 | Эта статья требует дополнительных ссылок для проверки . ( февраль 2018 г. ) ( Узнайте, как и когда удалить это сообщение-шаблон ) |
Полимеразная цепная реакция расширения перекрытия (или ОЕ-ПЦР ) представляет собой вариант ПЦР . Это также называется сплайсингом путем расширения перекрытия / сплайсингом путем расширения выступа (SOE) PCR . Он используется для вставки определенных мутаций в определенные точки последовательности или для сплайсинга меньших фрагментов ДНК в более крупный полинуклеотид . [1]
Сплайсинг молекул ДНК [ править ]
Как и в большинстве реакций ПЦР, для каждой последовательности используются два праймера - по одному для каждого конца. Для сращивания двух молекул ДНК используются специальные праймеры на соединяемых концах. Для каждой молекулы праймер на конце, который нужно соединить, сконструирован таким образом, что он имеет 5'-выступ, комплементарный концу другой молекулы. После отжига, когда происходит репликация, ДНК удлиняется новой последовательностью, комплементарной молекуле, к которой она должна быть присоединена. После того, как обе молекулы ДНК удлиняются таким образом, они смешиваются и проводится ПЦР только с праймерами для дальних концов. Введенные перекрывающиеся комплементарные последовательности будут служить праймерами, и две последовательности будут слиты. Этот метод имеет преимущество перед другими методами сплайсинга генов, так как не требует сайтов рестрикции.
Для получения более высоких выходов некоторые праймеры используются в избытке, как в асимметричной ПЦР .
Введение мутаций [ править ]
Чтобы вставить мутацию в последовательность ДНК, создается специальный праймер . Праймер может содержать единственную замену или новую последовательность на своем 5'-конце. Если удаление требуется, последовательность , которая является 5' делеции добавляется, потому что 3' - конец праймера должен иметь комплементарность к шаблону нити таким образом , чтобы праймер может в достаточной степени отжигает с ДНК - матрицы.
После отжига праймера на матрице репликация ДНК продолжается до конца матрицы. Дуплекс денатурируется, и второй праймер отжигается с вновь образованной цепью ДНК, содержащей последовательность из первого праймера. Репликация продолжается, чтобы произвести цепь требуемой последовательности, содержащую мутацию.
Дуплекс снова денатурируется, и теперь первый праймер может связываться с последней цепью ДНК. Реакция репликации продолжает давать полностью димеризованный фрагмент ДНК. После дополнительных циклов ПЦР для амплификации ДНК образец можно разделить электрофорезом в агарозном геле с последующим электроэлюированием для сбора.
Эффективное создание олигонуклеотидов длиной более ~ 110 нуклеотидов очень сложно, поэтому для вставки мутации дальше в последовательность, чем позволяет праймер 110 нт, необходимо использовать ПЦР с удлинением с перекрыванием. В OE-PCR модифицируемая последовательность используется для создания двух модифицированных цепей с мутацией на противоположных концах, используя метод, описанный выше. После смешивания и денатурации нитям дают возможность отжигать с получением трех различных комбинаций, как показано на диаграмме. Только дуплекс без перекрытия на 5'-конце допускает удлинение ДНК-полимеразой в направлении от 3 'до 5'.
После разделения элюированные фрагменты подходящего размера подвергают нормальной ПЦР с использованием крайних праймеров, используемых в начальных мутагенных реакциях ПЦР.
Ссылки [ править ]
- ^ Хигути R, Krummel В, Saiki R (1988). «Общий метод подготовки in vitro и специфический мутагенез фрагментов ДНК: изучение взаимодействия белков и ДНК» . Nucleic Acids Res . 16 (15): 7351–67. DOI : 10.1093 / NAR / 16.15.7351 . PMC 338413 . PMID 3045756 .
