г. [24]

Считается, что Антони ван Левенгук (1632–1724) привлек внимание биологов к микроскопу, хотя простые увеличительные линзы производились уже в 16 веке. Самодельные микроскопы Ван Левенгука были простыми микроскопами с одной очень маленькой, но прочной линзой. Они были неудобны в использовании, но позволяли ван Левенгук видеть подробные изображения. Потребовалось около 150 лет оптических разработок, прежде чем составной микроскоп смог обеспечить изображение того же качества, что и простые микроскопы Ван Левенгука, из-за трудностей с настройкой нескольких линз. В 1850-х годах Джон Леонард Ридделл , профессор химии Тулейнского университета., изобрел первый практический бинокулярный микроскоп при проведении одного из самых ранних и обширных американских микроскопических исследований холеры . [25] [26]

Техника освещения [ править ]

В то время как базовая микроскопическая технология и оптика были доступны уже более 400 лет, гораздо позже были разработаны методы освещения образцов для получения изображений высокого качества, которые можно увидеть сегодня.

В августе 1893 года Август Келер разработал освещение Келера . Этот метод освещения образца обеспечивает чрезвычайно равномерное освещение и преодолевает многие ограничения старых методов освещения образца. До развития освещения Келера изображение источника света, например нити накала лампочки , всегда было видно на изображении образца.

Нобелевская премия по физике была присуждена голландским физик Церник в 1953 году для его развития фазового контраста освещения , которая позволяет визуализацию прозрачных образцов. Используя интерференцию, а не поглощение света, можно визуализировать чрезвычайно прозрачные образцы, такие как живые клетки млекопитающих , без использования методов окрашивания. Всего два года спустя, в 1955 году, Жорж Номарски опубликовал теорию дифференциальной интерференционной контрастной микроскопии, другого метода визуализации на основе интерференции .

Флуоресцентная микроскопия [ править ]

Современная биологическая микроскопия сильно зависит от разработки флуоресцентных зондов для определенных структур внутри клетки. В отличие от обычной микроскопии с просвечивающим светом, во флуоресцентной микроскопии образец освещается через линзу объектива узким набором длин волн света. Этот свет взаимодействует с флуорофорами в образце, которые затем излучают свет с большей длиной волны . Именно этот излучаемый свет составляет изображение.

С середины 20 века химические флуоресцентные красители, такие как DAPI, который связывается с ДНК , использовались для мечения определенных структур внутри клетки. Более поздние разработки включают иммунофлуоресценцию , в которой используются флуоресцентно меченые антитела для распознавания определенных белков в образце, и флуоресцентные белки, такие как GFP, которые может экспрессировать живая клетка, делая ее флуоресцентной.

Компоненты [ править ]

Основные элементы оптического просвечивающего микроскопа (1990-е годы)

Все современные оптические микроскопы, предназначенные для просмотра образцов в проходящем свете, имеют одни и те же основные компоненты светового пути. Кроме того, подавляющее большинство микроскопов имеют одинаковые «структурные» компоненты [27] (пронумерованные ниже в соответствии с изображением справа):

  • Окуляр (окулярная линза) (1)
  • Револьвер для объектива, револьвер или вращающаяся носовая часть (для удержания нескольких линз объектива) (2)
  • Объективы (3)
  • Ручки фокусировки (для перемещения сцены)
    • Грубая регулировка (4)
    • Точная регулировка (5)
  • Этап (для удержания образца) (6)
  • Источник света ( светильник или зеркало ) (7)
  • Диафрагма и конденсатор (8)
  • Механический этап (9)

Окуляр (окулярная линза) [ править ]

Основная статья: окуляр

Окуляра , или глазной объектив, представляет собой цилиндр , содержащие два или более линз; его функция заключается в том, чтобы сфокусировать изображение для глаза. Окуляр вставляется в верхний конец тубуса. Окуляры взаимозаменяемы, и в них можно вставить много разных окуляров с разной степенью увеличения. Типичные значения увеличения для окуляров включают 5 ×, 10 × (наиболее распространенные), 15 × и 20 ×. В некоторых высокопроизводительных микроскопах оптическая конфигурация линзы объектива и окуляра согласована для обеспечения наилучших оптических характеристик. Чаще всего это происходит с апохроматическими объективами.

Целевая турель (револьвер или револьвер) [ править ]

Башня объектива, револьвер или вращающаяся носовая часть - это часть, которая удерживает набор линз объектива. Это позволяет пользователю переключаться между линзами объектива.

Объектив [ править ]

Основная статья: Объектив (оптика)

На нижнем конце типичного составного оптического микроскопа есть одна или несколько линз объектива, которые собирают свет от образца. Объектив обычно находится в цилиндрическом корпусе, содержащем стеклянную одно- или многоэлементную составную линзу. Обычно в круглую носовую часть ввинчиваются около трех линз объектива, которые можно вращать для выбора необходимой линзы объектива. Эти устройства спроектированы так, чтобы быть парфокальными , что означает, что при смене одной линзы на другую в микроскопе образец остается в фокусе . Объективы микроскопов характеризуются двумя параметрами, а именно увеличением и числовой апертурой.. Первое обычно находится в диапазоне от 5 × до 100 ×, а второе - от 0,14 до 0,7, что соответствует фокусным расстояниям примерно от 40 до 2 мм соответственно. Объективы с большим увеличением обычно имеют большую числовую апертуру и меньшую глубину резкости получаемого изображения. Для некоторых объективов с высокими характеристиками могут потребоваться согласованные окуляры для обеспечения наилучших оптических характеристик.

Объектив масляного погружения [ править ]

Два объектива масляного иммерсионного микроскопа Leica : 100 × (слева) и 40 × (справа)
Основная статья: Погружение в масло

В некоторых микроскопах используются масляно-иммерсионные объективы или водно-иммерсионные объективы для большего разрешения при большом увеличении. Они используются с материалом с согласованным показателем, таким как иммерсионное масло или вода, и согласованное покровное стекло между линзой объектива и образцом. Показатель преломления материала с согласованием показателей выше, чем у воздуха, что позволяет линзе объектива иметь большую числовую апертуру (больше 1), так что свет проходит от образца к внешней поверхности линзы объектива с минимальным преломлением. Числовая апертура может достигать 1,6. [28]Большая числовая апертура позволяет собирать больше света, делая возможным детальное наблюдение более мелких деталей. Маслоиммерсионная линза обычно имеет увеличение от 40 до 100 ×.

Ручки фокусировки [ править ]

Ручки регулировки перемещают столик вверх и вниз с раздельной регулировкой для грубой и точной фокусировки. Одинаковые элементы управления позволяют микроскопу адаптироваться к образцам разной толщины. В старых конструкциях микроскопов колеса регулировки фокуса перемещали трубку микроскопа вверх или вниз относительно стойки и имели фиксированный столик.

Рамка [ править ]

Вся оптическая сборка традиционно крепится к жесткому рычагу, который, в свою очередь, прикрепляется к прочной U-образной ножке для обеспечения необходимой жесткости. Угол рычага может регулироваться, чтобы можно было регулировать угол обзора.

Рама служит точкой крепления для различных органов управления микроскопом. Обычно это включает элементы управления для фокусировки, как правило, большое колесо с накаткой для настройки грубой фокусировки вместе с меньшим колесиком с накаткой для управления точной фокусировкой. Другими функциями могут быть элементы управления лампой и / или элементы управления для регулировки конденсатора.

Этап [ править ]

Столик представляет собой платформу под линзой объектива, которая поддерживает исследуемый образец. В центре предметного столика находится отверстие, через которое свет проходит для освещения образца. У столика обычно есть рычаги для удержания предметных стекол (прямоугольные стеклянные пластины с типичными размерами 25 × 75 мм, на которых крепится образец).

При увеличении более 100 × перемещение слайда вручную нецелесообразно. Механический столик, типичный для микроскопов средней и более высокой ценовой категории, позволяет осуществлять крошечные перемещения предметного стекла с помощью ручек управления, которые изменяют положение образца / предметного стекла по желанию. Если в микроскопе изначально не было механического предметного столика, возможно, его можно будет добавить.

Все этапы перемещаются вверх и вниз для фокусировки. С помощью механического предметного столика салазки перемещаются по двум горизонтальным осям для позиционирования образца для исследования деталей образца.

Фокусировка начинается при меньшем увеличении, чтобы пользователь мог центрировать образец на предметном столике. Для перехода к большему увеличению требуется, чтобы столик был перемещен выше по вертикали для перефокусировки при большем увеличении, а также может потребоваться небольшая регулировка положения образца по горизонтали. Регулировка горизонтального положения образца является причиной использования механического столика.

Из-за сложности подготовки образцов и их установки на слайды детям лучше всего начинать с подготовленных слайдов, которые центрируются и легко фокусируются независимо от используемого уровня фокусировки.

Источник света [ править ]

Можно использовать множество источников света. В простейшем случае дневной свет направляется через зеркало . Однако у большинства микроскопов есть собственный регулируемый и управляемый источник света - часто галогенная лампа , хотя освещение с использованием светодиодов и лазеров становится все более распространенным явлением. Келеровское освещение часто применяется на более дорогих приборах.

Конденсатор [ править ]

Конденсатор представляет собой линзу , предназначенная для фокусировки света от источника освещения на образец. Конденсатор может также включать в себя другие элементы, такие как диафрагма и / или фильтры, для управления качеством и интенсивностью освещения. Для таких методов освещения, как темное поле , фазовый контраст и дифференциальная интерференционная контрастная микроскопия, дополнительные оптические компоненты должны быть точно выровнены на пути света.

Увеличение [ править ]

Фактическая сила или увеличение составного оптического микроскопа - это произведение мощностей окуляра ( окуляра ) и линзы объектива. Максимальные нормальные увеличения окуляра и объектива составляют 10 × и 100 × соответственно, что дает конечное увеличение в 1000 ×.

Увеличение и микрофотографии [ править ]

При использовании камеры для захвата микрофотографии эффективное увеличение изображения должно учитывать размер изображения. Это не зависит от того, отпечатан ли он на негативе пленки или отображается на экране компьютера в цифровом виде .

В случае фотопленочных фотоаппаратов расчет прост; Окончательное увеличение является произведением увеличения объектива, увеличения оптики камеры и коэффициента увеличения отпечатка пленки относительно негатива. Типичное значение коэффициента увеличения составляет около 5 × (для пленки 35 мм и отпечатка 15 × 10 см (6 × 4 дюйма)).

В случае цифровых фотоаппаратов необходимо знать размер пикселей в детекторе CMOS или CCD и размер пикселей на экране. Затем можно рассчитать коэффициент увеличения от детектора до пикселей на экране. Как и в случае с пленочной камерой, окончательное увеличение является продуктом увеличения объектива, увеличения оптики камеры и коэффициента увеличения.

Операция [ править ]

США CBP Управления операций на местах агента проверки на подлинность в виде проездного документа на международном аэропорту с помощью стерео микроскопа

Техники освещения [ править ]

Основная статья: Микроскопия

Доступны многие методы, которые изменяют путь света для создания улучшенного контрастного изображения из образца. Основные методы создания повышенного контраста образца включают кроссполяризованный свет , темное поле , фазовый контраст и дифференциальное интерференционное контрастное освещение. Недавний метод ( Sarfus ) объединяет кросс-поляризованный свет и специальные слайды с повышенной контрастностью для визуализации нанометрических образцов.

  • Четыре примера методов просвечивания, используемых для создания контраста в образце тонкой бумаги . 1,559 мкм / пиксель.

  • Освещение в ярком поле , контраст образца зависит от поглощения света образцом.

  • Освещение кросс-поляризованным светом , контраст образца достигается за счет вращения поляризованного света через образец.

  • Освещение темного поля , контраст образца исходит из света, рассеянного образцом.

  • Фазово-контрастное освещение, контраст образца возникает из-за интерференции разных длин пути света через образец.

Другие техники [ править ]

Современные микроскопы позволяют не только наблюдать изображение образца в проходящем свете; есть много методов, которые можно использовать для извлечения других типов данных. Большинство из них требует дополнительного оборудования в дополнение к основному составному микроскопу.

  • Отраженный свет или падающее освещение (для анализа поверхностных структур)
  • Флуоресцентная микроскопия, как:
  • Эпифлуоресцентная микроскопия
  • Конфокальная микроскопия
  • Микроспектроскопия (спектрофотометр УФ-видимого диапазона интегрирован с оптическим микроскопом)
  • Ультрафиолетовая микроскопия
  • Ближняя инфракрасная микроскопия
  • Многократная просвечивающая микроскопия [29] для увеличения контрастности и уменьшения аберраций.
  • Автоматизация (для автоматического сканирования большого образца или захвата изображения)

Приложения [ править ]

Изображение клеток в медицинском мазке с 40-кратным увеличением, полученное с помощью оптического микроскопа с использованием метода влажной фиксации , размещения образца на предметном стекле и смешивания с раствором соли.

Оптическая микроскопия широко используется в микроэлектронике, нанофизике, биотехнологии, фармацевтических исследованиях, минералогии и микробиологии. [30]

Оптическая микроскопия используется для медицинской диагностики , область, называемая гистопатологией, при работе с тканями или в тестах мазков на свободных клетках или фрагментах тканей.

В промышленном использовании широко используются бинокулярные микроскопы. Помимо приложений, требующих точного восприятия глубины , использование двойных окуляров снижает нагрузку на глаза, связанную с долгими рабочими днями на микроскопической станции. В некоторых случаях полезны микроскопы с большим рабочим расстоянием или длиннофокусные микроскопы [31] . Может потребоваться осмотр предмета за окном , или промышленные объекты могут представлять опасность для цели. Такая оптика напоминает телескопы с возможностью фокусировки на близком расстоянии. [32] [33]

Измерительные микроскопы используются для точных измерений. Есть два основных типа. У одного есть градуированная сетка, позволяющая измерять расстояния в фокальной плоскости. [34] Другой (и более старый) тип имеет простое перекрестие и микрометрический механизм для перемещения объекта относительно микроскопа. [35]

Очень маленькие портативные микроскопы нашли применение в тех местах, где лабораторный микроскоп был бы обузой. [36]

Ограничения [ править ]

Предел дифракции высечен в камне на памятнике Эрнсту Аббе .

При очень большом увеличении в проходящем свете точечные объекты выглядят как нечеткие диски, окруженные дифракционными кольцами. Они называются дисками Эйри . Под разрешающей способностью микроскопа понимается способность различать два близко расположенных диска Эйри (или, другими словами, способность микроскопа выявлять соседние структурные детали как отдельные и отдельные). Именно эти эффекты дифракции ограничивают возможность разрешения мелких деталей. Степень и величину дифракционных картин влияют как на длине волны от света (Х), преломляющие материалы , используемых для изготовления линзы объектива и числовой апертуры(NA) линзы объектива. Следовательно, существует конечный предел, за которым невозможно разрешить отдельные точки в поле объектива, известный как дифракционный предел . Предполагая, что оптические аберрации во всей оптической системе пренебрежимо малы, разрешение d можно определить как:

Обычно предполагается длина волны 550 нм, что соответствует зеленому свету. При использовании воздуха в качестве внешней среды максимальное значение NA составляет 0,95, а для масла - до 1,5. На практике наименьшее значение d, получаемое с помощью обычных линз, составляет около 200 нм. Новый тип линз, использующий многократное рассеяние света, позволил улучшить разрешение до менее 100 нм. [37]

Превышение предела разрешения [ править ]

Доступны несколько методов для достижения разрешений, превышающих предел пропускаемого света, описанный выше. Голографические методы, описанные Куржоном и Булабуа в 1979 году, также способны нарушить этот предел разрешения, хотя разрешение было ограничено в их экспериментальном анализе. [38]

Для использования флуоресцентных образцов доступно больше методов. Примеры включают Vertico SMI , сканирующую оптическую микроскопию ближнего поля, в которой используются затухающие волны , и истощение стимулированного излучения . В 2005 году микроскоп, способный обнаруживать одну молекулу, был описан как обучающий инструмент. [39]

Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в последнее десятилетие, методы преодоления дифракционного предела остаются ограниченными и специализированными.

Хотя большинство методов ориентированы на увеличение латерального разрешения, существуют также некоторые методы, позволяющие анализировать очень тонкие образцы. Например, методы сарфуса помещают тонкий образец на усиливающую контраст поверхность и, таким образом, позволяют непосредственно визуализировать пленки толщиной всего 0,3 нанометра.

8 октября 2014 года Нобелевская премия по химии была присуждена Эрику Бетцигу , Уильяму Моернеру и Стефану Хеллу за разработку флуоресцентной микроскопии со сверхвысоким разрешением . [40] [41]

Структурированное освещение СМИ [ править ]

SMI (микроскопия с пространственно-модулированным освещением) - это светооптический процесс так называемой техники с функцией рассеяния точки (PSF). Это процессы, которые модифицируют PSF микроскопа подходящим образом, чтобы либо увеличить оптическое разрешение, либо максимизировать точность измерения расстояния до флуоресцентных объектов, которые малы по сравнению с длиной волны освещающего света, либо для извлечения других структурных параметров в нанометровый диапазон. [42] [43]

Локализационная микроскопия SPDMphymod [ править ]

Двухцветная 3D микроскопия со сверхвысоким разрешением с Her2 и Her3 в клетках груди, стандартные красители: Alexa 488, Alexa 568 LIMON

SPDM (спектральная прецизионная дистанционная микроскопия), основная технология локализационной микроскопии, представляет собой светооптический процесс флуоресцентной микроскопии, который позволяет измерять положение, расстояние и угол на «оптически изолированных» частицах (например, молекулах) значительно ниже теоретического предела разрешения для световой микроскопии. «Оптически изолированный» означает , что в данный момент времени только одна частица / молекулы в пределах области размером определяется обычным оптическим разрешением (обычно ок. 200-250 нм диаметром ) регистрируется. Это возможно, когда все молекулы в такой области несут разные спектральные маркеры (например, разные цвета или другие полезные различия в излучении света.различных частиц). [44] [45] [46] [47]

Многие стандартные флуоресцентные красители, такие как GFP , красители Alexa, красители Atto, Cy2 / Cy3 и молекулы флуоресцеина, могут быть использованы для локализационной микроскопии при наличии определенных фотофизических условий. Используя эту так называемую технологию SPDMphymod (физически изменяемые флуорофоры), для создания наноизображений достаточно одной длины волны лазера подходящей интенсивности. [48]

3D микроскопия сверхвысокого разрешения [ править ]

Трехмерная микроскопия сверхвысокого разрешения со стандартными флуоресцентными красителями может быть достигнута путем сочетания локализационной микроскопии для стандартных флуоресцентных красителей SPDMphymod и структурированного освещения SMI. [49]

STED [ править ]

Микроскопия стимулированного истощения эмиссии (STED) филаментов актина внутри клетки.

Истощение искусственного излучения - простой пример того, как возможно более высокое разрешение, превышающее дифракционный предел, но оно имеет серьезные ограничения. STED - это метод флуоресцентной микроскопии, который использует комбинацию световых импульсов для индукции флуоресценции в небольшой подгруппе флуоресцентных молекул в образце. Каждая молекула создает на изображении световое пятно с ограничением дифракции, и центр каждого из этих пятен соответствует местоположению молекулы. Поскольку количество флуоресцирующих молекул невелико, пятна света вряд ли будут перекрываться и поэтому могут быть размещены точно. Затем этот процесс повторяется много раз для создания изображения. Стефан АдИнститута биофизической химии Макса Планка был удостоен 10-й премии Германии за будущее в 2006 г. и Нобелевской премии по химии в 2014 г. за разработку микроскопа STED и связанных с ним методологий. [50]

Альтернативы [ править ]

Чтобы преодолеть ограничения, установленные пределом дифракции видимого света, были разработаны другие микроскопы, в которых используются другие волны.

  • Атомно-силовой микроскоп (АСМ)
  • Сканирующий электронный микроскоп (СЭМ)
  • Сканирующая ионно- проводящая микроскопия (SICM)
  • Сканирующий туннельный микроскоп (СТМ)
  • Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)
  • Ультрафиолетовый микроскоп
  • Рентгеновский микроскоп

Важно отметить, что более высокочастотные волны имеют ограниченное взаимодействие с веществом, например, мягкие ткани относительно прозрачны для рентгеновских лучей, что приводит к различным источникам контраста и различным целевым приложениям.

Использование электронов и рентгеновских лучей вместо света обеспечивает гораздо более высокое разрешение - длина волны излучения короче, поэтому дифракционный предел ниже. Чтобы сделать коротковолновый зонд неразрушающим, была предложена система формирования изображения с помощью атомного луча ( атомный наноскоп ), которая широко обсуждается в литературе, но она еще не может конкурировать с обычными системами формирования изображения.

СТМ и АСМ - это методы сканирующего зонда с использованием небольшого зонда, который сканируется по поверхности образца. Разрешение в этих случаях ограничено размером зонда; Методы микромеханической обработки позволяют производить зонды с радиусом кончика 5–10 нм.

Кроме того, такие методы, как электронная или рентгеновская микроскопия, используют вакуум или частичный вакуум, что ограничивает их использование для живых и биологических образцов (за исключением сканирующего электронного микроскопа для окружающей среды ). Камеры для образцов, необходимые для всех таких инструментов, также ограничивают размер образца, и манипуляции с образцом более трудны. На изображениях, сделанных этими методами, цвет не виден, поэтому некоторая информация теряется. Они, однако, важны при исследовании молекулярных или атомных эффектов, таких как возраст упрочнение в алюминиевых сплавах , или микроструктуры из полимеров .

См. Также [ править ]

  • Цифровой микроскоп
  • Köhler освещение
  • Предметное стекло микроскопа

Ссылки [ править ]

  1. ^ JR Блуфорд. «Урок 2 - страница 3, КЛАССИФИКАЦИЯ МИКРОСКОПОВ» . msnucleus.org. Архивировано 10 мая 2016 года . Проверено 15 января 2017 года .
  2. ^ Системы знаний Триша. Серия IIT Foundation - Physics Class 8, 2 / e . Pearson Education India. п. 213. ISBN 978-81-317-6147-2.
  3. ^ Б Ян М. Ватт (1997). Принципы и практика электронной микроскопии . Издательство Кембриджского университета. п. 6. ISBN 978-0-521-43591-8.
  4. ^ «Покупка дешевого микроскопа для домашнего использования» (PDF) . Оксфордский университет. Архивировано 5 марта 2016 года (PDF) из оригинала . Дата обращения 5 ноября 2015 .
  5. ^ Кумар, Нареш; Weckhuysen, Bert M .; Уэйн, Эндрю Дж .; Поллард, Эндрю Дж. (Апрель 2019 г.). «Наноразмерная химическая визуализация с использованием спектроскопии комбинационного рассеяния света с наконечником» . Протоколы природы . 14 (4): 1169–1193. DOI : 10.1038 / s41596-019-0132-Z . ISSN 1750-2799 . PMID 30911174 .  
  6. ^ Ли, Джунхи; Крэмптон, Кевин Т .; Талларида, Николай; Апкарян, В. Ара (апрель 2019 г.). «Визуализация колебательных нормальных мод одиночной молекулы с атомарно ограниченным светом». Природа . 568 (7750): 78–82. DOI : 10.1038 / s41586-019-1059-9 . ISSN 1476-4687 . PMID 30944493 .  
  7. ^ Аспден, Рувим С .; Gemmell, Nathan R .; Моррис, Питер А .; Tasca, Daniel S .; Мертенс, Лена; Таннер, Майкл Дж .; Кирквуд, Роберт А .; Руджери, Алессандро; Този, Альберто; Бойд, Роберт В .; Buller, Gerald S .; Хэдфилд, Роберт Х .; Паджетт, Майлз Дж. (2015). «Фотонно-разреженная микроскопия: визуализация в видимом свете с использованием инфракрасного освещения» (PDF) . Optica . 2 (12): 1049. DOI : 10,1364 / OPTICA.2.001049 . ISSN 2334-2536 .  
  8. ^ Атти Della Fondazione Giorgio Ronchi E Contributi Dell'Istituto Nazionale Di Ottica, Том 30, La Fondazione-1975, страница 554
  9. ↑ Альберт Ван Хелден; Свен Дюпре; Роб ван Гент (2010). Истоки телескопа . Издательство Амстердамского университета. п. 24. ISBN 978-90-6984-615-6.
  10. ↑ Уильям Розенталь, Очки и другие вспомогательные средства зрения: история и руководство по коллекционированию, Norman Publishing, 1996, стр. 391–392
  11. ^ a b c Раймонд Дж. Сигер, Люди-физики: Галилео Галилей, его жизнь и его работы, Elsevier - 2016, стр. 24
  12. ^ a b c Дж. Уильям Розенталь, Очки и другие вспомогательные средства зрения: история и руководство по коллекционированию, Norman Publishing, 1996, стр. 391
  13. ↑ Альберт Ван Хелден; Свен Дюпре; Роб ван Гент (2010). Истоки телескопа . Издательство Амстердамского университета. С. 32–36, 43. ISBN 978-90-6984-615-6.
  14. ^ Van Helden , стр. 43
  15. ^ Shmaefsky, Brian (2006) Biotechnology 101 . Гринвуд. п. 171. ISBN 0313335281 . 
  16. ↑ Примечание: истории разнятся, в том числе Захариас Янссен получил помощь от своего отца Ганса Мартенса (или, как иногда говорят, полностью построил его отец). Вероятная дата рождения Захариаса 1585 г. ( Ван Хелден , стр. 28) делает маловероятным, что он изобрел его в 1590 г., а заявление об изобретении основано на показаниях сына Захариаса Янссена, Иоганнеса Захариассена, который, возможно, сфабриковал всю историю ( Ван Helden , стр.43).
  17. ^ Brian Shmaefsky, Biotechnology 101 - 2006, стр 171
  18. ^ "Кто изобрел микроскоп?" . Архивировано 3 февраля 2017 года . Проверено 31 марта 2017 года .
  19. ↑ Роберт Д. Уэрта, Делфтские гиганты: Йоханнес Вермеер и натурфилософы: параллельный поиск знаний в эпоху открытий, Bucknell University Press - 2003, стр. 126
  20. ↑ А. Марк Смит, От взгляда к свету: переход от древней к современной оптике, University of Chicago Press - 2014, стр. 387
  21. ^ Дэниел Дж. Бурстин, Первооткрыватели, Knopf Doubleday Publishing Group - 2011, стр. 327
  22. ^ Гулд, Стивен Джей (2000). «Глава 2: Зоркая рысь, обманутая природой». Лежащие камни Марракеша: предпоследние размышления в естественной истории . Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: Гармония. ISBN 978-0-224-05044-9.
  23. ^ "Il microscopio di Galileo" Архивировано 9 апреля 2008 г. в Wayback Machine , Instituto e Museo di Storia della Scienza (на итальянском языке)
  24. ^ Гулд, Стивен Джей (2000) Лежащие камни Марракеша . Книги гармонии. ISBN 0-609-60142-3 . 
  25. ^ Ридделл JL (1854). «О бинокулярном микроскопе». QJ Microsc Sci . 2 : 18–24.
  26. ^ Cassedy JH (1973). "Бицепс вибриона Джона Л. Ридделла: два документа по американской микроскопии и этиологии холеры 1849–59". J Hist Med . 28 (2): 101–108.
  27. ↑ Как использовать составной микроскоп. Архивировано 1 сентября 2013 года в Wayback Machine . Microscope.com
  28. ^ Кеннет, Весна; Келлер, Х. Эрнст; Дэвидсон, Майкл В. "Объективы микроскопа" . Ресурсный центр по микроскопии Olympus . Архивировано 1 ноября 2008 года . Проверено 29 октября 2008 года .
  29. ^ NC Pégard и JW Fleischer, "Contrast Enhancement путем многоходовых ОВФ микроскопией," CLEO: 2011, бумага CThW6 (2011).
  30. ^ O1 оптическая микроскопия архивации 24 января 2011 в Вайбак Machine По Катарина Logg. Отделение прикладной физики Чалмерса. 20 января 2006 г.
  31. ^ "Длиннофокусный микроскоп с адаптером камеры" . macrolenses.de . Архивировано 3 октября 2011 года.
  32. ^ "Квестар Максутов микроскоп" . company7.com . Архивировано из оригинального 15 июня 2011 года . Проверено 11 июля 2011 года .
  33. ^ "Длиннофокусный микроскоп FTA" . firsttenangstroms.com . Архивировано из оригинального 26 февраля 2012 года . Проверено 11 июля 2011 года .
  34. ^ Gustaf Ollsson, Прицельные, Энциклопедия Optical Engineering, Vol. 3 , CRC, 2003; стр. 2409.
  35. ↑ Приложение A, Журнал Королевского микроскопического общества , 1906; page 716. Обсуждение измерительных микроскопов Zeiss.
  36. ↑ Линдер, Кортни (22 ноября 2019 г.). «Если вы когда-нибудь хотели микроскоп для смартфона, теперь ваш шанс» . Популярная механика . Дата обращения 3 ноября 2020 .
  37. ^ Ван Путтен, EG; Акбулут, Д .; Bertolotti, J .; Vos, WL; Lagendijk, A .; Моск, АП (2011). «Рассеивающие линзы разрешают структуры размером менее 100 нм с помощью видимого света». Письма с физическим обзором . 106 (19): 193905. arXiv : 1103.3643 . Bibcode : 2011PhRvL.106s3905V . DOI : 10.1103 / PhysRevLett.106.193905 . PMID 21668161 . 
  38. ^ Courjon, D .; Булабойс Дж. (1979). «Голографическая микроскопия в реальном времени с использованием необычной голографической осветительной системы и ротационного интерферометра сдвига». Журнал оптики . 10 (3): 125. Bibcode : 1979JOpt ... 10..125C . DOI : 10,1088 / 0150-536X / 10/3/004 .
  39. ^ "Демонстрация недорогого многомодового оптического микроскопа с возможностью работы с одной молекулой" . Архивировано 6 марта 2009 года . Проверено 25 февраля 2009 года .
  40. ^ Риттер, Карл; Восход, Малин (8 октября 2014 г.). «2 американца и 1 немец получают Нобелевскую премию по химии» . AP News . Архивировано 11 октября 2014 года . Проверено 8 октября 2014 года .
  41. Рианна Чанг, Кеннет (8 октября 2014 г.). «2 американца и немец удостоены Нобелевской премии по химии» . Нью-Йорк Таймс . Архивировано 9 октября 2014 года . Проверено 8 октября 2014 года .
  42. ^ Heintzmann, Rainer (1999). Микроскопия латерально модулированного возбуждения: улучшение разрешения за счет использования дифракционной решетки . Оптическая биопсия и микроскопические методы III. 3568 . С. 185–196. DOI : 10.1117 / 12.336833 .
  43. ^ Кремер, Кристоф; Хаусманн, Майкл; Брэдл, Иоахим и Шнайдер, Бернхард "Волновой полевой микроскоп с функцией распределения точки обнаружения", Патент США 7 342 717 , дата приоритета 10 июля 1997 г.
  44. ^ Lemmer, P .; Гункель, М .; Baddeley, D .; Kaufmann, R .; Урих, А .; Weiland, Y .; Reymann, J .; Müller, P .; Hausmann, M .; Кремер, К. (2008). «SPDM: световая микроскопия с разрешением одной молекулы в наномасштабе». В прикладной физике . 93 (1): 1–12. Bibcode : 2008ApPhB..93 .... 1л . DOI : 10.1007 / s00340-008-3152-х .
  45. ^ Брэдл, Иоахим (1996). «Сравнительное исследование точности трехмерной локализации в традиционной, конфокальной лазерной сканирующей и аксиальной томографической флуоресцентной световой микроскопии». В Бигио, Ирвинг Дж; Grundfest, Warren S; Шнекенбургер, Герберт; Сванберг, Катарина; Viallet, Pierre M (ред.). Оптическая биопсия и микроскопические методы . Оптическая биопсия и микроскопические методы. 2926 . С. 201–206. DOI : 10.1117 / 12.260797 .
  46. ^ Heintzmann, R .; Münch, H .; Кремер, К. (1997). «Высокоточные измерения в эпифлуоресцентной микроскопии - моделирование и эксперимент» (PDF) . Cell Vision . 4 : 252–253. Архивировано (PDF) из оригинала 16 февраля 2016 года.
  47. ^ Кремер, Кристоф; Хаусманн, Майкл; Брэдл, Иоахим и Ринке, Бернд "Метод и устройства для измерения расстояний между конструкциями объектов", патент США 6,424,421, дата приоритета 23 декабря 1996 г.
  48. ^ Мануэль Гункель; и другие. (2009). «Двухцветная локализационная микроскопия клеточных наноструктур» (PDF) . Биотехнологический журнал . 4 (6): 927–38. DOI : 10.1002 / biot.200900005 . PMID 19548231 .  
  49. ^ Кауфманн, R; Müller, P; Hildenbrand, G; Хаусманн, М; Cremer, C; и другие. (2011). «Анализ кластеров мембранного белка Her2 / neu в различных типах клеток рака груди с использованием микроскопии локализации». Журнал микроскопии . 242 (1): 46–54. CiteSeerX 10.1.1.665.3604 . DOI : 10.1111 / j.1365-2818.2010.03436.x . PMID 21118230 .  
  50. ^ "Немецкая премия будущего за пересечение предела Аббе" . Архивировано 7 марта 2009 года . Проверено 24 февраля 2009 года .

Цитированные источники [ править ]

  • Ван Хелден, Альберт; Дюпре, Свен; Ван Гент, Роб (2011). Истоки телескопа . Издательство Амстердамского университета. ISBN 978-9069846156.

Дальнейшее чтение [ править ]

  • «Подготовка образцов для металлографических и материаловедческих исследований, световая микроскопия, анализ изображений и испытания на твердость», Kay Geels в сотрудничестве со Struers A / S, ASTM International 2006.
  • «Световая микроскопия: продолжающаяся современная революция» , Зигфрид Вайзенбургер и Вахид Сандогдар, arXiv: 1412.3255 2014.

Внешние ссылки [ править ]

  • Antique Microscopes.com Коллекция ранних микроскопов
  • Исторические микроскопы , иллюстрированная коллекция с более чем 3000 фотографиями научных микроскопов европейских производителей (на немецком языке)
  • Коллекция Голуба , коллекция микроскопов 17-19 веков, включая подробные описания
  • Молекулярные выражения , концепции в оптической микроскопии
  • Онлайн-руководство по практической оптической микроскопии
  • OpenWetWare
  • База данных, центрированная по ячейкам
  • Антони ван Левенгук: отец микроскопии и микробиологии