Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
На изображении показан фрагмент РНК сообщения с 5 рибосомами в процессе трансляции белка. Первым шагом в профилировании рибосом является переваривание сигнальной РНК ферментом рибонуклеазой, который расщепляет всю информационную РНК, за исключением 5 маленьких кусочков, которые защищены, потому что они окружены рибосомами. Затем белки удаляются из маленьких кусочков РНК и определяются последовательности оснований маленьких кусочков. Сравнивая эти последовательности с последовательностью гена, указываются точные положения рибосом.
Кратко о профилировании рибосом

Профилирование рибосом , или Ribo-Seq (также называемое следом рибосом ), представляет собой адаптацию техники, разработанной Джоан Стейтц и Мэрилин Козак почти 50 лет назад, которую Николас Инголия и Джонатан Вайсман адаптировали для работы с секвенированием следующего поколения, в котором используются специализированные информационные РНК ( мРНК ), чтобы определить, какие мРНК активно транслируются . [1] [2]Родственный метод, который также можно использовать для определения того, какие мРНК активно транслируются, - это методология очистки сродства трансляционных рибосом (TRAP), разработанная Натаниэлем Хайнцем из Рокфеллеровского университета (в сотрудничестве с Полом Грингардом и Мириам Хейман). [3] [2] TRAP не включает следы рибосом, но предоставляет информацию о типах клеток.

Описание [ править ]

Он создает «глобальный снимок» всех рибосом, активно транслирующихся в клетке в определенный момент, известный как трансатом . Следовательно, это позволяет исследователям идентифицировать расположение сайтов начала трансляции , набор транслируемых ORF в клетке или ткани, распределение рибосом на информационной РНК и скорость трансляции рибосом. [4] Профилирование рибосом нацелено только на последовательности мРНК, защищенные рибосомой во время процесса декодирования путем трансляции, в отличие от RNA-Seq , которая устанавливает последовательность всей мРНК данной последовательности, присутствующей в образце. [1] Этот метод также отличается отполисомное профилирование .

История [ править ]

Профилирование рибосом основано на открытии того факта, что мРНК внутри рибосомы может быть выделена с помощью нуклеаз , разрушающих незащищенные участки мРНК. Этот метод анализирует участки мРНК, конвертируемые в белок, а также уровни трансляции каждой области, чтобы получить представление о глобальной экспрессии генов. До его разработки усилия по измерению трансляции in vivo включали микроматричный анализ РНК, выделенной из полисом , а также профилирование трансляции посредством аффинной очистки рибосом, меченных эпитопами. Это полезные и дополнительные методы, но ни один из них не позволяет получить информацию о чувствительности и положении, полученную при профилировании рибосом. [4]

Использует [ редактировать ]

Существует три основных применения профилирования рибосом: определение транслируемых участков мРНК, наблюдение за складыванием формирующихся пептидов и измерение количества синтезируемых специфических белков.

Идентификация транслируемых участков мРНК [ править ]

Используя определенные лекарства, профилирование рибосом может идентифицировать инициирующие области мРНК, удлиняющиеся области и области остановки трансляции. [5] Инициирующие области можно обнаружить, добавив харрингтонин или лактидомицин, чтобы предотвратить дальнейшее инициирование. [5] Это позволяет анализировать начальный кодон мРНК по всему клеточному лизату , который использовался для определения не-AUG последовательностей, которые действительно инициируют трансляцию . [1] Другие удлиняющиеся области можно обнаружить, добавив антибиотики, такие как циклогексимид, которые ингибируют транслокацию, хлорамфеникол.который ингибирует перенос пептидов внутри рибосомы, или немедикаментозные средства, такие как термическое замораживание. [5] Эти методы замораживания при удлинении позволяют анализировать кинетику трансляции. Поскольку несколько рибосом могут транслировать одну молекулу мРНК для ускорения процесса трансляции, RiboSeq демонстрирует области, кодирующие белок внутри мРНК, и насколько быстро это делается в зависимости от секвенируемой мРНК. [1] [6] Это также позволяет профилировать рибосомы, чтобы показать сайты паузы в транскриптоме на определенных кодонах. [6] [7] Эти сайты медленной или приостановленной трансляции демонстрируются увеличением плотности рибосом, и эти паузы могут связывать определенные белки с их ролью в клетке.[1]

Сворачивание пептидов [ править ]

Сопряжение профилирования рибосом с ChIP может пролить свет на то, как и когда сворачиваются вновь синтезированные белки. [1] Используя следы, предоставленные Ribo-Seq, можно очистить определенные рибосомы, связанные с факторами, такими как шапероны. Остановка рибосомы в определенных временных точках, позволяющая ей транслировать полипептид с течением времени, а также воздействие на разные точки шаперона и осаждение с помощью ChIP очищает эти образцы и может показать, в какой момент времени пептид сворачивается. [1]

Измерение синтеза белка [ править ]

Ribo-Seq также можно использовать для оценки эффективности трансляции, прокси для синтеза белка. Для этого приложения создаются профили рибосом и данные сопоставленного секвенирования РНК. Анализ исходных данных может быть выполнен с помощью специализированных вычислительных структур (например, [8] ). Затем эффективность трансляции можно рассчитать как занятость каждого гена рибосомами при одновременном контроле экспрессии его РНК. [9] [10] Этот подход может сочетаться с направленным разрушением белков, которые связываются с РНК, и использованием профилирования рибосом для измерения различий в трансляции. [7] Эти разрушенные мРНК могут быть связаны с белками, чьи сайты связывания уже картированы на РНК, чтобы указать на регуляцию. [1] [7]

Процедура [ править ]

  1. Лизируйте клетки или ткань и изолируйте молекулы мРНК, связанные с рибосомами.
  2. Обездвиживающие комплексы. Обычно это делается с циклогексимидом, но можно использовать и другие химические вещества. Также можно отказаться от ингибиторов трансляции в условиях лизиса, неспособного к трансляции.
  3. С помощью рибонуклеаз переваривают РНК, не защищенную рибосомами.
  4. Изолируйте комплексы мРНК-рибосомы с помощью центрифугирования в градиенте плотности сахарозы или специальных хроматографических колонок.
  5. Очистка смеси фенолом / хлороформом от белков.
  6. Выбор размера для ранее защищенных фрагментов мРНК.
  7. Привязать 3 'адаптер к фрагментам.
  8. Вычтите известные контаминанты рРНК (необязательно).
  9. Обратная транскрипция РНК в кДНК с использованием обратной транскриптазы .
  10. Усиление специфическим для нити образом.
  11. Последовательность читается.
  12. Совместите результаты последовательности с геномной последовательностью, чтобы определить профиль трансляции. [11]

Материалы [ править ]

  • РНК-рибосомные комплексы
  • Циклогексимид
  • Нуклеазы
  • Фенол / хлороформ
  • Обратная транскриптаза
  • дНТФ
  • Метод секвенирования - библиотека кДНК. [11]

Ссылки [ править ]

  1. ^ a b c d e f g h Ingolia NT (март 2014 г.). «Профилирование рибосом: новые взгляды на трансляцию, от отдельных кодонов до шкалы генома». Обзоры природы. Генетика . 15 (3): 205–13. DOI : 10.1038 / nrg3645 . PMID  24468696 . S2CID  13069682 .
  2. ^ a b Догерти, Джозеф Д. (13 декабря 2017 г.). «Расширяющийся инструментарий перевода очистки сродства рибосом» . Журнал неврологии . 37 (50): 12079–12087. DOI : 10.1523 / JNEUROSCI.1929-17.2017 . PMC 5729187 . PMID 29237735 .  
  3. ^ Heiman M, Schaefer A, Gong S, Peterson JD, Day M, Ramsey KE; и другие. (2008). «Трансляционный подход профилирования для молекулярной характеристики типов клеток ЦНС» . Cell . 135 (4): 738–48. DOI : 10.1016 / j.cell.2008.10.028 . PMC 2696821 . PMID 19013281 .  CS1 maint: multiple names: authors list (link)
  4. ↑ a b Weiss RB, Atkins JF (декабрь 2011 г.). «Молекулярная биология. Перевод идет глобально». Наука . 334 (6062): 1509–10. DOI : 10.1126 / science.1216974 . PMID 22174241 . S2CID 206538968 .  
  5. ^ a b c Мишель А.М., Баранов П.В. (сентябрь 2013 г.). «Профилирование рибосом: монитор Hi-Def для синтеза белка в масштабе всего генома» . Междисциплинарные обзоры Wiley: РНК . 4 (5): 473–90. DOI : 10.1002 / wrna.1172 . PMC 3823065 . PMID 23696005 .  
  6. ^ a b Бускерк AR, Green R (март 2017 г.). «Приостановка, остановка и спасение рибосом у бактерий и эукариот» . Философские труды Лондонского королевского общества. Серия B, Биологические науки . 372 (1716): 20160183. DOI : 10.1098 / rstb.2016.0183 . PMC 5311927 . PMID 28138069 .  
  7. ^ a b c Андреев Д.Е., О'Коннор ПБ, Лофран Г., Дмитриев С.Е., Баранов П.В., Шацкий И.Н. (январь 2017 г.). «Понимание механизмов эукариотической трансляции, полученное с помощью профилирования рибосом» . Исследования нуклеиновых кислот . 45 (2): 513–526. DOI : 10.1093 / NAR / gkw1190 . PMC 5314775 . PMID 27923997 .  
  8. ^ Ozadam, Hakan; Гэн, Майкл; Ченик, Джан (1 мая 2020 г.). «RiboFlow, RiboR и RiboPy: экосистема для анализа данных профилирования рибосом с разрешением по длине чтения» . Биоинформатика . 36 (9): 2929–2931. DOI : 10.1093 / биоинформатики / btaa028 . ISSN 1367-4811 . PMC 7203755 . PMID 31930375 .   
  9. ^ Эртлин, Кристиан; Лорен, Джули; Мюри, Карл; Фурик, Люк; Тописирович, Иван; Ларссон, Ола (9 июля 2019 г.). «Общеприменимый транскриптомный анализ перевода с использованием anota2seq» . Исследования нуклеиновых кислот . 47 (12): e70. DOI : 10.1093 / NAR / gkz223 . ISSN 1362-4962 . PMC 6614820 . PMID 30926999 .   
  10. ^ Ченик, может; Ченик, Элиф Саринай; Byeon, Gun W .; Груберт, Фабиан; Candille, Софи I .; Спейсек, Дамек; Альсаллах, Билал; Тилгнер, Хаген; Araya, Carlos L .; Тан, Хуа; Риччи, Эмилиано (ноябрь 2015 г.). «Интегративный анализ уровней РНК, трансляции и белка выявляет различные регуляторные вариации у людей» . Геномные исследования . 25 (11): 1610–1621. DOI : 10.1101 / gr.193342.115 . ISSN 1549-5469 . PMC 4617958 . PMID 26297486 .   
  11. ^ a b Ingolia NT, Ghaemmaghami S, Newman JR, Weissman JS (апрель 2009 г.). «Полногеномный анализ трансляции in vivo с разрешением нуклеотидов с использованием профилирования рибосом» . Наука . 324 (5924): 218–23. Bibcode : 2009Sci ... 324..218I . DOI : 10.1126 / science.1168978 . PMC 2746483 . PMID 19213877 .  

Внешние ссылки [ править ]

  • GWIPS-viz браузер
  • РибоГалактика
  • RPF-DB
  • Поездки-ВИЗ браузер