Из Википедии, свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Число целостности РНК (RIN) - это алгоритм для присвоения значений целостности измерениям РНК .

Целостность РНК является серьезной проблемой для исследований экспрессии генов и традиционно оценивалась с использованием соотношения 28S к 18S рРНК , метод, который оказался непоследовательным. [1] Это несоответствие возникает из-за того, что для сравнения геля 28S и 18S необходима субъективная интерпретация человека.изображений. Алгоритм RIN был разработан для решения этой проблемы. Алгоритм RIN применяется к измерениям электрофоретической РНК, обычно получаемым с помощью капиллярного гель-электрофореза, и основан на комбинации различных функций, которые вносят информацию о целостности РНК, чтобы обеспечить более универсальную меру. RIN продемонстрировал надежность и воспроизводимость в исследованиях, сравнивающих ее с другими алгоритмами расчета целостности РНК, что укрепляет ее позицию в качестве предпочтительного метода определения качества анализируемой РНК. [2]

Основная критика RIN заключается в использовании с растениями или в исследованиях взаимодействий эукариотических и прокариотических клеток. Алгоритм RIN не может дифференцировать эукариотические / прокариотические / хлоропластные рибосомные РНК, что приводит к серьезному занижению индекса качества в таких ситуациях.

Терминология [ править ]

Электрофорез - это процесс разделения видов нуклеиновых кислот в зависимости от их длины путем приложения к ним электрического поля. Поскольку нуклеиновые кислоты заряжены отрицательно, они проталкиваются электрическим полем через матрицу, обычно через агарозный гель, при этом более мелкие молекулы проталкиваются дальше и быстрее. [3] Капиллярный электрофорез - это метод, при котором небольшое количество образца нуклеиновой кислоты может быть обработано на геле в очень тонкой пробирке. В устройстве есть детектор, который может определить, когда образцы нуклеиновой кислоты проходят через определенную точку в пробирке, причем сначала проходят образцы меньшего размера. Таким образом можно получить электрофореграмму, подобную той, что показана на рисунке 1, где длина связана со временем, когда образцы проходят через детектор.

Маркер - это образец известного размера, проходящий вместе с образцом, так что фактический размер остальной части образца может быть известен путем сравнения их пройденного расстояния / времени относительно этого маркера.

РНК - это биологическая макромолекула, состоящая из сахаров и азотистых оснований, которая играет важную роль во всех живых клетках. Существует несколько подтипов РНК, из которых наиболее заметными в клетке являются тРНК (транспортная РНК), рРНК (рибосомная РНК) и мРНК (информационная РНК). Все три участвуют в процессе перевода., причем наиболее заметным видом (~ 85%) клеточной РНК является рРНК. В результате, этот вид становится наиболее заметным при анализе РНК с помощью электрофореза и, таким образом, используется для определения качества РНК (см. «Вычисления» ниже). рРНК бывает разных размеров, у млекопитающих они имеют размеры 5S, 18S и 28S. 28S и 5S рРНК образуют большую субъединицу, а 18S образуют малую субъединицу рибосомы , молекулярного механизма, ответственного за синтез белков. [4]

Приложения [ править ]

РНКазы распространены повсеместно и часто могут загрязнять и впоследствии разрушать образцы РНК в лаборатории, поэтому целостность РНК может быть очень легко нарушена, что приводит к появлению ряда лабораторных методов, направленных на устранение их воздействия. [5] [6] Однако эти методы не являются надежными, и поэтому образцы все еще могут быть разрушены, что требует метода измерения целостности РНК для обеспечения надежности и воспроизводимости молекулярных анализов, поскольку целостность РНК имеет решающее значение для получения правильных результатов в исследования экспрессии генов, такие как микроматричный анализ, Нозерн-блоттинг или количественная ПЦР в реальном времени (qPCR). [7] [8]Разложившаяся РНК оказывает прямое влияние на расчетные уровни экспрессии, часто приводя к значительному снижению видимой экспрессии. [9]

КПЦР и аналогичные методы очень дороги, отнимают много времени и денег, поэтому продолжаются исследования, направленные на снижение стоимости при сохранении точности и воспроизводимости КПЦР для экспрессии генов и других приложений. [10] Оценка RIN позволяет ученому оценить надежность и воспроизводимость эксперимента, прежде чем нести существенные затраты на проведение исследований экспрессии генов.

RIN - это стандартный метод измерения целостности РНК, который можно использовать для оценки качества РНК, полученной с помощью новых методов выделения РНК. [11]

Развитие [ править ]

Поскольку давно известно, что целостность РНК является проблемой в исследованиях молекулярной биологии, существует несколько методов, которые исторически использовались для определения целостности РНК. Долгое время наиболее популярным был электрофорез в агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием, позволяющий визуализировать полосы от пиков рРНК. Высоту полос 28S и 18S можно сравнить друг с другом с соотношением 2: 1, указывающим на недеградированную РНК. [1] Хотя этот метод очень дешев и прост, у этого метода есть несколько проблем, в первую очередь его субъективность, приводящая к непоследовательным, нестандартизированным оценкам качества РНК, и большим количествам РНК, которые необходимы для визуализации его на агарозе. гель, что может быть проблематичным, если для работы не так много РНК. [1] [12]Существует также ряд различных проблем, которые могут возникнуть в результате электрофореза в агарозном геле, таких как плохая загрузка, неравномерное прохождение и неравномерное окрашивание, которые приводят к повышенной вариабельности в точности использования электрофореза в агарозном геле для определения целостности РНК. [13]

Число целостности РНК было разработано Agilent Technologies [ необходима ссылка ] . Алгоритм был сгенерирован путем взятия сотен образцов, и специалисты вручную присвоили всем им значения от 1 до 10 в зависимости от их целостности, причем 10 было самым высоким. Инструменты адаптивного обучения с использованием техники байесовского обучения использовались для создания алгоритма, который мог предсказать RIN, преимущественно с использованием функций, перечисленных ниже в разделе «Вычисления». [1] [14] Это позволяет всему программному обеспечению Agilent производить одинаковый RIN для данного образца РНК, стандартизируя измерения и делая их гораздо менее субъективными, чем более ранние методы [ необходима ссылка ] .

Вычисление [ править ]

Рис. 1. Идеализированный график электрофореграммы с RIN, равным приблизительно 10. Справа приведен пример того, как запуск образца клеточной РНК будет выглядеть на одной полосе агарозного геля. Слева - помеченная идеализированная версия кривой электрофореграммы, которая могла бы быть создана таким гелем. На реальной электрофореграмме будет много маленьких пиков, особенно в быстрой области, соответствующей мРНК, но они не были включены для ясности.
Рис. 2. Идеализированный график электрофореграммы с RIN примерно 1 или 2. В отличие от рис. 1, где пики 28S и 18S очень большие, здесь они уменьшились, и большая часть образца вместо этого находится слева, ближе к тому месту, где маркер изначально был. Средний размер РНК явно уменьшился, что указывает на низкое качество РНК.

RIN для образца рассчитывается с использованием нескольких характеристик следа электрофореграммы РНК, причем первые два из перечисленных ниже являются наиболее значимыми. RIN присваивает электрофореграмме значение от 1 до 10, где 10 означает наименьшее ухудшение. Все следующие описания применимы к РНК млекопитающих, потому что РНК у других видов имеют разные размеры рРНК: [1] Общее соотношение РНК рассчитывается путем взятия отношения площади под пиками 18S и 28S рРНК к общей площади под графиком, a здесь желательно большое количество, что указывает на то, что большая часть рРНК все еще имеет эти размеры и, таким образом, деградация практически отсутствует. Идеальное соотношение можно увидеть на рисунке 1, где почти вся РНК находится в пиках 18S и 28S РНК.

Для высоты пика 28S желательно большое значение. 28S, наиболее известный вид рРНК, используется в расчете RIN, поскольку он обычно разлагается быстрее, чем 18S рРНК, и поэтому измерение высоты его пика позволяет выявить ранние стадии деградации. Опять же, это видно на рисунке 1, где пик 28S является самым большим, и это хорошо.

Быстрая область - это область между пиками 18S и 5S рРНК на электрофореграмме. Первоначально, когда значение отношения быстрых площадей увеличивается, это указывает на деградацию 18S и 28S рРНК до промежуточного размера, хотя впоследствии соотношение уменьшается по мере дальнейшей деградации РНК до еще меньших размеров. Таким образом, низкое значение не обязательно указывает на хорошую или плохую целостность РНК.

Желательна небольшая высота маркера, указывающая на то, что только небольшие количества РНК разложились и перешли к наименьшей длине, обозначенной коротким маркером. Если здесь обнаружено большое количество, это указывает на то, что большие количества рРНК были расщеплены на мелкие кусочки, которые можно было бы найти ближе к этому маркеру. Эту ситуацию можно увидеть на электрофореграмме РНК «низкого качества», показанной на рисунке 2, где высота пика над маркером (крайний левый) очень велика, поэтому РНК сильно деградировала. Для прокариотических образцов алгоритм несколько иной, но программное обеспечение Agilent 2100 Bioanalyzer Expert теперь также может рассчитывать RIN для прокариотических образцов. [15]Разница, вероятно, возникает из-за того, что в то время как образцы млекопитающих имеют 28S и 18S рибосомные РНК в качестве преобладающих видов, прокариотические РНК имеют немного меньшие размеры, чем 23S и 16S, поэтому алгоритм должен быть изменен, чтобы приспособиться к этому. Еще один важный факт, связанный с расчетом показателей целостности прокариотической РНК, заключается в том, что RIN не был валидирован в той степени, в которой он был подтвержден для эукариотической РНК. [15] Было показано, что более высокие значения RIN коррелируют с лучшими последующими результатами у эукариот, но это не было сделано так широко для прокариот, поэтому это может означать меньше у прокариот.

Эти электрофорезы для расчета RIN выполняются с помощью прибора Agilent Bioanalyzer, который может выполнять электрофорез и генерировать электрофореграммы. [14] Программное обеспечение Agilent 2100 уникально способно выполнять программное обеспечение RIN, поскольку точный алгоритм является проприетарным, поэтому существуют дополнительные важные функции электрофореграммы РНК, которые используются в его расчетах, но не являются общедоступными.

Ссылки [ править ]

  1. ^ a b c d e Шредер, Андреас; Мюллер, Одило; Стокер, Сюзанна; Саловский, Рюдигер; Лейбер, Майкл; Гассманн, Маркус; Лайтфут, Самар; Менцель, Вольфрам; Гранцов, Мартин; Рэгг, Томас (2006). «RIN: номер целостности РНК для присвоения значений целостности измерениям РНК» . BMC Molecular Biology . 7 (1): 3. DOI : 10,1186 / 1471-2199-7-3 . PMC  1413964 . PMID  16448564 .
  2. ^ Имбо, Сандрин; Грауденс, Эстер; Буланже, Вирджиния; Барле, Ксавье; Заборски, Патрик; Эвено, Эрик; Мюллер, Одило; Шредер, Андреас; Оффре, Чарльз (01.01.2005). «К стандартизации оценки качества РНК с использованием независимых от пользователя классификаторов следов микрокапиллярного электрофореза» . Исследования нуклеиновых кислот . 33 (6): e56. DOI : 10.1093 / NAR / gni054 . ISSN 0305-1048 . PMC 1072807 . PMID 15800207 .   
  3. ^ Уотсон, Джеймс Д .; Бейкер, Таня А .; Белл, Стивен П .; Ганн, Александр; Левин, Майкл; Лосик, Ричард (2014). Молекулярная биология гена: седьмое издание . Гленвью, Иллинойс: Образование Пирсона. ISBN 978-0-321-85149-9.
  4. ^ Хаттер, Хина; Мясников, Александр Г .; Натчиар, С. Кундхавай; Клахольц, Бруно П. (2015). «Структура 80S рибосомы человека». Природа . 520 (7549): 640–645. Bibcode : 2015Natur.520..640K . DOI : 10,1038 / природа14427 . PMID 25901680 . S2CID 4459012 .  
  5. ^ «Как избежать заражения рибонуклеазой | NEB» . www.neb.com . Проверено 10 апреля 2016 .
  6. ^ «Основы: Контроль РНКазы» . www.thermofisher.com . Проверено 10 апреля 2016 .
  7. ^ Бастин, Стивен А .; Бенеш Владимир; Гарсон, Джереми А .; Геллеманс, Ян; Хаггетт, Джим; Кубиста, Микаэль; Мюллер, Рейнхольд; Нолан, Таня; Пфаффл, Майкл В. (2009-04-01). «Рекомендации MIQE: минимум информации для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени» . Клиническая химия . 55 (4): 611–622. DOI : 10,1373 / clinchem.2008.112797 . ISSN 0009-9147 . PMID 19246619 .  
  8. ^ Fleige, Simone; Пфаффл, Майкл В. (2006). «Целостность РНК и влияние на производительность QRT-PCR в реальном времени». Молекулярные аспекты медицины . 27 (2–3): 126–139. DOI : 10.1016 / j.mam.2005.12.003 . PMID 16469371 . 
  9. ^ Тейлор, Шон С.; Мркусич, Эли М. (2014). «Состояние RT-количественной ПЦР: непосредственные наблюдения реализации минимума информации для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени (MIQE)» . Журнал молекулярной микробиологии и биотехнологии . 24 (1): 46–52. DOI : 10.1159 / 000356189 . PMID 24296827 . 
  10. ^ Reitschuler, Кристоф; Линс, Филипп; Илмер, Пол (2014). «Оценка праймеров и адаптация для экономичного QPCR на основе SYBR Green и его применимость для конкретного количественного определения метаногенов». Всемирный журнал микробиологии и биотехнологии . 30 (1): 293–304. DOI : 10.1007 / s11274-013-1450-х . PMID 23918633 . S2CID 36790110 .  
  11. ^ Ливингстон, Уитни S .; Rusch, Heather L .; Нерсесян, Паула В .; Бакстер, Тристин; Мысливец, Винсент; Гилл, Джессика М. (01.01.2015). «Улучшение сна у военнослужащих связано с изменением экспрессии воспалительных генов и улучшением симптомов депрессии» . Границы в психиатрии . 6 : 59. DOI : 10,3389 / fpsyt.2015.00059 . PMC 4415307 . PMID 25983695 .  
  12. ^ Тейлор, Шон; Вакем, Майкл; Дейкман, Грег; Альсаррадж, Марван; Нгуен, Мари (01.04.2010). «Практический подход к RT-qPCR - публикация данных, соответствующих рекомендациям MIQE». Методы . Продолжающаяся эволюция qPCR. 50 (4): S1 – S5. DOI : 10.1016 / j.ymeth.2010.01.005 . PMID 20215014 . 
  13. ^ «Развитие методологии контроля качества для оценки изолированной общей РНК и генерированной фрагментированной кРНК», Agilent Application Note, Publication Number 5988-9861EN, 2003.
  14. ^ a b «Число целостности РНК (RIN) - Стандартизация контроля качества РНК», Примечания к применению Agilent, номер публикации 5989-1165EN, 2016.
  15. ^ a b Биоанализатор Agilent 2100: Руководство пользователя для экспертов 2100 . Вальдбронн, Германия: Agilent Technologies (2005).

Внешние ссылки [ править ]

  • Информация о RIN от Agilent Technologies
  • Статья RIN в BMC Molecular Biology
  • Резюме экспрессии генов из Nature, чтобы помочь показать, зачем нам нужен RIN
  • Объяснение RIN от Agilent Technologies, с несколькими примерами электрофореграммы при различных значениях RIN
  • Моделирование гель-электрофореза от Университета Юты, чтобы помочь визуализировать, как создаются электрофорезы.