Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Бактериальный сферопласт, обработанный стеклянной пипеткой
Запись тока с помощью патч-зажима выявляет переходы между двумя состояниями проводимости одного ионного канала: закрытым (вверху) и открытым (внизу).

Метод патч-зажима - это лабораторный метод в электрофизиологии, используемый для изучения ионных токов в отдельных изолированных живых клетках , срезах тканей или участках клеточной мембраны. Этот метод особенно полезен при изучении возбудимых клеток, таких как нейроны , кардиомиоциты , мышечные волокна и бета-клетки поджелудочной железы , а также может применяться для исследования бактериальных ионных каналов в специально подготовленных гигантских сферопластах .

Зажим патча может быть выполнен с использованием метода фиксации напряжения . В этом случае напряжение на клеточной мембране контролируется экспериментатором, и результирующие токи регистрируются. В качестве альтернативы можно использовать токовые клещи . В этом случае ток, проходящий через мембрану, контролируется экспериментатором, и результирующие изменения напряжения регистрируются, как правило, в форме потенциалов действия .

Эрвин Неер и Берт Сакманн разработали патч-зажим в конце 1970-х - начале 1980-х годов. Это открытие позволило впервые зарегистрировать токи молекул одиночных ионных каналов, что улучшило понимание участия каналов в фундаментальных клеточных процессах, таких как потенциалы действия и нервная активность. За эту работу Неер и Сакманн получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 1991 году. [1]

Базовая техника [ править ]

Настройка [ править ]

Классический патч-зажим с микроскопом , антивибрационным столом и микроманипуляторами

Во время записи с зажимом патч-зажим полая стеклянная трубка, известная как микропипетка или патч-пипетка, заполненная раствором электролита, и записывающий электрод, подключенный к усилителю, контактируют с мембраной изолированной ячейки . Другой электрод помещают в ванну, окружающую клетку или ткань, в качестве заземляющего электрода сравнения. Между регистрирующим электродом и электродом сравнения может быть сформирована электрическая цепь, а между ними - интересующая ячейка.

Схематическое изображение съемника пипеток, используемого для изготовления микропипеток для фиксации патч-зажима и других записей.
Цепь формируется при цельноклеточном или перфорированном патч-зажиме

Раствор, заполняющий патч-пипетку, может соответствовать ионному составу раствора ванны, как в случае записи с прикрепленными клетками, или соответствовать цитоплазме для записи целых клеток. Раствор в растворе для ванны может соответствовать физиологическому внеклеточному раствору, цитоплазме или быть полностью нефизиологическим, в зависимости от проводимого эксперимента. Исследователь также может изменить содержание раствора для ванны (или, реже, раствора для пипетки), добавляя ионы или лекарства для изучения ионных каналов в различных условиях.

В зависимости от того, что исследователь пытается измерить, диаметр используемого наконечника пипетки может варьироваться, но обычно он находится в диапазоне микрометров . [2] Этот небольшой размер используется для ограждения участка поверхности клеточной мембраны или «участка», который часто содержит только одну или несколько молекул ионных каналов. [3] Этот тип электрода отличается от «острого микроэлектрода», используемого для прокалывания клеток при традиционных внутриклеточных записях , тем, что он запечатан на поверхности клеточной мембраны, а не вставлен через нее.

Типичное оборудование, используемое во время классической записи патч-зажим

В некоторых экспериментах, кончик микропипетки нагревает в microforge для получения гладкой поверхности , что способствует формированию высокого сопротивления уплотнения с клеточной мембраной. Чтобы получить это уплотнение с высоким сопротивлением, микропипетка прижимается к клеточной мембране и применяется отсасывание. Часть клеточной мембраны всасывается в пипетку, создавая омега- образную область мембраны, которая, если она сформирована должным образом, создает сопротивление в диапазоне 10–100 гигаомов , называемое «гигаомным уплотнением» или «гигаомным». [3] Высокое сопротивление этого уплотнения позволяет изолировать токи, измеряемые через участок мембраны, с помощью небольшого конкурирующего шума., а также обеспечивает некоторую механическую стабильность записи. [4]

Запись [ править ]

Патч-зажим нервной клетки в срезе ткани головного мозга. Пипетка на фотографии отмечена голубым цветом.

Многие усилители с коммутационным зажимом не используют схему фиксации напряжения , а представляют собой дифференциальные усилители, которые используют электрод ванны для установки нулевого уровня тока (заземления). Это позволяет исследователю поддерживать постоянное напряжение, наблюдая за изменениями тока . Чтобы сделать эти записи, патч-пипетка сравнивается с заземляющим электродом. Затем в систему подается ток для поддержания постоянного заданного напряжения. Ток, необходимый для ограничения напряжения, противоположен по знаку и равен по величине току через мембрану. [3]

В качестве альтернативы, ячейка может быть ограничена по току в режиме всей ячейки, поддерживая постоянный ток, наблюдая за изменениями напряжения на мембране . [5]

Варианты [ править ]

Диаграмма, показывающая варианты техники патч-зажима

В зависимости от того, что исследователь хочет изучить, могут применяться несколько вариаций базовой техники. Методы «наизнанку-наружу» и «наружу-наружу» называются методами «вырезанного пятна», потому что пластырь иссекается (удаляется) с основного тела клетки. Прикрепленные клетки и оба метода иссеченного пластыря используются для изучения поведения отдельных ионных каналов в секции мембраны, прикрепленной к электроду.

Пластырь целой ячейки и перфорированный пластырь позволяют исследователю изучать электрическое поведение всей ячейки вместо одиночных токов канала. Цельноклеточный пластырь, который обеспечивает электрический доступ с низким сопротивлением внутрь клетки, в настоящее время в значительной степени заменил методы записи с использованием микроэлектродов с высоким сопротивлением для регистрации токов через всю клеточную мембрану.

Прикрепленный к ячейке патч [ править ]

Конфигурация прикрепленного к ячейке патча

Для этого метода пипетка запечатывается на клеточной мембране для получения гигазеального вещества, при этом гарантируя, что клеточная мембрана остается неповрежденной. Это позволяет регистрировать токи через один или несколько ионных каналов, содержащихся в участке мембраны, захваченном пипеткой. Прикрепляясь только к внешней части клеточной мембраны, структура клетки практически не нарушается. [3] Кроме того, если не нарушать внутреннюю часть клетки, любые внутриклеточные механизмы, обычно влияющие на канал, все равно смогут функционировать так, как они будут физиологически. [6] Используя этот метод, также относительно легко получить правильную конфигурацию, и после ее получения она довольно стабильна. [7]

Для лиганд-управляемых ионных каналов или каналов, которые модулируются метаботропными рецепторами , исследуемый нейромедиатор или лекарственное средство обычно включается в раствор для пипетки, где он может взаимодействовать с тем, что раньше было внешней поверхностью мембраны. Результирующая активность канала может быть связана с используемым лекарственным средством, хотя обычно невозможно затем изменить концентрацию лекарственного средства внутри пипетки. Таким образом, методика ограничена одной точкой кривой доза-ответ на пластырь. Следовательно, доза-реакция достигается с использованием нескольких ячеек и пластырей. Однако потенциалзависимые ионные каналымогут быть зажаты последовательно при разных мембранных потенциалах в одном пластыре. Это приводит к активации канала как функции напряжения, и полная кривая ВАХ (вольт-амперная характеристика) может быть построена только за один участок. Другой потенциальный недостаток этого метода заключается в том, что, поскольку внутриклеточные пути клетки не нарушены, они также не могут быть напрямую изменены. [7]

Патч наизнанку [ править ]

Конфигурация патча наизнанку

В методе «наизнанку-наружу» пластырь мембраны прикрепляется к пипетке для пластыря, отделяется от остальной части клетки, и цитозольная поверхность мембраны подвергается воздействию внешней среды или ванны. [8] Одним из преимуществ этого метода является то, что экспериментатор имеет доступ к внутриклеточной поверхности мембраны через ванну и может изменять химический состав того, чему подвергается поверхность мембраны. Это полезно, когда экспериментатор желает манипулировать окружающей средой на внутриклеточной поверхности одиночных ионных каналов. Например, каналы, которые активируются внутриклеточными лигандами, затем могут быть изучены с помощью диапазона концентраций лигандов.

Для достижения конфигурации «наизнанку-наружу» пипетка прикрепляется к клеточной мембране, как в режиме прикрепления к клетке, образуя гигазу, а затем втягивается, чтобы отделить участок мембраны от остальной части клетки. Удаление мембранного пластыря часто сначала приводит к образованию мембранного пузырька на кончике пипетки, потому что концы мембранного пластыря быстро сливаются вместе после иссечения. Затем необходимо вскрыть внешнюю поверхность везикулы, чтобы перейти в режим «наизнанку»; это может быть сделано путем кратковременного проведения мембраны через границу раздела раствор / воздух в ванне, воздействия раствора с низким содержанием Ca 2+ или кратковременного контакта с каплей парафина или куском отвержденного силиконового полимера.[9]

Запись всей клетки или патч целой клетки [ править ]

Конфигурация пластыря для всей клетки

Запись целых клеток включает в себя регистрацию токов по нескольким каналам одновременно в большой области клеточной мембраны. Электрод остается на ячейке, как в записях, прикрепленных к ячейке, но применяется большее всасывание, чтобы разорвать мембранный пластырь, тем самым обеспечивая доступ изнутри пипетки во внутриклеточное пространство ячейки. Это дает возможность применять и изучать, как лечение (например, лекарства) может влиять на клетки в режиме реального времени. [10]После того, как пипетка прикреплена к клеточной мембране, есть два метода сломать пластырь. Первый - усилить всасывание. Количество и продолжительность этого всасывания зависит от типа ячейки и размера пипетки. Другой метод требует подачи большого импульса тока через пипетку. Величина приложенного тока и длительность импульса также зависят от типа ячейки. [7] Для некоторых типов клеток удобно применять оба метода одновременно, чтобы сломать заплату.

Преимущество записи с фиксацией на всей ячейке перед записью с использованием метода острого электрода состоит в том, что большее отверстие на конце электрода с фиксацией метки обеспечивает более низкое сопротивление и, таким образом, лучший электрический доступ к внутренней части ячейки. [11] [10] Недостатком этого метода является то, что, поскольку объем электрода больше, чем объем ячейки, растворимое содержимое внутри ячейки будет медленно заменяться содержимым электрода. Это называется электродом, «диализирующим» содержимое клетки. [7] Через некоторое время любые свойства клетки, зависящие от растворимого внутриклеточного содержимого, изменятся. Используемый пипеточный раствор обычно приближается к высокому уровню калия.среды внутри клетки, чтобы свести к минимуму любые изменения, которые это может вызвать. Часто в начале записи всей клетки есть период, когда можно провести измерения до того, как клетка будет диализована. [7]

Патч Outside-Out [ править ]

Техника формирования патчей снаружи. По порядку: верхний левый, верхний правый, нижний левый, нижний правый

Название «снаружи-наружу» подчеркивает как комплементарность этой техники методике «наизнанку», так и тот факт, что она размещает внешнюю, а не внутриклеточную поверхность клеточной мембраны на внешней стороне пластыря мембраны по отношению к пластырю-электроду. . [6]

Формирование патча наружу начинается с конфигурации записи всей клетки. После того, как цельноклеточная конфигурация сформирована, электрод медленно вынимается из клетки, позволяя пузырю мембраны вырваться из клетки. Когда электрод отодвинут достаточно далеко, пузырек отсоединится от ячейки и превратится в выпуклую мембрану на конце электрода (как шар, открытый на кончике электрода), причем исходная часть мембраны будет обращена наружу от электрода. электрод. [6]Как показано на изображении справа, это означает, что жидкость внутри пипетки будет имитировать внутриклеточную жидкость, в то время как исследователь может перемещать пипетку и пузырек с его каналами в другую ванну с раствором. Хотя в пузыре мембраны может существовать несколько каналов, запись по одному каналу также возможна в этой конформации, если пузырек отслоившейся мембраны небольшой и содержит только один канал. [12]

Патч снаружи дает экспериментатору возможность исследовать свойства ионного канала, когда он изолирован от клетки и подвергается последовательному воздействию различных растворов на внеклеточной поверхности мембраны. Экспериментатор может перфузировать один и тот же пластырь различными растворами за относительно короткий промежуток времени, и если канал активируется нейротрансмиттером или лекарством с внеклеточного лица, тогда может быть получена кривая доза-ответ . [13]Эта способность измерять ток через один и тот же кусок мембраны в разных растворах является явным преимуществом внешнего пластыря по сравнению с методом прикрепления клеток. С другой стороны, сделать это труднее. Более длительный процесс формирования включает в себя больше шагов, которые могут потерпеть неудачу, и приводит к меньшей частоте используемых исправлений.

Перфорированная нашивка [ править ]

Техника перфорированной нашивки

Этот вариант метода патч-зажима очень похож на цельноклеточную конфигурацию. Основное различие заключается в том, что когда экспериментатор формирует гигаомное уплотнение, отсасывание не используется для разрыва заплаты мембраны. Вместо этого электродный раствор содержит небольшие количества противогрибкового или антибиотического агента, такого как амфотерицин-B , нистатин или грамицидин , который диффундирует в пластырь мембраны и образует небольшие поры в мембране, обеспечивая электрический доступ внутрь клетки. [14]Сравнивая методы цельноклеточного и перфорированного пластыря, можно представить себе целоклеточный пластырь как открытую дверь, в которой происходит полный обмен между молекулами в растворе пипетки и цитоплазмой. Перфорированный пластырь можно сравнить с дверцей экрана, которая обеспечивает обмен только определенных молекул из раствора пипетки в цитоплазму клетки.

Преимущества метода перфорированного пластыря по сравнению с записями целых клеток включают свойства пор антибиотика, которые позволяют уравновешивать только небольшие одновалентные ионы между пипеткой-пластырем и цитозолем, но не более крупные молекулы, которые не могут проникать через поры. Это свойство поддерживает эндогенные уровни двухвалентных ионов, таких как Ca 2+, и сигнальных молекул, таких как цАМФ . Следовательно, можно иметь записи всей клетки, как при зажимании участка целой клетки, при сохранении большинства внутриклеточных сигнальных механизмов, как в записях, прикрепленных к клеткам. В результате сокращается текущая перегрузка, а стабильная запись перфорированных патчей может длиться более одного часа. [14]К недостаткам относится более высокое сопротивление доступу по сравнению с целой ячейкой из-за частичной мембраны, занимающей кончик электрода. Это может снизить текущее разрешение и увеличить шум записи. Также может потребоваться значительное время, чтобы антибиотик пробил мембрану (около 15 минут для амфотерицина-B и даже больше для грамицидина и нистатина). Мембрана под кончиком электрода ослаблена отверстиями, образованными антибиотиком, и может разорваться. Если пластырь разрывается, запись выполняется в режиме целой клетки, при этом антибиотик заражает внутреннюю часть клетки. [14]

Свободный патч [ править ]

Техника незакрепленного патч-зажима

Свободный зажимной накладной отличается от других методов, обсуждаемых здесь, тем, что в нем используется неплотное уплотнение (низкое электрическое сопротивление), а не плотный гигабайт, используемый в традиционной технике. Этот метод использовался еще в 1961 году, как описано в статье Стрикхольма об импедансе поверхности мышечной клетки [15], но не получил особого внимания до тех пор, пока не был снова использован и назван Альмерсом, Стэнфилдом и Штюмером. в 1982 году [16] после того, как патч-зажим стал основным инструментом электрофизиологии.

Чтобы получить свободный патч-зажим на клеточной мембране, пипетка медленно перемещается по направлению к ячейке, пока электрическое сопротивление контакта между ячейкой и пипеткой не возрастет до в несколько раз большего сопротивления, чем сопротивление одного электрода. Чем ближе пипетка подходит к мембране, тем больше становится сопротивление наконечника пипетки, но если слишком близко, образуется уплотнение, и может стать трудно удалить пипетку, не повредив ячейку. Для техники «рыхлого пластыря» пипетка не приближается достаточно близко к мембране, чтобы образовать гигазальное или постоянное соединение, а также не проткнуть клеточную мембрану. [17] Клеточная мембрана остается неповрежденной, а отсутствие плотного уплотнения создает небольшой зазор, через который ионы могут проходить за пределы клетки, не попадая в пипетку.

Существенным преимуществом неплотного уплотнения является то, что используемую пипетку можно многократно снимать с мембраны после записи, и при этом мембрана останется неповрежденной. Это позволяет проводить повторные измерения в различных местах одной и той же ячейки без нарушения целостности мембраны. Эта гибкость была особенно полезна исследователям для изучения мышечных клеток, когда они сокращаются в реальных физиологических условиях, быстрого получения записей и без применения радикальных мер, чтобы остановить сокращение мышечных волокон. [16]Основным недостатком является то, что сопротивление между пипеткой и мембраной значительно снижается, что позволяет току течь через уплотнение и значительно снижает разрешение малых токов. Однако эту утечку можно частично исправить, что дает возможность сравнивать и противопоставлять записи, сделанные из разных областей на интересующей ячейке. Исходя из этого, было подсчитано, что метод свободной коммутации может разрешить токи менее 1 мА / см 2 . [17]

Автоматическое закрепление патча [ править ]

Недавно были разработаны автоматизированные системы фиксации заплат , чтобы собирать большие объемы данных недорого за более короткий период времени. Такие системы обычно включают одноразовое микрожидкостное устройство, отлитый под давлением или литой чип из полидиметилсилоксана (PDMS), для захвата ячейки или ячеек, а также интегрированный электрод.

В одной из форм такой автоматизированной системы используется перепад давления, чтобы заставить исследуемые клетки тянуться к отверстию пипетки до тех пор, пока они не образуют гигазу. Затем при кратковременном воздействии на кончик пипетки атмосферы часть мембраны, выступающая из пипетки, лопается, и теперь мембрана находится в вывернутой наизнанку конформации на кончике пипетки. В полностью автоматизированной системе пипетка и мембранный пластырь могут затем быстро перемещаться через серию различных тестовых растворов, что позволяет наносить различные тестируемые соединения на внутриклеточную сторону мембраны во время записи. [18]

См. Также [ править ]

  • Биоэлектроника
  • Теория кабеля
  • Каннелом
  • Каналомика
  • Уравнение потока GHK
  • Уравнение гольдмана
  • Матрица микроэлектродов
  • Планарный патч-зажим
  • Подготовка ломтиков

Ссылки [ править ]

  1. ^ "Нобелевская премия по физиологии и медицине 1991" . nobelprize.org . Nobel Media AB . Проверено 8 ноября 2014 года .
  2. ^ Баннистер, Ниль (1 ноября 2012). Лэнгтон, Фил (ред.). Основное руководство по чтению биомедицинских статей: признание и интерпретация передового опыта . Вили-Блэквелл. DOI : 10.1002 / 9781118402184 . ISBN 9781118402184.
  3. ^ a b c d Сакманн, Б .; Неер, Э. (1984). «Патч-зажим методы для изучения ионных каналов в возбудимых мембранах». Ежегодный обзор физиологии . 46 : 455–472. DOI : 10.1146 / annurev.ph.46.030184.002323 . hdl : 21.11116 / 0000-0000-D552-3 . PMID 6143532 . 
  4. ^ Сигворт, Фредрик Дж .; Нехер, Э. (2 октября 1980 г.). «Токи одиночных каналов Na + наблюдаются в культивируемых мышечных клетках крысы». Природа . 287 (5781): 447–449. Bibcode : 1980Natur.287..447S . DOI : 10.1038 / 287447a0 . PMID 6253802 . S2CID 4238010 .  
  5. ^ Эллен Кови; Мэтт Картер (2015). Основные электрофизиологические методы . Издательство Оксфордского университета. С. 22–. ISBN 978-0-19-993980-0.
  6. ^ a b c Хэмилл OP, Марти A, Neher E, Sakmann B, Sigworth FJ .; Марти; Neher; Сакманн; Сигворт (1981). «Усовершенствованные методы фиксации патч-зажима для записи тока с высоким разрешением от клеток и бесклеточных мембранных участков». Pflügers Archiv: Европейский журнал физиологии . 391 (2): 85–100. CiteSeerX 10.1.1.456.107 . DOI : 10.1007 / BF00656997 . PMID 6270629 . S2CID 12014433 .   CS1 maint: multiple names: authors list (link)
  7. ^ a b c d e Моллеман, Арелес (6 марта 2003 г.). Зажим патчем: вводное руководство по электрофизиологии зажима патчем . Вайли. DOI : 10.1002 / 0470856521 . ISBN 9780470856529.
  8. ^ Veitinger, Софи (2011-11-09). «Техника патч-зажим» . Научная лаборатория . Leica Microsystems . Проверено 10 ноября 2014 года .
  9. ↑ Огден, Дэвид; Стэнфилд, Питер. «Методы зажима патчем» (PDF) . utdallas.edu . С. 53–78 . Проверено 11 ноября 2014 года .
  10. ^ a b Сегев, Амир; Гарсия-Оскос, Франциско; Куррих, Саид (15.06.2016). «Записи патч-зажима целых клеток в срезах головного мозга» . Журнал визуализированных экспериментов (112): e54024. DOI : 10.3791 / 54024 . ISSN 1940-087X . PMC 4927800 . PMID 27341060 .   
  11. ^ Стейли, KJ; Отис, ТС; Моди, I (1 мая 1992 г.). «Мембранные свойства клеток гранул зубчатой ​​извилины: сравнение острых микроэлектродных и цельноклеточных записей». Журнал нейрофизиологии . 67 (5): 1346–1358. DOI : 10,1152 / jn.1992.67.5.1346 . PMID 1597717 . 
  12. ^ Хау, младший; Калл-Кэнди, SG; Колкухун, Д. (январь 1991 г.). «Токи через одиночные каналы рецепторов глутамата в участках, выходящих наружу из гранулярных клеток мозжечка крысы» . Журнал физиологии . 432 (1): 143–202. DOI : 10.1113 / jphysiol.1991.sp018381 . PMC 1181322 . PMID 1715916 .  
  13. ^ фон Бекерат, N; Adelsberger, H; Парзефаль, F; Franke, C; Дудель, Дж (апрель 1995 г.). «ГАМКергическое подавление глубоких разгибателей брюшных мышц раков демонстрирует резкую зависимость доза-ответ и высокую степень взаимодействия». Европейский журнал физиологии . 429 (6): 781–788. DOI : 10.1007 / bf00374801 . PMID 7541524 . S2CID 7824699 .  
  14. ^ a b c Линли, Джон (2013). «Запись перфорированной цельной клетки патч-зажимом». В Гампере, Никита (ред.). Ионные каналы . Методы молекулярной биологии. 998 (Второе изд.). Humana Press. С. 149–157. DOI : 10.1007 / 978-1-62703-351-0_11 . ISBN 978-1-62703-351-0. PMID  23529427 .
  15. ^ Strickholm, А (1 июля 1961). «Импеданс небольшого электрически изолированного участка поверхности мышечной клетки» . Журнал общей физиологии . 44 (6): 1073–88. DOI : 10,1085 / jgp.44.6.1073 . PMC 2195146 . PMID 19873540 .  
  16. ^ а б Альмерс В., Stanfield PR, Stühmer W. (1983). «Боковое распределение натриевых и калиевых каналов в скелетных мышцах лягушки: измерения с помощью метода патч-зажима» . Журнал физиологии . 336 (10): 261–284. DOI : 10.1113 / jphysiol.1983.sp014580 . PMC 1198969 . PMID 6308223 .  
  17. ^ а б Лупа, МП; Колдуэлл, Дж. Х (ноябрь 1991 г.). «Влияние агрина на распределение ацетилхолиновых рецепторов и натриевых каналов на взрослых скелетных мышечных волокнах в культуре» . Журнал клеточной биологии . 115 (3): 765–778. DOI : 10,1083 / jcb.115.3.765 . PMC 2289169 . PMID 1655812 .  
  18. ^ Боулби, Марк; Меррилл, Томас; Васильев, Дмитрий (2005). «Разработка нового автоматизированного метода записи ионных каналов с использованием вывернутых наизнанку целых клеточных мембран» . Журнал биомолекулярного скрининга . 10 (8): 806–813. DOI : 10.1177 / 1087057105279481 . PMID 16234349 . 

Внешние ссылки [ править ]

  • Альтернативные изображения для вариантов патч-зажимов
  • Анимация метода патч-зажима