Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Праймер димер ( PD ) является потенциальным побочным продуктом в полимеразной цепной реакции (ПЦР), общего биотехнологического способа. Как следует из названия, PD состоит из двух молекул праймеров , которые прикрепились ( гибридизировались ) друг к другу из-за цепочек комплементарных оснований в праймерах. В результате ДНК-полимераза амплифицирует PD, что приводит к конкуренции за реагенты для ПЦР, таким образом потенциально ингибируя амплификацию последовательности ДНК , предназначенной для амплификации ПЦР. В количественной ПЦР PD могут мешать точному количественному определению.

Механизм образования [ править ]

механизм образования димера праймера и амплификации
Димер праймера образуется и амплифицируется в трехступенчатом процессе.

Димер праймера образуется и амплифицируется в три этапа. На первом этапе два праймера отжигаются на их соответствующих 3'-концах (этап I на рисунке). Если эта конструкция достаточно стабильна, ДНК-полимераза будет связывать и удлинять праймеры в соответствии с комплементарной последовательностью (этап II на рисунке). Важным фактором, способствующим стабильности конструкции на этапе I, является высокое содержание GC на 3'-концах и длина перекрытия. Третий этап происходит в следующем цикле, когда одна нить продукта этапа II используется в качестве матрицы, к которой отжигаются свежие праймеры, что приводит к синтезу большего количества продукта PD. [1]

Обнаружение [ править ]

Димеры праймеров могут быть видны после гель-электрофореза продукта ПЦР. PD в гелях, окрашенных бромидом этидия, обычно видны как полоса из 30-50 пар оснований (п.о.) или мазок от умеренной до высокой интенсивности и отличимые от полосы последовательности-мишени, которая обычно длиннее 50 п.о.

В количественной ПЦР PD могут быть обнаружены путем анализа кривой плавления с использованием интеркалирующих красителей, таких как SYBR Green I , неспецифического красителя для обнаружения двухцепочечной ДНК. Поскольку они обычно состоят из коротких последовательностей, PD денатурируют при более низкой температуре, чем целевая последовательность, и, следовательно, их можно отличить по характеристикам кривой плавления.

Предотвращение образования димеров праймеров [ править ]

Один из подходов к предотвращению частичных разрядов состоит в физико-химической оптимизации системы ПЦР, т.е. изменении концентраций праймеров, хлорида магния , нуклеотидов , ионной силы и температуры реакции. Этот метод несколько ограничен физико-химическими характеристиками, которые также определяют эффективность амплификации целевой последовательности в ПЦР. Следовательно, уменьшение образования PD также может привести к снижению эффективности ПЦР. Чтобы преодолеть это ограничение, другие методы направлены только на уменьшение образования PD, включая дизайн праймеров и использование различных ферментных систем или реагентов ПЦР. [ необходима цитата ]

Программное обеспечение для создания праймеров [ править ]

Программное обеспечение для создания праймеров использует алгоритмы, которые проверяют возможность образования вторичной структуры ДНК и отжиг праймеров с самим собой или внутри пар праймеров. Программа учитывает следующие физические параметры: потенциальная самокомплементарность и GC-содержание праймеров; близкие температуры плавления грунтовок; и отсутствие вторичных структур, таких как стержневые петли , в последовательности-мишени ДНК. [2]

ПЦР с горячим стартом [ править ]

Поскольку праймеры сконструированы так, чтобы иметь низкую комплементарность друг другу, они могут отжигаться (этап I на рисунке) только при низкой температуре, например комнатной температуре, например, во время приготовления реакционной смеси. Хотя ДНК-полимеразы, используемые в ПЦР, наиболее активны при температуре около 70 ° C, они обладают некоторой полимеризационной активностью также при более низких температурах, что может вызвать синтез ДНК из праймеров после отжига друг с другом. [3] Было разработано несколько методов для предотвращения образования PD до тех пор, пока реакция не достигнет рабочей температуры (60-70 ° C), и они включают начальное ингибирование ДНК-полимеразы или физическое разделение реакции компонентов реакции до тех пор, пока реакционная смесь не достигнет более высокой температуры. температуры. Эти методы называются ПЦР с горячим стартом .

Воск : в этом методе фермент пространственно отделяется от реакционной смеси воском, который плавится, когда реакция достигает высокой температуры. [4]

Медленное высвобождение магния : для активности ДНК-полимеразы необходимы ионы магния [5], поэтому магний химически отделяется от реакции путем связывания с химическим соединением и выделяется в раствор только при высокой температуре [6].

Нековалентная связывание ингибитора : в этом методе пептид , антитело , [7] или аптамер [8] являются не ковалентно связаны с ферментом при низкой температуре и ингибировать его активность. После инкубации в течение 1–5 минут при 95 ° C ингибитор высвобождается и начинается реакция.

Чувствительная к холоду полимераза Taq : это модифицированная ДНК-полимераза, практически не проявляющая активности при низкой температуре. [9]

Химическая модификация : в этом методе небольшая молекула ковалентно связана с боковой цепью из с аминокислоты в активном центре ДНК - полимеразы. Небольшая молекула высвобождается из фермента путем инкубации реакционной смеси в течение 10–15 минут при 95 ° C. Как только малая молекула высвобождается, фермент активируется. [10]

Структурные модификации праймеров [ править ]

Другой подход к предотвращению или уменьшению образования частичных разрядов заключается в модификации праймеров таким образом, чтобы отжиг между собой или друг с другом не приводил к удлинению.

РУКИ ( H Омо-Таг ssisted N on - D ИМЕР S ystem [11] ): нуклеотид хвост, комплементарный к 3' - концу праймера добавляет к 5' - концу праймера. Из-за непосредственной близости 5-дюймового хвоста он отжигается с 3-дюймовым концом праймера. В результате получается праймер « стебель-петля», который исключает отжиг с более короткими перекрытиями, но позволяет отжиг праймера до его полностью комплементарной последовательности в мишени.

Химерные праймеры : некоторые основания ДНК в праймере заменяются основаниями РНК, создавая химерную последовательность . Температура плавления химерной последовательности с другой химерной последовательностью ниже, чем у химерной последовательности с ДНК. Это различие позволяет установить такую ​​температуру отжига, чтобы праймер отжигался со своей целевой последовательностью, но не с другими химерными праймерами. [12]

Блокированные-расщепляемые праймеры : метод, известный как РНКаза H-зависимая ПЦР (rhPCR), [13], использует термостабильную РНКазу HII для удаления блокирующей группы из ПЦР-праймеров при высокой температуре. Этот фермент РНКаза HII почти не проявляет активности при низкой температуре, поэтому удаление блока происходит только при высокой температуре. Фермент также обладает свойством распознавания несоответствия праймер: матрица, что приводит к дополнительной селекции против димеров праймеров.

Предотвращение получения сигнала от димеров праймеров [ править ]

Хотя описанные выше методы предназначены для уменьшения образования частичных разрядов, другой подход направлен на минимизацию сигнала, генерируемого от частичных разрядов в количественной ПЦР . Этот подход полезен до тех пор, пока образуется мало PD и их ингибирующее действие на накопление продукта незначительно.

Четырехэтапная ПЦР : используется при работе с неспецифическими красителями, такими как SYBR Green I. Она основана на разной длине и, следовательно, разной температуре плавления PD и целевой последовательности. В этом методе сигнал получается ниже температуры плавления целевой последовательности, но выше температуры плавления PD. [14]

Зонды, специфичные для последовательности : зонды TaqMan и молекулярные маяки генерируют сигнал только в присутствии своей целевой (комплементарной) последовательности, и эта повышенная специфичность препятствует получению сигнала (но не возможному ингибирующему воздействию на накопление продукта) от PD.

Ссылки [ править ]

  1. ^ Альбертс; и другие. (2017). Молекулярная биология клетки (6-е изд.). Наука о гирляндах. С. 708–711.
  2. ^ Страница дизайна праймера Медицинского центра Лейденского университета
  3. ^ Патель, Юинг (2008). Полимеразная цепная реакция: методы и приложения . Научная пресса. С. 595–599.
  4. ^ Чоу, Куин; Рассел, Мэрион; Берч, Дэвид Э .; Раймонд, Джонатан; Блох, Уилл (1992). «Предотвращение неправильного прайминга перед ПЦР и димеризации праймеров улучшает амплификации с низким числом копий» . Исследования нуклеиновых кислот . 20 (7): 1717–23. DOI : 10.1093 / NAR / 20.7.1717 . PMC 312262 . PMID 1579465 .  
  5. ^ Ян, Линьцзин; Арора, Карунеш; Beard, William A .; Уилсон, Сэмюэл Х .; Шлик, Тамар (2004). «Критическая роль ионов магния в закрытии ДНК-полимеразы бета и сборке активного сайта». Журнал Американского химического общества . 126 (27): 8441–53. DOI : 10.1021 / ja049412o . PMID 15238001 . 
  6. ^ Номер заявки на патент США 2007/0254327
  7. ^ Номер патента США 5338671
  8. ^ Номер патента США 6183967
  9. ^ Номер патента США 6214557
  10. ^ Номер патента США 5677152
  11. ^ Домовой, Джаннин; Шоукросс, Сьюзен; Тикер, Джейн; Уиткомб, Дэвид; Ферри, Ричард; Ньютон, Клайв; Литтл, Стивен (1997). «Устранение накопления димеров праймеров в ПЦР» . Исследования нуклеиновых кислот . 25 (16): 3235–41. DOI : 10.1093 / NAR / 25.16.3235 . PMC 146890 . PMID 9241236 .  
  12. ^ «Химерные праймеры для улучшенных реакций амплификации нуклеиновых кислот» . Патентный объектив .
  13. ^ Dobosy JR, Rose SD, Beltz KR, Рапп SM, Пауэрс К.М., Behlke М.А., Walder JA (август 2011). «РНКаза H-зависимая ПЦР (rhPCR): улучшенная специфичность и обнаружение однонуклеотидного полиморфизма с использованием блокированных расщепляемых праймеров» . BMC Biotechnology . 11 : 80. DOI : 10,1186 / 1472-6750-11-80 . PMC 3224242 . PMID 21831278 .  
  14. ^ Четырехэтапная ПЦР

Внешние ссылки [ править ]

«Онлайн-программа для предсказания димеров праймеров» . OligoAnalyzer 3.1 . Интегрированные ДНК-технологии .
«Праймер дизайн. Что такое праймер-димер?» . YouTube видео.