Из Википедии, бесплатной энциклопедии
  (Перенаправлено из оптимизации ПЦР )
Перейти к навигации Перейти к поиску

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является широко используемым инструментом молекулярно биологии для амплификации ДНК, а также различные методы для оптимизации ПЦР , которые были разработаны с помощью молекулярной биологии для повышения производительности ПЦР и свести к минимуму неудачи.

Загрязнение и ПЦР [ править ]

Метод ПЦР чрезвычайно чувствителен и требует всего нескольких молекул ДНК в одной реакции для амплификации на несколько порядков. Следовательно, необходимы адекватные меры, чтобы избежать заражения любой ДНК, присутствующей в лабораторной среде ( бактерии , вирусы или человеческие источники). Поскольку продукты предыдущих амплификаций ПЦР являются обычным источником заражения, многие лаборатории молекулярной биологии внедрили процедуры, предусматривающие разделение лаборатории на отдельные зоны. [1] Одно лабораторное пространство предназначено для подготовки и обработки реагентов до ПЦР и настройки реакции ПЦР, а другое - для обработки после ПЦР, такой как гель-электрофорез или очистка продуктов ПЦР. Для настройки реакций ПЦР многиеСтандартные рабочие процедуры включают использование пипеток с фильтрующими наконечниками и ношение свежих лабораторных перчаток , а в некоторых случаях ламинарный кабинет с УФ-лампой в качестве рабочей станции (для уничтожения любых экстранеомультимеров ). Обычно ПЦР сравнивают с реакцией отрицательного контроля, которая проводится так же, как экспериментальная ПЦР, но без ДНК-матрицы, и проводится вместе с экспериментальной ПЦР.

Заколки [ править ]

Вторичные структуры в ДНК могут приводить к сворачиванию или связыванию ДНК-матрицы или праймеров, что приводит к снижению выхода продукта или провалу реакции. Шпильки , которые состоят из внутренних складок, вызванных спариванием оснований между нуклеотидами и инвертированными повторами в одноцепочечной ДНК, являются обычными вторичными структурами и могут приводить к неудачным ПЦР.

Обычно дизайн праймера, который включает проверку потенциальных вторичных структур в праймерах или добавление ДМСО или глицерина к ПЦР для минимизации вторичных структур в матрице ДНК [2] , используется при оптимизации ПЦР, которые имеют историю неудач. из-за подозреваемых шпилек ДНК.

Ошибки полимеразы [ править ]

Полимераза Taq не обладает экзонуклеазной активностью от 3 'до 5' . Таким образом, Taq не обладает активностью считывания с защитой от ошибок, которая заключается в удалении любого вновь введенного неверно включенного нуклеотидного основания из зарождающейся (т. Е. Удлиняющейся) цепи ДНК, которая не совпадает с ее противоположным основанием в комплементарной цепи ДНК. Отсутствие проверки фермента Taq от 3 'до 5' приводит к высокому уровню ошибок (мутации на нуклеотид за цикл) примерно 1 на 10000 оснований, что влияет на точность ПЦР, особенно если ошибки возникают на ранних этапах ПЦР с низкие количества исходного материала, вызывающие накопление большой доли амплифицированной ДНК с неправильной последовательностью в конечном продукте. [3]

Несколько «высокоточных» ДНК-полимераз, имеющих сконструированную 3'-5'-экзонуклеазную активность, стали доступными, что позволяет более точную амплификацию для использования в ПЦР для секвенирования или клонирования продуктов. Примеры полимераз с экзонуклеазной активностью от 3 'до 5' включают: ДНК-полимеразу KOD, рекомбинантную форму Thermococcus kodakaraensis KOD1; Вентиляционное отверстие, извлекаемое из Thermococcus litoralis ; ДНК-полимераза Pfu , экстрагируемая из Pyrococcus furiosus ; и Pwo, который извлекается из Pyrococcus woesii . [4]

Концентрация магния [ править ]

Магний необходим в качестве кофактора для термостабильной ДНК-полимеразы. Полимераза Taq - это магний-зависимый фермент, и определение оптимальной концентрации для использования имеет решающее значение для успеха реакции ПЦР. [5] Некоторые из компонентов реакционной смеси, такие как концентрация матрицы, дНТФ и присутствие хелатирующих агентов ( ЭДТА ) или белков, могут снизить количество присутствующего свободного магния, тем самым снижая активность фермента. [6]Праймеры, которые связываются с неправильными сайтами матрицы, стабилизируются в присутствии чрезмерных концентраций магния, что приводит к снижению специфичности реакции. Чрезмерные концентрации магния также стабилизируют двухцепочечную ДНК и предотвращают полную денатурацию ДНК во время ПЦР, снижая выход продукта. [5] [6] Неадекватное оттаивание MgCl 2 может привести к образованию градиентов концентрации в растворе хлорида магния, поставляемом с ДНК-полимеразой, а также способствует множеству неудачных экспериментов. [6]

Размер и другие ограничения [ править ]

ПЦР легко работает с ДНК-матрицей длиной от двух до трех тысяч пар оснований. Однако при превышении этого размера выход продукта часто снижается, так как с увеличением длины стохастические эффекты, такие как преждевременное обрывание полимеразой, начинают влиять на эффективность ПЦР. Возможно усиление более крупных кусков до 50 000 пар оснований с помощью более медленного цикла нагрева и специальных полимераз. Это полимеразы, слитые с ДНК-связывающим белком, усиливающим процессивность, что усиливает сцепление полимеразы с ДНК. [7] [8]

Другие ценные свойства химерных полимераз TopoTaq и PfuC2 включают повышенную термостабильность, специфичность и устойчивость к загрязнителям и ингибиторам . [9] [10] Они были сконструированы с использованием уникальных ДНК-связывающих доменов спираль-шпилька-спираль (HhH) топоизомеразы V [11] гипертермофила Methanopyrus kandleri . Химерные полимеразы преодолевают многие ограничения нативных ферментов и используются в прямой ПЦР-амплификации из клеточных культур и даже образцов пищи., минуя трудоемкие этапы выделения ДНК. Сильная активность гибридной полимеразы TopoTaq по вытеснению цепей помогает решить проблемы ПЦР, которые могут быть вызваны шпильками и двойными спиралями, нагруженными G. Спирали с высоким содержанием ГХ обладают более высокой температурой плавления, что часто ухудшает ПЦР в зависимости от условий. [12]

Неспецифическая грунтовка [ править ]

Неспецифическое связывание праймеров происходит часто и может происходить по нескольким причинам. К ним относятся повторяющиеся последовательности в матрице ДНК, неспецифическое связывание между праймером и матрицей, высокое или низкое содержание GC в матрице или неполное связывание праймера, в результате чего 5'-конец праймера остается не прикрепленным к матрице. Неспецифическое связывание вырожденных праймеров также является обычным явлением. Манипулирование температурой отжига и концентрацией ионов магния может использоваться для повышения специфичности. Например, более низкие концентрации магния или других катионов могут предотвратить неспецифические взаимодействия праймеров, тем самым обеспечивая успешную ПЦР. Фермент полимеразы «горячего старта», активность которого блокируется, если он не нагревается до высокой температуры (например, 90–98 ° C) во времястадия денатурации первого цикла обычно используется для предотвращения неспецифического прайминга во время подготовки реакции при более низких температурах. Химически опосредованная ПЦР с горячим стартом требует более высоких температур и более длительного времени инкубации для активации полимеразы по сравнению с ПЦР с горячим стартом на основе антител или аптамеров. [ необходима цитата ]

Другие методы повышения специфичности включают вложенную ПЦР и Touchdown PCR .

Компьютерное моделирование теоретических результатов ПЦР ( электронная ПЦР ) может быть выполнено для помощи в разработке праймера. [13]

Полимеразная цепная реакция приземления или полимеразная цепная реакция типа приземления - это метод полимеразной цепной реакции, с помощью которого праймеры избегают амплификации неспецифических последовательностей. Температура отжига во время полимеразной цепной реакции определяет специфичность отжига праймера. Температура плавления праймера устанавливает верхний предел температуры отжига. При температурах чуть ниже этой точки будет происходить только очень специфическое спаривание оснований между праймером и матрицей. При более низких температурах праймеры связываются менее специфично. Неспецифическое связывание праймера скрывает результаты полимеразной цепной реакции, поскольку неспецифические последовательности, с которыми отжигаются праймеры на ранних этапах амплификации, будут «вытеснять» любые специфические последовательности из-за экспоненциальной природы амплификации полимеразы.

Самые ранние стадии цикла полимеразной цепной реакции касания имеют высокие температуры отжига. Температура отжига снижается пошагово для каждого последующего набора циклов (количество отдельных циклов и шагов снижения температуры выбирается экспериментатором). Праймер будет отжигаться при наивысшей температуре, что является наименее допустимым для неспецифического связывания, которое он способен переносить. Таким образом, первая амплифицированная последовательность находится между областями наибольшей специфичности праймера; скорее всего, это интересующая последовательность. Эти фрагменты будут далее амплифицироваться во время последующих раундов при более низких температурах и будут конкурировать с неспецифическими последовательностями, с которыми праймеры могут связываться при этих более низких температурах.Если праймер первоначально (во время высокотемпературных фаз) связывается с интересующей последовательностью, последующие раунды полимеразной цепной реакции могут быть выполнены с продуктом для дальнейшей амплификации этих фрагментов.

Димеры праймеров [ править ]

Отжиг 3'-конца одного праймера относительно самого себя или второго праймера может вызвать удлинение праймера, что приведет к образованию так называемых димеров праймера, видимых в виде низкомолекулярных полос на гелях для ПЦР . [14] Образование димера праймера часто конкурирует с образованием интересующего фрагмента ДНК, и его можно избежать, используя праймеры, которые сконструированы так, что им не хватает комплементарности - особенно на 3'-концах - с самим собой или с другим праймером, используемым в реакции. Если дизайн праймера ограничен другими факторами и если димеры праймеров действительно возникают, способы ограничения их образования могут включать оптимизацию концентрации MgCl 2 или повышение температуры отжига в ПЦР. [14]

Дезоксинуклеотиды [ править ]

Дезоксинуклеотиды (dNTP) могут связывать ионы Mg 2+ и, таким образом, влиять на концентрацию свободных ионов магния в реакции. Кроме того, чрезмерное количество dNTP может увеличить частоту ошибок ДНК-полимеразы и даже подавить реакцию. [5] [6] Дисбаланс в пропорции четырех дНТФ может привести к неправильному включению во вновь образованную цепь ДНК и способствовать снижению точности ДНК-полимеразы. [15]

Ссылки [ править ]

  1. ^ Балин BJ, Gérard HC, Arking EJ и др. (1998). «Идентификация и локализация Chlamydia pneumoniae в головном мозге Альцгеймера». Med. Microbiol. Иммунол . 187 (1): 23–42. DOI : 10.1007 / s004300050071 . PMID  9749980 . S2CID  25307947 . Во всех анализах были приняты особые меры, чтобы избежать перекрестного загрязнения как анализируемых образцов нуклеиновых кислот, так и реакционных смесей; такие меры включали приготовление нуклеиновых кислот в лаборатории, отдельной от тех, в которых проводились анализы ПЦР или обратной транскрипции (ОТ) -ПЦР, и использование восьми различных биологических шкафов, каждый в своей лаборатории, для проведения реакций.
  2. ^ «Часто задаваемые вопросы по полимеразам и амплификации» . Биолаборатории Новой Англии.
  3. ↑ Eckert KA, Kunkel TA (август 1991). «Верность ДНК-полимеразы и полимеразная цепная реакция» . Методы ПЦР Прил . 1 (1): 17–24. DOI : 10.1101 / gr.1.1.17 . PMID 1842916 .  
  4. ^ Лундберг, Келли S .; Сапожник, Дэн Д.; Адамс, Майкл WW; Шорт, Джей М .; Зорге, Джозеф А .; Матур, Эрик Дж. (1991). «Высокоточная амплификация с использованием термостабильной ДНК-полимеразы, выделенной из Pyrococcus furiosus». Джин . 108 (1): 1–6. DOI : 10.1016 / 0378-1119 (91) 90480-у . PMID 1761218 . 
  5. ^ a b c Markoulatos P, Siafakas N, Moncany M (2002). «Мультиплексная полимеразная цепная реакция: практический подход» . J. Clin. Лаборатория. Анальный . 16 (1): 47–51. DOI : 10.1002 / jcla.2058 . PMC 6808141 . PMID 11835531 .  
  6. ^ a b c d «Протоколы и рекомендации по амплификации нуклеиновых кислот» . Архивировано из оригинала на 2009-02-02 . Проверено 28 января 2009 . Цитировать журнал требует |journal=( помощь )
  7. ↑ Павлов А.Р., Белова Г.И., Козявкин С.А., Слесарев А.И. (2002). «Мотивы спираль-шпилька-спираль придают устойчивость к соли и процессивность химерным ДНК-полимеразам» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 99 (21): 3510–13515. Bibcode : 2002PNAS ... 9913510P . DOI : 10.1073 / pnas.202127199 . PMC 129704 . PMID 12368475 .  
  8. ↑ Демидов В.В. (2002). «Счастливый брак: развитие ДНК-полимераз с добавками ДНК-топоизомеразы». Trends Biotechnol . 20 (12): 491. DOI : 10.1016 / S0167-7799 (02) 02101-7 .
  9. ↑ Павлов А.Р., Павлова Н.В., Козявкин С.А., Слесарев А.И. (2004). «Последние разработки в области оптимизации термостабильных ДНК-полимераз для эффективного применения». Trends Biotechnol . 22 (5): 253–260. DOI : 10.1016 / j.tibtech.2004.02.011 . PMID 15109812 . 
  10. ↑ Павлов А.Р., Павлова Н.В., Козявкин С.А., Слесарев А.И. (2004). «Термостабильные химерные ДНК-полимеразы с высокой устойчивостью к ингибиторам» . Амплификация ДНК: современные технологии и приложения . Horizon Bioscience. С. 3–20. ISBN 0-9545232-9-6.
  11. ^ Фортер P (2006). «ДНК-топоизомераза V: новая складка загадочного происхождения». Trends Biotechnol . 24 (6): 245–247. DOI : 10.1016 / j.tibtech.2006.04.006 . PMID 16650908 . 
  12. ↑ Павлов А.Р., Павлова Н.В., Козявкин С.А., Слесарев А.И. (2006). «Термостабильные ДНК-полимеразы для широкого спектра применений: сравнение надежного гибридного TopoTaq с другими ферментами» . В Kieleczawa J (ред.). Секвенирование ДНК II: Оптимизация подготовки и очистки . Джонс и Бартлетт. С. 241–257. ISBN 0-7637-3383-0.
  13. ^ «Электронная ПЦР» . NCBI - Национальный центр биотехнологической информации . Проверено 13 марта 2012 года .
  14. ^ a b Kramer MF, Coen DM (август 2006 г.). «Ферментативная амплификация ДНК методом ПЦР: стандартные процедуры и оптимизация». Curr Protoc Cytom . Приложение 3: A.3K.1 – A.3K.15. DOI : 10.1002 / 0471142956.cya03ks37 . PMID 18770830 . S2CID 4658404 .  
  15. ^ Кунц BA, Kohalmi SE (1991). «Модуляция мутагенеза уровнями дезоксирибонуклеотидов». Анну. Преподобный Жене . 25 : 339–59. DOI : 10.1146 / annurev.ge.25.120191.002011 . PMID 1812810 .