Из Википедии, бесплатной энциклопедии
  (Перенаправлено с фазоконтрастного микроскопа )
Перейти к навигации Перейти к поиску

Фазово-контрастная микроскопия - это метод оптической микроскопии , который преобразует фазовые сдвиги света, проходящего через прозрачный образец, в изменения яркости изображения. Сами фазовые сдвиги невидимы, но становятся видимыми, когда отображаются как изменения яркости.

Когда световые волны проходят через среду, отличную от вакуума , взаимодействие со средой вызывает изменение амплитуды и фазы волны в зависимости от свойств среды. Изменения амплитуды (яркости) возникают из-за рассеяния и поглощения света, которое часто зависит от длины волны и может приводить к появлению цветов. Фотографическое оборудование и человеческий глаз чувствительны только к колебаниям амплитуды. Таким образом, без специальных мер фазовые переходы невидимы. Тем не менее, фазовые изменения часто несут важную информацию.

Те же клетки, полученные с помощью традиционной светлопольной микроскопии (слева) и фазово-контрастной микроскопии (справа)

Фазово-контрастная микроскопия особенно важна в биологии. Он выявляет многие клеточные структуры, которые невидимы в светлопольном микроскопе , как показано на рисунке. Эти структуры были сделаны видимыми для более ранних микроскопистов путем окрашивания , но это потребовало дополнительной подготовки и гибели клеток. Фазово-контрастный микроскоп позволил биологам изучать живые клетки и то, как они размножаются посредством деления клеток . Это один из немногих доступных методов количественной оценки клеточной структуры и компонентов, в котором не используется флуоресценция . [1] После изобретения в начале 1930-х годов [2]Фазово-контрастная микроскопия оказалась таким достижением в микроскопии, что ее изобретатель Фриц Зернике был удостоен Нобелевской премии по физике в 1953 г. [3]

Принцип работы [ править ]

Принцип работы темнопольного и фазово-контрастного микроскопов

Основной принцип визуализации фазовых изменений в фазово-контрастной микроскопии состоит в том, чтобы отделить освещающий (фоновый) свет от света, рассеянного образцом (который составляет детали переднего плана), и по-разному управлять ими.

Кольцевой световой индикатор (зеленый), проходящий через кольцевое пространство конденсатора, фокусируется конденсатором на образец. Часть освещающего света рассеивается образцом (желтый). Оставшийся свет не зависит от образца и образует фоновый свет (красный). При наблюдении за неокрашенным биологическим образцом рассеянный свет является слабым и обычно сдвинут по фазе на -90 ° (как из-за типичной толщины образцов, так и из-за разницы показателей преломления между биологической тканью и окружающей средой) относительно фонового света. Это приводит к тому, что передний план (синий вектор) и фон (красный вектор) имеют почти одинаковую интенсивность, что приводит к низкому контрасту изображения .

В фазово-контрастном микроскопе контраст изображения увеличивается двумя способами: за счет создания конструктивной интерференции между рассеянными и фоновыми световыми лучами в областях поля зрения, в которых находится образец, и за счет уменьшения количества фонового света, который достигает плоскости изображения. . Во-первых, фоновый свет сдвигается по фазе на -90 °, пропуская его через кольцо фазового сдвига, что устраняет разность фаз между фоном и рассеянными световыми лучами.

Принцип работы фазово-контрастной микроскопии.gif

Когда свет затем фокусируется на плоскости изображения (где размещается камера или окуляр), этот фазовый сдвиг приводит к тому, что фоновые и рассеянные световые лучи, исходящие из областей поля зрения, содержащих образец (т.е. передний план), конструктивно мешают , что приводит к увеличению яркости этих областей по сравнению с областями, не содержащими образец. Наконец, фон затемняется на ~ 70-90% серым фильтром.звенеть; этот метод максимизирует количество рассеянного света, генерируемого освещающим (т. е. фоновым) светом, в то же время минимизируя количество освещающего света, который достигает плоскости изображения. Часть рассеянного света, который освещает всю поверхность фильтра, будет сдвинут по фазе и затемнен кольцами, но в гораздо меньшей степени, чем фоновый свет, который освещает только кольца фазового сдвига и серого фильтра.

Выше описан отрицательный фазовый контраст . В положительной форме фоновый свет сдвинут по фазе на + 90 °. Таким образом, фоновый свет будет сдвинут по фазе на 180 ° относительно рассеянного света. Затем рассеянный свет будет вычтен из фонового света, чтобы сформировать изображение с более темным передним планом и более светлым фоном, как показано на первом рисунке. [4] [5] [6]

Связанные методы [ править ]

Клетки S cerevisiae, полученные с помощью ДИК-микроскопии
Количественная фазово-контрастной микроскопии изображение клеток в культуре. Высота и цвет точки изображения соответствуют оптической толщине, которая зависит только от толщины объекта и относительного показателя преломления . Таким образом, объем объекта можно определить, если известна разница в показателе преломления между объектом и окружающей средой.

Успех фазово-контрастного микроскопа привел к появлению ряда последующих методов фазовой визуализации . В 1952 году Жорж Номарски запатентовал то, что сегодня известно как микроскопия с дифференциальным интерференционным контрастом (ДИК) . [7] Повышает контраст за счет создания искусственных теней, как будто объект освещен сбоку. Но ДИК-микроскопия не подходит, когда объект или его контейнер изменяют поляризацию. С ростом использования поляризационных пластиковых контейнеров в клеточной биологии, ДИК-микроскопия все чаще заменяется модулирующей контрастной микроскопией Хоффмана , изобретенной Робертом Хоффманом в 1975 году [8].

Традиционные методы фазового контраста увеличивают контраст оптически, смешивая информацию о яркости и фазе в одном изображении. С момента появления цифровой камеры в середине 1990-х годов было разработано несколько новых методов цифровой фазовой визуализации, известных под общим названием количественная фазово-контрастная микроскопия . Эти методы создают в цифровом виде два отдельных изображения, обычное изображение в светлом поле и так называемое изображение с фазовым сдвигом . В каждой точке изображения изображение с фазовым сдвигом отображает количественный фазовый сдвиг, индуцированный объектом, который пропорционален оптической толщине объекта. [9]

См. Также [ править ]

  • Визуализация живых клеток
  • Фазово-контрастное изображение
  • Фазово-контрастное рентгеновское изображение

Ссылки [ править ]

  1. ^ "Фазово-контрастный микроскоп" . Nobel Media AB.
  2. ^ Зернике, Ф. (1955). «Как я обнаружил фазовый контраст». Наука . 121 (3141): 345–349. Bibcode : 1955Sci ... 121..345Z . DOI : 10.1126 / science.121.3141.345 . PMID 13237991 . 
  3. ^ "Нобелевская премия по физике 1953" . Nobel Media AB.
  4. Фриц Зернике (1942). «Фазовый контраст, новый метод микроскопического наблюдения прозрачных объектов, часть I». Physica . 9 (7): 686–698. Bibcode : 1942Phy ..... 9..686Z . DOI : 10.1016 / S0031-8914 (42) 80035-X .
  5. Фриц Зернике (1942). «Фазовый контраст, новый метод микроскопического наблюдения прозрачных объектов, часть II». Physica . 9 (10): 974–980. Bibcode : 1942Phy ..... 9..974Z . DOI : 10.1016 / S0031-8914 (42) 80079-8 .
  6. Оскар Ричардс (1956). «Фазовая микроскопия 1954-56 гг.». Наука . 124 (3226): 810–814. Bibcode : 1956Sci ... 124..810R . DOI : 10.1126 / science.124.3226.810 .
  7. ^ US2924142 , Жорж Номарски, "УСТРОЙСТВО ИНТЕРФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ПОЛЯРИЗАЦИИ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ФАЗОВЫХ ОБЪЕКТОВ" 
  8. ^ US4200354 , Роберт Хоффман, «Системы микроскопии с прямоугольным освещением, особенно приспособленные для наблюдения за прозрачными объектами» 
  9. ^ Kemmler, M .; Fratz, M .; Giel, D .; Saum, N .; Бранденбург, А .; Хоффманн, К. (2007). «Неинвазивный временной цитометрический мониторинг с помощью цифровой голографии». Журнал биомедицинской оптики . 12 (6): 064002. Bibcode : 2007JBO .... 12f4002K . DOI : 10.1117 / 1.2804926 . PMID 18163818 . 

Внешние ссылки [ править ]

  • Праймер для оптической микроскопии - фазово-контрастная микроскопия , Университет штата Флорида
  • Фазово-контрастные и темнопольные микроскопы (Université Paris Sud)