Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
«RT-PCR» перенаправляется сюда. Информацию о полимеразной цепной реакции в реальном времени, также называемой количественной полимеразной цепной реакцией в реальном времени (кПЦР) или кинетической полимеразной цепной реакцией, см. В разделе Полимеразная цепная реакция в реальном времени .
ОТ-ПЦР

Обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции ( ОТ-ПЦР ) является лабораторная методика комбинирования обратной транскрипции из РНК в ДНК (в этом контексте называется комплементарной ДНК или кДНК) и амплификации специфических мишеней ДНК с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). [1] Он в основном используется для измерения количества конкретной РНК. Это достигается путем мониторинга реакции амплификации с помощью флуоресценции, метода, называемого ПЦР в реальном времени или количественной ПЦР (qPCR). Комбинированная ОТ-ПЦР и КПЦР обычно используются для анализа экспрессии генов. и количественная оценка вирусной РНК в исследованиях и клинических условиях.

Тесная связь между RT-PCR и qPCR привела к метонимическому использованию термина qPCR для обозначения RT-PCR. Такое использование может сбивать с толку [2], поскольку ОТ-ПЦР может использоваться без количественной ПЦР, например, для молекулярного клонирования , секвенирования или простого обнаружения РНК. Напротив, кПЦР можно использовать без ОТ-ПЦР, например, для количественного определения количества копий определенного фрагмента ДНК.

Номенклатура [ править ]

Комбинированный метод ОТ-ПЦР и КПЦР был описан как количественная ОТ-ПЦР [3] или ОТ-ПЦР в реальном времени [4] (иногда даже называемая количественной ОТ-ПЦР в реальном времени [5] ). qRT-PCR, [6] RT-qPCR, [7] RRT-PCR, [8] и rRT-PCR. [9] Во избежание путаницы в этой статье будут последовательно использоваться следующие сокращения:

ТехникаСокращение
Полимеразной цепной реакцииПЦР
Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипциейОТ-ПЦР
Полимеразная цепная реакция в реальном времениКПЦР
Комбинированный метод RT-PCR / qPCRqRT-PCR

Не все авторы, особенно более ранние, используют это соглашение, и читатель должен быть осторожен при переходе по ссылкам. ОТ-ПЦР использовалась для обозначения как ПЦР в реальном времени (qPCR), так и ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR).

История [ править ]

С момента своего появления в 1977 году Нозерн-блот широко использовался для количественной оценки РНК, несмотря на его недостатки: (а) метод, требующий больших затрат времени, (б) требующий большого количества РНК для обнаружения, и (в) количественно неточный из-за низкой распространенности Содержание РНК. [10] [11] Однако с момента своего изобретения Кэри Муллис в 1983 году ОТ ПЦР с тех пор вытеснила Нозерн-блоттинг как метод выбора для обнаружения и количественной оценки РНК. [12]

ОТ-ПЦР стала эталонной технологией для обнаружения и / или сравнения уровней РНК по нескольким причинам: (а) она не требует обработки после ПЦР, (б) широкий диапазон (> 10 7 раз) РНК численность можно измерить, и (c) это дает представление как о качественных, так и о количественных данных. [5] Благодаря своей простоте, специфичности и чувствительности, ОТ-ПЦР используется в широком спектре приложений - от простых экспериментов, таких как количественное определение дрожжевых клеток в вине, до более сложных применений в качестве диагностических инструментов для обнаружения инфекционных агентов, таких как птичий грипп. вирус и SARS-CoV-2 . [13] [14] [15]

Принципы [ править ]

В ОТ-ПЦР матрицу РНК сначала преобразуют в комплементарную ДНК (кДНК) с помощью обратной транскриптазы . Затем кДНК используют в качестве матрицы для экспоненциальной амплификации с помощью ПЦР. QT- NASBA в настоящее время является наиболее чувствительным методом обнаружения РНК. [16] [ нерелевантная цитата ] Использование ОТ-ПЦР для обнаружения РНК-транскрипта произвело революцию в изучении экспрессии генов следующими важными способами:

  • Сделал теоретически возможным обнаружение транскриптов практически любого гена [17]
  • Обеспечивает амплификацию образца и устраняет необходимость в большом количестве исходного материала, необходимого при использовании нозерн-блоттинга [18] [19]
  • Обеспечивается устойчивость к деградации РНК, пока РНК, охватывающая праймер, не повреждена [18]

Одноэтапная ОТ-ПЦР против двухэтапной ОТ-ПЦР [ править ]

Одноэтапная или двухэтапная ОТ-ПЦР

Количественная оценка мРНК с помощью ОТ-ПЦР может быть проведена в виде одноэтапной или двухэтапной реакции. Разница между двумя подходами заключается в количестве трубок, используемых при выполнении процедуры. Двухэтапная реакция требует, чтобы реакция обратной транскриптазы и амплификация ПЦР проводились в отдельных пробирках. Недостатком двухэтапного подхода является подверженность загрязнению из-за более частого обращения с пробами. [20] С другой стороны, вся реакция от синтеза кДНК до амплификации ПЦР происходит в одной пробирке при одностадийном подходе. Считается, что одноэтапный подход сводит к минимуму экспериментальные вариации, объединяя все ферментативные реакции в одной среде. Это исключает этапы пипетирования продукта кДНК, которые являются трудоемкими и подверженными загрязнению, для реакции ПЦР. Дальнейшее использование толерантных к ингибиторам полимераз, усилителей полимеразы с оптимизированными условиями одноэтапной ОТ-ПЦР, поддерживает обратную транскрипцию РНК из неочищенных или сырых образцов, таких как цельная кровь и сыворотка . [21] [22]Однако исходные шаблоны РНК склонны к деградации при одноэтапном подходе, и использование этого подхода не рекомендуется, когда требуются повторные анализы одного и того же образца. Кроме того, одноэтапный подход менее точен по сравнению с двухэтапным. Это также предпочтительный метод анализа при использовании ДНК-связывающих красителей, таких как SYBR Green, поскольку устранение димеров праймеров может быть достигнуто путем простого изменения температуры плавления . Тем не менее, одноэтапный подход представляет собой относительно удобное решение для быстрого обнаружения целевой РНК непосредственно при биодатчиках. [ необходима цитата ]

Конечная ОТ-ПЦР против ОТ-ПЦР в реальном времени [ править ]

Количественный анализ продуктов ОТ-ПЦР в основном можно разделить на две категории: конечная точка и анализ в реальном времени. [16] Использование конечной точки ОТ-ПЦР является предпочтительным для измерения изменений экспрессии генов в небольшом количестве образцов, но ОТ-ПЦР в реальном времени стала золотым стандартом для проверки результатов, полученных в результате анализа массивов или изменений экспрессии генов. в мировом масштабе. [23]

Конечная ОТ-ПЦР [ править ]

Измерение подходов конечной точки ОТ-ПЦР требует обнаружения уровней экспрессии генов с использованием флуоресцентных красителей , таких как бромид этидия , [24] [25] Р32 маркировка продуктов ПЦР с использованием Phosphorimager , [26] или с помощью сцинтилляционного счетчика . [19] Конечная точка ОТ-ПЦР обычно достигается с использованием трех различных методов: относительного, конкурентного и сравнительного. [27] [28]

Относительная ОТ-ПЦР
Относительная количественная оценка RT-PCR включает коамплификацию внутреннего контроля одновременно с интересующим геном. Внутренний контроль используется для нормализации образцов. После нормализации можно провести прямое сравнение относительного содержания транскриптов в нескольких образцах мРНК. Следует отметить одну меру предосторожности: внутренний контроль должен быть выбран таким образом, чтобы экспериментальное лечение не влияло на него. Уровень экспрессии должен быть постоянным во всех образцах и с учетом интересующей мРНК, чтобы результаты были точными и значимыми. Поскольку количественная оценка результатов анализируется путем сравнения линейного диапазона целевой и контрольной амплификации, крайне важно принять во внимание исходную концентрацию целевых молекул и скорость их амплификации до начала анализа.Результаты анализа выражаются в виде отношения сигнала гена к сигналу внутреннего контроля, значения которого затем можно использовать для сравнения между образцами при оценке относительной экспрессии целевой РНК.[25] [28] [29]
Конкурентная ОТ-ПЦР
Для абсолютной количественной оценки используется метод конкурентной ОТ-ПЦР. Он включает использование синтетической «конкурентной» РНК, которую можно отличить от целевой РНК по небольшой разнице в размере или последовательности. Для создания синтетической РНК важно быть идентичной по последовательности, но немного короче целевой РНК для получения точных результатов. После конструирования и синтеза известное количество конкурирующей РНК добавляется к экспериментальным образцам и коамплифицируется с мишенью с помощью ОТ-ПЦР. Затем строят кривую концентрации конкурентной РНК, и ее используют для сравнения сигналов ОТ-ПЦР, полученных от эндогенных транскриптов, для определения количества мишени, присутствующей в образце. [28] [30]
Сравнительная ОТ-ПЦР
Сравнительная ОТ-ПЦР аналогична конкурентной ОТ-ПЦР в том, что РНК-мишень конкурирует за реагенты для амплификации в рамках одной реакции с внутренним стандартом неродственной последовательности. После завершения реакции результаты сравниваются с кривой внешнего стандарта для определения целевой концентрации РНК. По сравнению с относительными и конкурентными методами количественной оценки сравнительная ОТ-ПЦР считается более удобным методом для использования, поскольку не требует от исследователя проведения пилотного эксперимента; в относительной ОТ-ПЦР должен быть заранее определен диапазон экспоненциальной амплификации мРНК, а при конкурентной ОТ-ПЦР должна быть синтезирована синтетическая конкурирующая РНК. [28] [31] [32] [33] [34]

ОТ-ПЦР в реальном времени [ править ]

Появление в последние несколько лет новых методов флуоресцентной маркировки ДНК сделало возможным анализ и обнаружение продуктов ПЦР в режиме реального времени и, как следствие, привело к широкому распространению ОТ-ПЦР в реальном времени для анализа экспрессии генов. В настоящее время ОТ-ПЦР в реальном времени является не только предпочтительным методом количественной оценки экспрессии генов, но и предпочтительным методом получения результатов анализа массивов и экспрессии генов в глобальном масштабе. В настоящее время доступны четыре различных флуоресцентных ДНК-зонда для обнаружения продуктов ПЦР в режиме реального времени: SYBR Green , TaqMan , молекулярные маяки и зонды-скорпионы.. Все эти зонды позволяют обнаруживать продукты ПЦР, генерируя флуоресцентный сигнал. В то время как краситель SYBR Green излучает свой флуоресцентный сигнал, просто связываясь с двухцепочечной ДНК в растворе, генерация флуоресценции зондов TaqMan, молекулярных маяков и скорпионов зависит от связывания молекулы красителя с резонансным переносом энергии Фёрстера (FRET) и гаситель для олигонуклеотидных субстратов. [35]

SYBR Зеленый
Когда SYBR Green связывается с двухцепочечной ДНК продуктов ПЦР, он будет излучать свет при возбуждении. Интенсивность флуоресценции увеличивается по мере накопления продуктов ПЦР. Этот метод прост в использовании, так как создание зондов не требуется из-за отсутствия специфичности их связывания. Однако, поскольку краситель не отличает двухцепочечную ДНК от продуктов ПЦР и от димеров праймеров, переоценка целевой концентрации является обычной проблемой. Если точная количественная оценка является абсолютной необходимостью, необходимо провести дальнейший анализ для подтверждения результатов. Тем не менее, среди методов обнаружения продуктов ОТ-ПЦР в реальном времени SYBR Green является наиболее экономичным и простым в использовании. [16] [23]
Зонды Taqman
TaqMan зонды
Зонды TaqMan представляют собой олигонуклеотиды, которые имеют флуоресцентный зонд, прикрепленный к 5'-концу и гаситель к 3'-концу. Во время ПЦР-амплификации эти зонды будут гибридизоваться с последовательностями-мишенями, расположенными в ампликоне.и поскольку полимераза реплицирует матрицу со связанным TaqMan, она также расщепляет флуоресцентный зонд из-за активности полимеразы 5'-нуклеазы. Поскольку непосредственная близость между молекулой гашения и флуоресцентным зондом обычно предотвращает обнаружение флуоресценции посредством FRET, развязка приводит к увеличению интенсивности флуоресценции, пропорциональной количеству циклов расщепления зонда. Хотя хорошо спроектированные зонды TaqMan дают точные результаты ОТ-ПЦР в реальном времени, синтез дорог и требует много времени, когда для каждой анализируемой мишени мРНК необходимо делать отдельные зонды. [16] [17] [36]
Молекулярные радиомаяки
Подобно зондам TaqMan, молекулярные маяки также используют детектирование FRET с флуоресцентными зондами, прикрепленными к 5'-концу, и гасителем, прикрепленным к 3'-концу олигонуклеотидного субстрата. Однако, в то время как флуоресцентные зонды TaqMan расщепляются во время амплификации, зонды молекулярных маяков остаются неповрежденными и повторно связываются с новой мишенью во время каждого цикла реакции. В свободном состоянии в растворе непосредственная близость флуоресцентного зонда и молекулы гасителя предотвращает флуоресценцию через FRET. Однако, когда зонды молекулярных маяков гибридизуются с мишенью, флуоресцентный краситель и гаситель разделяются, что приводит к излучению света при возбуждении. Как и в случае зондов TaqMan, синтезировать молекулярные маяки дорого, и для каждой РНК-мишени требуются отдельные зонды. [20]
Зонды-скорпионы
Зонды-скорпионы, как молекулярные маяки, не будут флуоресцентно активными в негибридизированном состоянии, опять же из-за того, что флуоресцентный зонд на 5'-конце гасится фрагментом на 3'-конце олигонуклеотида. Однако у Scorpions 3'-конец также содержит последовательность, комплементарную продукту удлинения праймера на 5'-конце. Когда расширение Scorpion связывается со своим комплементом на ампликоне, структура Scorpion открывается, предотвращает FRET и позволяет измерять флуоресцентный сигнал. [37]
Мультиплексные зонды
Зонды TaqMan, молекулярные маяки и скорпионы позволяют одновременно измерять продукты ПЦР в одной пробирке. Это возможно, потому что каждый из различных флуоресцентных красителей может быть связан с определенным спектром излучения. Мало того, что использование мультиплексных зондов экономит время и усилия без ущерба для полезности теста, их применение в широких областях исследований, таких как анализ делеции генов, анализ мутаций и полиморфизма, количественный анализ и обнаружение РНК, делает его бесценным методом для лабораторий много дисциплины. [37] [38] [39]

Для количественной оценки результатов, полученных с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени, обычно используются две стратегии; метод стандартной кривой и метод сравнительного порога. [40]

Заявление [ править ]

Экспоненциальная амплификация посредством полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией обеспечивает высокочувствительный метод, с помощью которого можно обнаружить очень низкое количество копий молекул РНК. ОТ-ПЦР широко используется при диагностике генетических заболеваний и, полуколичественно, при определении количества конкретных различных молекул РНК в клетке или ткани в качестве меры экспрессии генов .

Методы исследования [ править ]

ОТ-ПЦР обычно используется в исследовательских методах для измерения экспрессии генов. Например, Lin et al. использовали qRT-PCR для измерения экспрессии генов Gal в дрожжевых клетках. Во-первых, Lin et al. сконструировали мутацию белка, предположительно участвующего в регуляции генов Gal. Предполагается, что эта мутация избирательно подавляет экспрессию Gal. Чтобы подтвердить это, уровни экспрессии генов дрожжевых клеток, содержащих эту мутацию, анализировали с помощью qRT-PCR. Исследователи смогли окончательно определить, что мутация этого регуляторного белка снижает экспрессию Gal. [41] Нозерн-блоттинг используется для дальнейшего изучения экспрессии генов РНК.

Вставка гена [ править ]

ОТ-ПЦР также может быть очень полезной для вставки эукариотических генов в прокариот . Поскольку большинство эукариотических генов содержат интроны , которые присутствуют в геноме, но не в зрелой мРНК, кДНК, полученная в результате реакции ОТ-ПЦР, является точной (без учета подверженной ошибкам природы обратных транскриптаз) последовательностью ДНК, которая могла бы быть непосредственно переводится в белок после транскрипции . Когда эти гены экспрессируются в прокариотических клетках для продукции или очистки белка, РНК, полученная непосредственно в результате транскрипции, не нуждается в сплайсинге, поскольку транскрипт содержит только экзоны.. (Прокариоты, такие как E. coli, лишены механизма сплайсинга мРНК эукариот).

Диагностика генетических заболеваний [ править ]

ОТ-ПЦР может использоваться для диагностики генетического заболевания, такого как синдром Леша – Найхана . Это генетическое заболевание вызвано нарушением функции гена HPRT1 , что клинически приводит к смертельному исходу мочевого камня из мочевой кислоты и симптомам, сходным с подагрой . [6] [ требуется уточнение ] Анализ беременной матери и плода на уровни экспрессии мРНК HPRT1 покажет, является ли мать носителем и будет ли у плода вероятно развитие синдрома Леша – Найхана. [42]

Обнаружение рака [ править ]

Ученые работают над способами использования ОТ-ПЦР при обнаружении рака, чтобы улучшить прогноз и контролировать реакцию на терапию. Циркулирующие опухолевые клетки продуцируют уникальные транскрипты мРНК в зависимости от типа рака. Цель состоит в том, чтобы определить, какие транскрипты мРНК служат лучшими биомаркерами для определенного типа раковых клеток, а затем проанализировать уровни их экспрессии с помощью ОТ-ПЦР. [43]

ОТ-ПЦР обычно используется при изучении геномов вирусов , геномы которых состоят из РНК, таких как Influenzavirus A , ретровирусов, таких как HIV и SARS-CoV-2 . [44]

Проблемы [ править ]

Несмотря на свои основные преимущества, ОТ-ПЦР не лишена недостатков. Экспоненциальный рост обратно транскрибируемой комплементарной ДНК (кДНК) во время нескольких циклов ПЦР приводит к неточному количественному определению конечной точки из-за трудности поддержания линейности. [45] Чтобы обеспечить точное обнаружение и количественную оценку содержания РНК в образце, была разработана qRT-PCR с использованием модификации на основе флуоресценции для мониторинга продуктов амплификации во время каждого цикла PCR. Чрезвычайная чувствительность метода может быть обоюдоострым мечом, поскольку даже малейшее загрязнение ДНК может привести к нежелательным результатам. [46] Простым методом устранения ложноположительных результатов является добавление якорей или тегов.к 5'-области специфичного для гена праймера. [47] Кроме того, планирование и разработка количественных исследований может быть технически сложной задачей из-за существования многочисленных источников вариаций, включая концентрацию матрицы и эффективность амплификации. [31]

Протокол [ править ]

ОТ-ПЦР может быть проведена с использованием протокола одноэтапной ОТ-ПЦР или двухэтапного протокола ОТ-ПЦР.

Одноэтапная ОТ-ПЦР [ править ]

В одну стадию ОТ-ПЦР берут мишени мРНК (до 6 т.п.н.) и подвергают их обратной транскрипции, а затем амплификации ПЦР в одной пробирке. Для достижения наилучших результатов используйте только неповрежденную РНК высокого качества. Обязательно используйте праймер, специфичный для последовательности.

  1. Выберите набор для одноэтапной ОТ-ПЦР, который должен включать смесь с обратной транскриптазой и системой ПЦР, такой как ДНК-полимераза Taq и полимераза для проверки.
  2. Приобретите все необходимые материалы, оборудование и инструменты (в комплекты должен входить подробный перечень необходимых предметов).
  3. Подготовьте реакционную смесь, которая будет включать dNTP, праймеры, матричную РНК, необходимые ферменты и буферный раствор.
  4. Добавьте смесь в пробирку для ПЦР для каждой реакции. Затем добавьте шаблонную РНК.
  5. Поместите пробирки для ПЦР в термоциклер, чтобы начать цикл. Первый цикл - это обратная транскрипция для синтеза кДНК. Второй цикл - начальная денатурация. Во время этого цикла инактивируется обратная транскриптаза. Следующие 40-50 циклов представляют собой программу амплификации, которая состоит из трех этапов: (1) денатурация, (2) отжиг, (3) удлинение.
  6. Затем продукты RT-PCR можно анализировать с помощью гель-электрофореза . [48] [49]

(Руководство по применению ПЦР и биологические инструменты)

Двухэтапная ОТ-ПЦР [ править ]

Двухэтапная ОТ-ПЦР, как следует из названия, происходит в два этапа. Сначала обратная транскрипция, а затем ПЦР. Этот метод более чувствителен, чем одношаговый. Наборы также можно использовать для двухэтапной ОТ-ПЦР. Как и в случае одноэтапной процедуры, для достижения наилучших результатов используйте только неповрежденную РНК высокого качества. Праймер для двухэтапной обработки не обязательно должен быть специфичным для последовательности.

Шаг первый [ править ]

  1. Объедините матричную РНК, праймер, смесь dNTP и воду, свободную от нуклеаз, в пробирке для ПЦР.
  2. Добавьте ингибитор РНКазы и обратную транскриптазу в пробирку для ПЦР.
  3. Поместите пробирку для ПЦР в термоциклер на один цикл, который включает отжиг, расширение, а затем инактивацию обратной транскриптазы.
  4. Переходите непосредственно к ПЦР или храните на льду, пока не будет проведена ПЦР.

Шаг второй [ править ]

  1. Добавьте мастер-микс (содержащий буфер, смесь dNTP, MgCl 2 , полимеразу Taq и воду, свободную от нуклеаз) в каждую пробирку для ПЦР.
  2. Добавьте соответствующий грунт.
  3. Поместите пробирки для ПЦР в термоциклер на 30 циклов программы амплификации, которая включает три этапа: (1) денатурация (2) отжиг (3) удлинение.
  4. Затем продукты RT-PCR можно анализировать с помощью гель-электрофореза. [50]

Правила публикации [ править ]

Количественный анализ ОТ-ПЦР считается золотым стандартом для измерения количества копий конкретных кДНК-мишеней в образце, но он плохо стандартизован. [51] В результате, несмотря на то, что существует множество публикаций, в которых используется этот метод, во многих из них приводятся неадекватные экспериментальные детали и используется неподходящий анализ данных, чтобы сделать неправильные выводы. Из-за присущей изменчивости качества любых количественных данных ПЦР не только рецензентам трудно оценивать эти рукописи, но также становится невозможным воспроизвести исследования. [52] Признавая необходимость стандартизации отчетов об условиях экспериментов, Минимум информации для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени.(MIQE, произносится как mykee) рекомендации были опубликованы международным консорциумом академических ученых. В рекомендациях MIQE описывается минимум информации, необходимой для оценки количественных экспериментов ПЦР, которая должна потребоваться для публикации для поощрения лучшей экспериментальной практики и обеспечения актуальности, точности, правильной интерпретации и повторяемости количественных данных ПЦР. [53]

Помимо руководящих принципов отчетности, MIQE подчеркивает необходимость стандартизации номенклатуры, связанной с количественной ПЦР, во избежание путаницы; например, сокращение qPCR следует использовать для количественной ПЦР в реальном времени, а RT-qPCR следует использовать для обратной транскрипции-qPCR , а гены, используемые для нормализации, следует называть эталонными генами, а не домашними генами . В нем также предлагается, чтобы коммерческие термины, такие как зонды TaqMan, не использовались, а назывались зондами гидролиза.. Кроме того, предлагается использовать цикл количественной оценки (Cq) для описания цикла ПЦР, используемого для количественной оценки, вместо порогового цикла (Ct), точки пересечения (Cp) и точки взлета (TOP), которые относятся к одному и тому же значению, но были придуманы разными производителями инструментов реального времени . [51]

Руководство состоит из следующих элементов: 1) план эксперимента, 2) образец, 3) экстракция нуклеиновой кислоты, 4) обратная транскрипция, 5) информация о мишени кПЦР, 6) олигонуклеотиды, 7) протокол, 8) проверка и 9) данные. анализ. Конкретные элементы в каждом элементе имеют метку E (обязательно) или D (желательно). Те, которые помечены E, считаются критическими и незаменимыми, в то время как помеченные D считаются второстепенными, но важными для лучших практик. [53]

Ссылки [ править ]

  1. ↑ Freeman WM, Walker SJ, Vrana KE (январь 1999 г.). «Количественная ОТ-ПЦР: подводные камни и потенциал» . Биотехнологии . 26 (1): 112–22, 124–5. DOI : 10.2144 / 99261rv01 . PMID  9894600 .
  2. Перейти ↑ Mackay, Ian (2007). ПЦР в реальном времени в микробиологии: от диагностики до характеристики . Норфолк, Англия: Caister Academic Press. С.  440 . ISBN 978-1-904455-18-9.
  3. Перейти ↑ Joyce C (2002). Количественная ОТ-ПЦР. Обзор текущих методологий . Методы Мол. Биол. 193 . С. 83–92. DOI : 10.1385 / 1-59259-283-X: 083 . ISBN 978-1-59259-283-8. PMID  12325527 .
  4. ^ Кан XP, Цзян Т., Ли YQ и др. (2010). «Дуплексный анализ ОТ-ПЦР в реальном времени для обнаружения вируса птичьего гриппа H5N1 и пандемического вируса гриппа H1N1» . Virol. Дж . 7 : 113. DOI : 10,1186 / 1743-422X-7-113 . PMC 2892456 . PMID 20515509 .  
  5. ^ a b Bustin SA, Benes V, Nolan T, Pfaffl MW (июнь 2005 г.). «Количественная ОТ-ПЦР в реальном времени - перспектива». J. Mol. Эндокринол . 34 (3): 597–601. CiteSeerX 10.1.1.528.6638 . DOI : 10,1677 / jme.1.01755 . PMID 15956331 .  
  6. ^ Варкони-Гасич E, эллины RP (2010). «qRT-PCR малых РНК». Эпигенетика растений . Методы молекулярной биологии. 631 . С. 109–22. DOI : 10.1007 / 978-1-60761-646-7_10 . ISBN 978-1-60761-645-0. PMID  20204872 .
  7. ^ Taylor S, M Wakem, Dijkman G, M Alsarraj, Нгуен M (апрель 2010). «Практический подход к RT-qPCR-Publishing данных, которые соответствуют руководящим принципам MIQE». Методы . 50 (4): S1–5. DOI : 10.1016 / j.ymeth.2010.01.005 . PMID 20215014 . 
  8. ^ Spackman E, Senne DA, Myers TJ и др. (Сентябрь 2002 г.). «Разработка анализа ПЦР с обратной транскриптазой в реальном времени для вируса гриппа типа А и подтипов гемагглютинина птиц H5 и H7» . J. Clin. Microbiol . 40 (9): 3256–60. DOI : 10.1128 / jcm.40.9.3256-3260.2002 . PMC 130722 . PMID 12202562 .  
  9. ^ «УСКОРЕННОЕ РАЗРЕШЕНИЕ НА ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ЧРЕЗВЫЧАЙНЫХ СИТУАЦИЯХ (EUA) РЕЗЮМЕ ОТ-ПЦР-ТЕСТА COVID-19 (ЛАБОРАТОРНАЯ КОРПОРАЦИЯ АМЕРИКИ)» . FDA . Проверено 3 апреля 2020 .
  10. ^ Alwine JC, Кемп DJ, Stark GR (декабрь 1977). «Метод обнаружения специфических РНК в агарозных гелях путем переноса на диазобензилоксиметилбумагу и гибридизации с ДНК-зондами» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 74 (12): 5350–4. Bibcode : 1977PNAS ... 74.5350A . DOI : 10.1073 / pnas.74.12.5350 . PMC 431715 . PMID 414220 .  
  11. ^ Стреит S, Михальский CW, Эркан М, Kleeff Дж, Friess Н (2009). «Нозерн-блоттинг для обнаружения и количественного определения РНК в клетках и тканях рака поджелудочной железы». Nat Protoc . 4 (1): 37–43. DOI : 10.1038 / nprot.2008.216 . PMID 19131955 . 
  12. ^ Bustin SA (октябрь 2000). «Абсолютное количественное определение мРНК с использованием анализов полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени» . J. Mol. Эндокринол . 25 (2): 169–93. DOI : 10,1677 / jme.0.0250169 . PMID 11013345 . 
  13. ^ Йерро N, Esteve-Zarzoso B, Гонсалеса A, Mas A, Guillamón JM (ноябрь 2006). «Количественная ПЦР в реальном времени (QPCR) и обратная транскрипция-QPCR для обнаружения и подсчета общего количества дрожжей в вине» . Прил. Environ. Microbiol . 72 (11): 7148–55. DOI : 10,1128 / AEM.00388-06 . PMC 1636171 . PMID 17088381 .  
  14. ^ Сломка МДж, Pavlidis Т, Трусливый В.Я. и др. (Июль 2009 г.). «Валидированные методы ПЦР с обратной транскриптазой в реальном времени для диагностики и патотипирования евразийских вирусов птичьего гриппа H7» . Другие респираторные вирусы гриппа . 3 (4): 151–64. DOI : 10.1111 / j.1750-2659.2009.00083.x . PMC 4634683 . PMID 19627372 .  
  15. ^ Краткое изложение миссии: Полевой визит ВОЗ в Ухань, Китай, 20–21 января 2020 г .: https://www.who.int/china/news/detail/22-01-2020-field-visit-wuhan-china-jan-2020
  16. ^ a b c d Шмитген Т.Д., Закрайсек Б.А., Миллс А.Г., Горн В., Певец М.Дж., Рид М.В. (октябрь 2000 г.). «Количественная полимеразная цепная реакция обратной транскрипции для изучения распада мРНК: сравнение конечной точки и методов в реальном времени». Анальный. Биохим . 285 (2): 194–204. DOI : 10,1006 / abio.2000.4753 . PMID 11017702 . S2CID 258810 .  
  17. ^ а б Дипак С., Коттапалли К., Раквал Р. и др. (Июнь 2007 г.). «ПЦР в реальном времени: революция в обнаружении и анализе экспрессии генов» . Curr. Геномика . 8 (4): 234–51. DOI : 10.2174 / 138920207781386960 . PMC 2430684 . PMID 18645596 .  
  18. ^ a b Бустин С.А. (август 2002 г.). «Количественная оценка мРНК с использованием ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (ОТ-ПЦР): тенденции и проблемы» . J. Mol. Эндокринол . 29 (1): 23–39. DOI : 10,1677 / jme.0.0290023 . PMID 12200227 . 
  19. ^ a b Souazé F, Ntodou-Thomé A, Tran CY, Rostène W, Forgez P (август 1996). «Количественная ОТ-ПЦР: пределы и точность» . Биотехнологии . 21 (2): 280–5. DOI : 10.2144 / 96212rr01 . PMID 8862813 . 
  20. ↑ a b Wong ML, Medrano JF (июль 2005 г.). «ПЦР в реальном времени для количественного определения мРНК» . Биотехнологии . 39 (1): 75–85. DOI : 10.2144 / 05391rv01 . PMID 16060372 . 
  21. ^ Ли, Ланг; Он, Цзянь-ань; Ван, Вэй; Ся, Юнь; Песня, Ли; Чен, Цзэ-хан; Цзо, Ханг-чжи; Тан, Сюань-Пин; Хо, Аарон Хо-Пуй; Конг, Сиу-Кай; Лу, Джеки Фонг-Чуэн (01.08.2019). «Разработка метода количественной ПЦР с прямой обратной транскрипцией (dirRT-qPCR) для клинической диагностики вируса Зика» . Международный журнал инфекционных болезней . 85 : 167–174. DOI : 10.1016 / j.ijid.2019.06.007 . ISSN 1201-9712 . PMID 31202908 .  
  22. ^ Бахофен, Клаудиа; Уиллоби, Ким; Задокс, Рут; Берр, Пол; Меллор, Доминик; Рассел, Джордж К. (2013-06-01). «Прямая ОТ-ПЦР из сыворотки позволяет быстро и экономично провести филогенетический анализ вируса вирусной диареи крупного рогатого скота». Журнал вирусологических методов . 190 (1): 1–3. DOI : 10.1016 / j.jviromet.2013.03.015 . ISSN 0166-0934 . PMID 23541784 .  
  23. ^ a b Радживан М.С., Вернон С.Д., Тайсаванг Н., Унгер ER (февраль 2001 г.). «Подтверждение профилей экспрессии генов на основе массивов с помощью (кинетической) ОТ-ПЦР в реальном времени» . J Mol Diagn . 3 (1): 26–31. DOI : 10.1016 / S1525-1578 (10) 60646-0 . PMC 1907344 . PMID 11227069 .  
  24. ^ Каменный Marschat M, Carville A, Skowronek A, Lægreid WW (март 1994). «Обнаружение вируса африканской чумы лошадей методом ПЦР с обратной транскрипцией» . J. Clin. Microbiol . 32 (3): 697–700. DOI : 10.1128 / JCM.32.3.697-700.1994 . PMC 263109 . PMID 8195381 .  
  25. ^ a b Minton AP (апрель 1995 г.). «Конфайнмент как детерминант макромолекулярной структуры и реакционной способности. II. Эффекты слабо притягивающих взаимодействий между ограниченными макросолидами и ограничивающими структурами» . Биофиз. Дж . 68 (4): 1311–22. Bibcode : 1995BpJ .... 68.1311M . DOI : 10.1016 / S0006-3495 (95) 80304-8 . PMC 1282026 . PMID 7787020 .  
  26. ^ Hsu М, Ю. EY, Sprušanský O, Мак - Ичерн MJ, Луэ NF (июль 2012). «Функциональный анализ единственного гомолога Est1 / Ebs1 в Kluyveromyces lactis выявляет роли как в поддержании теломер, так и в устойчивости к рапамицину» . Эукариотическая клетка . 11 (7): 932–42. DOI : 10.1128 / EC.05319-11 . PMC 3416500 . PMID 22544908 .  
  27. ^ Schmittgen TD, Ливак KJ (2008). «Анализ данных ПЦР в реальном времени сравнительным методом C (T)». Nat Protoc . 3 (6): 1101–8. DOI : 10.1038 / nprot.2008.73 . PMID 18546601 . 
  28. ^ a b c d Тан, И-Вэй (13 сентября 2012 г.), « Передовые методы диагностической микробиологии» , ISBN 978-1461439691
  29. ^ Gause WC, Adamovicz J (июнь 1994). «Использование ПЦР для количественной оценки экспрессии генов» . Методы ПЦР Прил . 3 (6): S123–35. DOI : 10.1101 / gr.3.6.s123 . PMID 7522722 . 
  30. ^ Tsai SJ, Wiltbank MC (ноябрь 1996). «Количественная оценка мРНК с использованием конкурентной RT-PCR с методологией стандартной кривой» . Биотехнологии . 21 (5): 862–6. DOI : 10.2144 / 96215st04 . PMID 8922627 . 
  31. ^ Б Ramakers C, Ruijter JM, Депре RH, Мурман AF (март 2003). «Не требующий допущений анализ количественных данных полимеразной цепной реакции в реальном времени». Neurosci. Lett . 339 (1): 62–6. DOI : 10.1016 / S0304-3940 (02) 01423-4 . PMID 12618301 . 
  32. ↑ Halford WP, ​​Falco VC, Gebhardt BM, Carr DJ (январь 1999 г.). «Внутренняя количественная способность обратной транскрипционной полимеразной цепной реакции». Анальный. Биохим . 266 (2): 181–91. DOI : 10.1006 / abio.1998.2913 . PMID 9888974 . 
  33. Перейти ↑ King N (2010). «Использование сравнительной количественной ОТ-ПЦР для исследования влияния инкубации цистеина на экспрессию GPx1 в свежевыделенных кардиомиоцитах». Протоколы ОТ-ПЦР . Методы молекулярной биологии. 630 . С. 215–32. DOI : 10.1007 / 978-1-60761-629-0_14 . ISBN 978-1-60761-628-3. PMID  20301000 .
  34. ^ Chang JT, Chen IH, Liao CT, et al. (Ноябрь 2002 г.). «Сравнительный метод ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией для количественного определения ангиогенных факторов роста у пациентов с раком головы и шеи». Clin. Биохим . 35 (8): 591–6. DOI : 10.1016 / S0009-9120 (02) 00403-4 . PMID 12498992 . 
  35. ^ Холден, MJ; Ван, Л. (2008). «Количественная ПЦР в реальном времени: варианты и проблемы флуоресцентных датчиков» . Стандартизация и обеспечение качества измерений флуоресценции II . Серия Спрингера по флуоресценции. 6 . п. 489. DOI : 10.1007 / 4243_2008_046 . ISBN 978-3-540-70570-3.
  36. ^ Ян Д.К., Квеон С.Х., Ким Б.Х. и др. (Декабрь 2004 г.). «Цепная реакция полимеразы обратной транскрипции TaqMan для обнаружения вируса японского энцефалита» . J. Vet. Sci . 5 (4): 345–51. DOI : 10,4142 / jvs.2004.5.4.345 . PMID 15613819 . 
  37. ^ a b Sharkey FH, Banat IM, Marchant R (июль 2004 г.). «Обнаружение и количественная оценка экспрессии генов в экологической бактериологии» . Прил. Environ. Microbiol . 70 (7): 3795–806. DOI : 10,1128 / AEM.70.7.3795-3806.2004 . PMC 444812 . PMID 15240248 .  
  38. ^ Ratcliff RM, Chang G, Кок T, Sloots TP (июль 2007). «Молекулярная диагностика медицинских вирусов». Curr Issues Mol Biol . 9 (2): 87–102. PMID 17489437 . 
  39. ^ Elnifro Е.М., Ashshi AM, Cooper RJ, Klapper PE (октябрь 2000). «Мультиплексная ПЦР: оптимизация и применение в диагностической вирусологии» . Clin. Microbiol. Ред . 13 (4): 559–70. DOI : 10.1128 / cmr.13.4.559-570.2000 . PMC 88949 . PMID 11023957 .  
  40. ^ Bustin SA (июль 2005). «Количественная ПЦР на основе флуоресценции в реальном времени: обзор текущих процедур и предпочтений». Эксперт Преподобный Мол. Диаг . 5 (4): 493–8. DOI : 10.1586 / 14737159.5.4.493 . PMID 16013967 . S2CID 1833811 .  
  41. Перейти ↑ Lin L, Chamberlain L, Zhu LJ, Green MR (февраль 2012 г.). «Анализ Gal4-направленной активации транскрипции с использованием мутантов Tra1, селективно дефектных по взаимодействию с Gal4» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 109 (6): 1997–2002. Bibcode : 2012PNAS..109.1997L . DOI : 10.1073 / pnas.1116340109 . PMC 3277556 . PMID 22308403 .  
  42. ^ Torres RJ Гарсия MG, Puig JG (декабрь 2012). «Носитель и пренатальная диагностика болезни Леша-Найхана из-за дефекта регуляции экспрессии гена HPRT». Джин . 511 (2): 306–7. DOI : 10.1016 / j.gene.2012.09.121 . PMID 23046577 . 
  43. ^ Xi L, Nicastri Д.Г., Эль-Hefnawy T, Hughes SJ, Лукетич JD, Годфри TE (июль 2007). «Оптимальные маркеры для количественной ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени для обнаружения циркулирующих опухолевых клеток от меланомы, рака груди, толстой кишки, пищевода, головы и шеи, а также рака легких» . Clin. Chem . 53 (7): 1206–15. DOI : 10,1373 / clinchem.2006.081828 . PMID 17525108 . 
  44. ^ «Коронавирус: тест il viaggio dei» . Istituto Superiore di Sanità .
  45. ^ Shiao YH (декабрь 2003). «Новый метод обратной транскрипции полимеразной цепной реакции для точной количественной оценки» . BMC Biotechnol . 3 : 22. DOI : 10,1186 / 1472-6750-3-22 . PMC 317330 . PMID 14664723 .  
  46. ^ Gettemy JM, Ma B, Alic M, Gold MH (февраль 1998). "ПЦР-анализ обратной транскрипции регуляции семейства генов пероксидазы марганца" . Прил. Environ. Microbiol . 64 (2): 569–74. DOI : 10,1128 / AEM.64.2.569-574.1998 . PMC 106084 . PMID 9464395 .  
  47. ^ Мартель, Фатима; Дирк Грюндеманн; Эдгар Шёйг (31 марта 2002 г.). «Простой метод устранения ложноположительных результатов при ОТ-ПЦР» . J Biochem Mol Biol . 35 (2): 248–250. DOI : 10.5483 / BMBRep.2002.35.2.248 . PMID 12297038 . 
  48. ^ "OneStep Kit High Transcript Tools" . Биоинструменты. Архивировано из оригинального 20 мая 2013 года . Проверено 12 декабря 2012 года .
  49. ^ Деген, Ханс-Иоахим; Деуфель, Аннетт; Эйзель, Дорис; Грюневальд-Янхо, Стефани; Кизи, Джо (2006). Руководство по применению ПЦР (PDF) (3-е изд.). Рош Диагностика. С. 135–137.
  50. ^ "Двухэтапный протокол RT-PCR" (PDF) . Массачусетский технологический институт . Проверено 12 декабря 2012 года .
  51. ^ a b "www.microarrays.ca" (PDF) .
  52. ^ Bustin SA (апрель 2010). «Зачем нужны руководящие принципы публикации qPCR? - Случай для MIQE». Методы . 50 (4): 217–26. DOI : 10.1016 / j.ymeth.2009.12.006 . PMID 20025972 . 
  53. ^ a b Бастин С.А., Бенес В., Гарсон Дж. А. и др. (Апрель 2009 г.). «Рекомендации MIQE: минимум информации для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени» . Clin. Chem . 55 (4): 611–22. DOI : 10,1373 / clinchem.2008.112797 . PMID 19246619 . 

Внешние ссылки [ править ]

  • Протоколы ОТ-ПЦР от Университета штата Пенсильвания
  • База данных проверенных наборов праймеров для ПЦР ( критика веб-сайта )
  • Анимация, иллюстрирующая процедуру ОТ-ПЦР, из лаборатории Колд-Спринг-Харбор.
  • Ссылка в qPCR - академическая и промышленная информационная платформа