Окрашивание - это метод, используемый для увеличения контраста образцов, как правило, на микроскопическом уровне. Пятна и красители часто используются в гистологии (исследование ткани под микроскопом) , а также в медицинских областях гистопатологией , гематологии и цитопатология , что акцент на изучении и диагнозов по болезни на микроскопическом уровне. Краски могут использоваться для определения биологических тканей (выделение, например, мышечных волокон или соединительной ткани ), популяций клеток (классификация различныхклетки крови ) или органеллы в отдельных клетках.
В биохимии это включает добавление к субстрату красителя, зависящего от класса ( ДНК , белки , липиды , углеводы ), для определения или количественной оценки присутствия определенного соединения. Окрашивание и флуоресцентная маркировка могут служить аналогичным целям. Биологическое окрашивание также используется для маркировки клеток при проточной цитометрии и для маркировки белков или нуклеиновых кислот при гель-электрофорезе .
Окрашивание не ограничивается биологическими материалами, оно также может использоваться для изучения структуры других материалов, например, ламеллярных структур полукристаллических полимеров или доменных структур блок-сополимеров .
In vivo против In vitro [ править ]
Окрашивание in vivo (также называемое витальным окрашиванием или прижизненным окрашиванием) - это процесс окрашивания живых тканей. Заставляя определенные клетки или структуры приобретать контрастный цвет (а), их форму ( морфологию ) или положение в клетке или ткани можно легко увидеть и изучить. Обычная цель - выявить цитологические детали, которые иначе могли бы быть неочевидными; однако окрашивание также может выявить, где определенные химические вещества или определенные химические реакции происходят в клетках или тканях.
Окрашивание in vitro включает окрашивание клеток или структур, которые были удалены из их биологического контекста. Некоторые пятна часто объединяются, чтобы выявить больше деталей и особенностей, чем отдельное пятно. В сочетании со специальными протоколами фиксации и подготовки образцов ученые и врачи могут использовать эти стандартные методы в качестве последовательных, повторяемых диагностических инструментов. Контрастирующий это пятночто делает клетку или структуру более заметным, когда не полностью виден с главным пятном.
- Кристаллический фиолетовый окрашивает как грамположительные, так и грамотрицательные микроорганизмы. Обработка спиртом удаляет кристаллический фиолетовый цвет только у грамотрицательных организмов. Сафранин в качестве контрастного красителя используется для окрашивания грамотрицательных организмов, обесцвеченных алкоголем.
В условиях ex vivo многие клетки продолжают жить и метаболизировать, пока не «закрепятся». Некоторые методы окрашивания основаны на этом свойстве. Эти пятна, исключенные живыми клетками, но поглощенные уже мертвыми клетками, называются витальными пятнами (например, трипановый синий или йодид пропидия для эукариотических клеток). Пятна, которые проникают в живые клетки и окрашивают их, называются суправитальными пятнами (например, новый метиленовый синий и блестящий крезиловый синий для ретикулоцитов).окрашивание). Однако в конечном итоге эти пятна токсичны для организма, некоторые в большей степени, чем другие. Частично из-за их токсического взаимодействия внутри живой клетки, когда суправитальные пятна попадают в живую клетку, они могут давать характерный образец окрашивания, отличный от окрашивания уже фиксированной клетки (например, вид «ретикулоцитов» по сравнению с диффузной «полихромазией»). Для достижения желаемого эффекта красители используются в очень разбавленных растворах от 1 : 5 000 до 1 : 500 000 (Howey, 2000). Обратите внимание, что многие красители можно использовать как в живых, так и в фиксированных клетках.
Микроскопия в окрашивании [ править ]
Обычным микроскопом, используемым при окрашивании, является микроскоп светлого поля . Светлопольный микроскоп относится к категории оптических микроскопов из-за осветителя, который излучает свет для создания яркого фона. Эти микроскопы обычно бинокулярные, что означает наличие двух окуляров с десятикратным увеличением. При просмотре окрашенных организмов при 100-кратном увеличении необходимо масло, чтобы помочь создать более четкое изображение из-за искажения разрешения из-за преломления света, которое становится невероятно выраженным при большом увеличении. [1]
Подготовка [ править ]
Необходимые подготовительные шаги зависят от типа запланированного анализа; Могут потребоваться некоторые или все из следующих процедур.
Влажные крепления - влажные крепления используются для наблюдения за живыми организмами и могут быть изготовлены с использованием воды и некоторых красителей. Жидкость добавляется на предметное стекло перед добавлением микроорганизмов, а покровное стекло помещается на образец в воде и окрашивается, чтобы помочь удержать его в поле зрения . [1]
Фиксация, которая сама по себе может состоять из нескольких шагов, направлена на максимальное сохранение формы вовлеченных клеток или ткани. Иногда используется термофиксация, чтобы убить, закрепить и изменить образец таким образом, чтобы он впитал пятна. Большинство химических фиксаторов (химические вещества, вызывающие фиксацию) создают химические связи между белками и другими веществами в образце, увеличивая их жесткость. Обычные фиксаторы включают формальдегид , этанол , метанол и / или пикриновую кислоту . Кусочки ткани могут быть залиты парафином, чтобы увеличить их механическую прочность и стабильность и облегчить разрезание на тонкие ломтики.[2] Протравливание: это химические вещества, которые обладают способностью создавать красители для окрашивания материалов, которые в противном случае не поддаются окрашиванию.
Протравы делятся на две категории:
а) Основная протрава: вступает в реакцию с кислотными красителями, например квасцами, сульфатом железа, хлоридом цетилпиридиния и т. д.
б) Кислая протрава: вступает в реакцию с основными красителями, например пикриновой кислотой, дубильной кислотой и т. д.
[2] Прямое окрашивание: без протравы.
Непрямое окрашивание: окрашивание с помощью протравы.
| Sr Нет. | Название техники непрямого окрашивания | Название нанесенной протравы |
|---|---|---|
| 1.) | Окрашивание по Граму | Йод по Граму |
| 2.) | Окрашивание клеточной стенки а.) Метод Рингера б.) Метод Дьяра | 10% дубильная кислота 0,34% цены за клик |
| 3.) | Окрашивание жгутиков а.) Метод Лейфсона б.) Метод Лёффлера | Дубильная кислота в пятне Лейфсона Протрава Леффлера (20% дубильная кислота) |
| 4.) | Окрашивание спирохетами а.) Метод Фонтаны б.) Метод Беккера | Протрава Фонтаны (5% дубильная кислота) Протрава Фонтаны (5% дубильная кислота) |
Проницаемость включает обработку клеток (обычно) мягким поверхностно-активным веществом . Эта обработка растворяет клеточные мембраны и позволяет более крупным молекулам красителя проникать внутрь клетки.
Установка обычно включает прикрепление образцов к предметному стеклу микроскопа для наблюдения и анализа. В некоторых случаях клетки можно выращивать прямо на предметном стекле. Для образцов рыхлых клеток (например, мазка крови или мазка Папаниколау ) образец можно наносить непосредственно на предметное стекло. Для более крупных кусков ткани делаются тонкие срезы (срезы) с помощью микротома ; затем эти срезы можно смонтировать и проверить.
Стандартизация [ править ]
Большинство красок, обычно используемых в микроскопии, доступны в виде красителей, сертифицированных BSC . Это означает, что образцы партии производителя были протестированы независимым органом, Комиссией по биологическим пятнам ( BSC ), и было установлено, что они соответствуют или превышают определенные стандарты чистоты, содержания красителя и эффективности методов окрашивания, что обеспечивает более точное выполнение экспериментов и более высокую надежность. полученные результаты. Эти стандарты опубликованы в журнале Комиссии Biotechnic & Histochemistry . [3] Многие красители не соответствуют составу от одного поставщика к другому. Использование красителей, сертифицированных BSC, устраняет источник неожиданных результатов. [4]
Некоторые продавцы продают пятна, «сертифицированные» ими, а не Комиссией по биологическим пятнам. Такие продукты могут подходить или не подходить для диагностических и других приложений. [5]
Отрицательное окрашивание [ править ]
Простой метод окрашивания на бактерии, который обычно бывает успешным, даже если методы окрашивания не дают результатов, - это использовать отрицательное окрашивание . Этого можно добиться, намазав образец на предметное стекло, а затем нанеся нигрозин (черный синтетический краситель) или тушь (водная суспензия частиц углерода). После высыхания микроорганизмы можно рассматривать под микроскопом в светлом поле как более светлые включения, хорошо контрастирующие с окружающей их темной средой. [6] Отрицательное окрашивание может окрашивать фон вместо организмов, поскольку клеточная стенка микроорганизмов обычно имеет отрицательный заряд, который отталкивает отрицательно заряженное пятно. Красители, используемые при отрицательном окрашивании, являются кислыми.[1] Примечание: отрицательное окрашивание - это мягкий метод, который не может уничтожить микроорганизмы и поэтому не подходит для изучения патогенов.
Положительное окрашивание [ править ]
В отличие от отрицательного окрашивания, при положительном окрашивании используются базовые красители для окрашивания образца на ярком фоне. Хотя хромофор используется как для отрицательного, так и для положительного окрашивания, в этом методе используется положительно заряженный ион, а не отрицательный. Отрицательно заряженная клеточная стенка многих микроорганизмов привлекает положительно заряженный хромофор, в результате чего образец впитывает пятно, придавая ему цвет используемого красителя. Положительное окрашивание используется в микробиологии чаще, чем отрицательное. Ниже перечислены различные типы положительного окрашивания. [1]
Простое окрашивание против дифференциального окрашивания [ править ]
Простое окрашивание - это метод, при котором на слайде одновременно используется только один тип окрашивания. Поскольку используется только одно пятно, образцы (для положительных пятен) или фон (для отрицательных пятен) будут одного цвета. Поэтому простые красители обычно используются для просмотра только одного организма на слайде. При дифференциальном окрашивании используется несколько красок на предметное стекло. В зависимости от используемых красителей организмы с разными свойствами будут иметь разные цвета, что позволяет классифицировать несколько образцов. Дифференциальное окрашивание также можно использовать для окрашивания различных органелл в одном организме, что можно увидеть при окрашивании эндоспор . [1]
Типы методов окрашивания [7] [ править ]
| Sr. No. | Техника окрашивания | Подготовка | Заявление | Результат |
|---|---|---|---|---|
| 1. | Простой (монохромный) | Пятно мазка с помощью одного красителя. например. Метиленовый синий, сафранин и др. | Используется для выделения микробов и иллюстрации клеточного формы и расположения. | Организмы окрашиваются в цвет нанесенной морилки |
| 2. | Отрицательный (облегчение) | Мазок смешать с нигрозином и намазать в тонкую пленку | Изучение морфологии клеток | Организм в пятнах, фон черный |
| 3 | Грамм | Первичное окрашивание: кристаллический фиолетовый нанесен на пленку, затем обработан йодом (протравой), спиртом (обесцвечивающим средством) и окрашен сафранином. | Характеризует бактерии в одной из двух групп: грамположительные или грамотрицательные. | Грамположительный цвет имеет фиолетовый цвет Грамм отрицательный имеет розовый цвет |
| 4 | Кислотное голодание (метод Циля-Нильсена) | Пленка, окрашенная горячим ZNCF, обесцвеченная (кислота-спирт) и контркрашивание метиленовым синим | Отделить не обесцвеченные кислотоустойчивые бактерии, не обесцвеченные, от окрашенных некислотных бактерий | Кислотостойкие бактерии: красный Некислотный: синий |
| 5 | Эндоспора (метод Дорнора) | Первичное пятно Малахитовый зеленый нагрев фиксируется для проникновения спор; вегетативные клетки контрастируют с сафранином | Обнаруживает наличие эндоспор у шести родов бактерий | Эндоспоры: зеленые Вегетативные клетки: красный |
| 6 | Капсула A: Метод Hiss (Позитивная техника) B: Техника Маневала (отрицательная) | Мазок, окрашенный красителем Гисс после обработки сульфатом меди Бактериальную суспензию смазывают вместе с конго красным и наносят краситель Маневаля. | Капсулы можно рассматривать как прозрачные зоны, окружающие клетки капсулированных бактерий, и они используются для демонстрации присутствия капсул. | Капсула: светло-фиолетовый / бледно-лиловый цвет. Бактерии: фиолетовая капсула, бактериальная клетка, выделяется на темном фоне |
| 7 | Клеточная стенка (метод Дьяра) | Мазок обрабатывают CPC, который диссоциирует с образованием положительно заряженного цетилпиридиния и отрицательно заряженных ионов хлора. Положительно заряженные ионы адсорбируются на отрицательно заряженной клеточной стенке. | Окрашивает клеточную стенку бактерии | Клеточная стенка: красная Цитоплазма: синяя |
| 8 | Жгутики (метод Лейфсона) | Протравливание утолщает жгутики перед окрашиванием и увеличивает микроскопическую видимость при окрашивании красителем Лейфсона. | Демонстрирует наличие жгутиков | Жгутики: красные Вегетативные клетки: синие |
| 9 | Ядерный материал (метод Фельгена) | Мазок обрабатывают для гидролиза, чтобы высвободить пурины из ДНК, пурины, чтобы вызвать сдвиг фуранозы в альдегид. Альдегидные группы могут реагировать с реактивом Шиффа с образованием аддитивных соединений. | Продемонстрировать наличие ДНК в клетке. Но для обнаружения ДНК РНК должна быть избирательно разрушена кислотным гидролизом, не затрагивая ДНК. | Ядерный материал - розовато-фиолетовый, Цитоплазма - бесцветная |
| 10 | Метахроматические гранулы (метод Альберта) | Мазок сначала обрабатывают хлороформом для удаления жиров. Мазок, нанесенный красителем Альберта, который содержит катионные красители, такие как толуидиновый синий и малахитовый зеленый. Толуидиновый синий предпочтительно окрашивает гранулы, в то время как малахитовый зеленый окрашивает цитоплазму. | Гранулы демонстрируют типичную природу монохроматизма, что используется для демонстрации гранул. | Гранулы: голубовато-черные, цитоплазма: зеленые |
| 11 | Внутриклеточные липиды (метод Бурдона) | Липиды окрашиваются жирорастворимыми красителями, такими как суданский черный. При применении Судана черные красители-B переходят в липиды и удерживаются там, в то время как цитоплазма контрастно окрашивается сафранином. | Для определения наличия липидов в клеточной стенке, клеточной мембране или жировых шариках (ПОБ в цитоплазме) | Липидные гранулы: темно-синие, Цитоплазма: светло-розовая. |
| 12 | Полисахарид (метод Хотча-Кусса) | Полисахарид окисляется периодатом с образованием полиальдегида, который реагирует с реактивами Шиффа до красного цвета, а цитоплазма окрашивается малахитовым зеленым. | Обнаруживает скопление гранул полисахарида в клетках | Полисахарид: красный Цитоплазма: зеленая |
Конкретные техники [ править ]
Окрашивание по Граму [ править ]
Окрашивание по Граму используется для определения грамм-статуса и классификации бактерий в целом на основе состава их клеточной стенки . При окрашивании по Граму используется кристаллический фиолетовый для окрашивания клеточных стенок, йод (в качестве протравы) и контрастное окрашивание фуксином или сафранином для (маркировки всех бактерий). Статус по Граму помогает разделить образцы бактерий на две группы, обычно представляющие их филогенез. Эта характеристика в сочетании с другими методами делает его полезным инструментом в лабораториях клинической микробиологии, где он может быть важным при раннем выборе подходящих антибиотиков . [8]
На большинстве препаратов, окрашенных по Граму , грамотрицательные организмы выглядят красными или розовыми из-за их контрастного окрашивания . Из-за более высокого содержания липидов после обработки спиртом пористость клеточной стенки увеличивается, следовательно, комплекс CVI (кристаллический фиолетовый - йод) может проходить через нее. Таким образом, основное пятно не сохраняется. Кроме того, в отличие от большинства грамположительных бактерий, грамотрицательные бактерии имеют только несколько слоев пептидогликана и вторичную клеточную мембрану, состоящую в основном из липополисахарида.
Окрашивание эндоспор [ править ]
Окрашивание эндоспор используется для определения наличия или отсутствия эндоспор , которые затрудняют уничтожение бактерий. Доказано, что споры бактерий трудно окрашивать, поскольку они не проницаемы для водных красителей. Окрашивание эндоспор особенно полезно для идентификации образующих эндоспоры бактериальных патогенов, таких как Clostridium difficile.. До разработки более эффективных методов это окрашивание выполняли методом Виртца с термофиксацией и контрастированием. Благодаря использованию малахитового зеленого и разбавленного соотношения карбол-фуксина, фиксация бактерий в осмиевой кислоте была отличным способом гарантировать отсутствие смешивания красителей. Однако недавно пересмотренные методы окрашивания значительно сократили время, необходимое для создания этих пятен. Этот пересмотр включал замену карбол-фуксина водным сафранином в сочетании с недавно разбавленной 5% -ной формулой малахитового зеленого. Этот новый и улучшенный состав пятен был выполнен таким же образом, как и раньше, с использованием термофиксации, полоскания и промокания для последующего исследования. При обследовании все бактерии, образующие эндоспоры, будут окрашены в зеленый цвет, а все остальные клетки станут красными. [9]
Пятно Циля-Нильсена [ править ]
Циля-Нильсен этого пятно некислотоустойчивого используются для видов пятна микобактерий туберкулеза , что не окрашивают с помощью стандартных процедур лабораторного окрашивания , таких как окрашивание по Граму.
Это окрашивание осуществляется за счет использования как красного карбол-фуксина, который окрашивает бактерии, так и контр-красителя, такого как метиленовый синий .
Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) [ править ]
Окрашивание гематоксилином и эозином часто используется в гистологии для исследования тонких срезов тканей. [10] Гематоксилин окрашивает ядра клеток в синий цвет, а эозин окрашивает цитоплазму, соединительную ткань и другие внеклеточные вещества в розовый или красный цвет. [10] Эозин сильно поглощается эритроцитами , окрашивая их в ярко-красный цвет. В искусно приготовленном препарате H&E красные кровяные тельца почти оранжевые, а коллаген и цитоплазма (особенно мышцы) приобретают разные оттенки розового.
Окрашивание по Папаниколау [ править ]
Окрашивание по Папаниколауили PAP-окрашивание, было разработано для замены тонкоигольной аспирационной цитологии (FNAC) в надежде сократить время и стоимость окрашивания без ущерба для качества. Это окрашивание - часто используемый метод для исследования образцов клеток из различных типов тканей в различных органах. Окрашивание PAP претерпело несколько изменений, чтобы стать «подходящей альтернативой» для FNAC. Этот переход произошел из-за того, что ученые оценили влажные фиксированные мазки, сохраняющие структуру ядер, в отличие от непрозрачного внешнего вида высушенных на воздухе мазков Романовского. Это привело к созданию гибридного окрашивания влажной фиксации и воздушной сушки, известного как сверхбыстрое окрашивание папаниколау. Эта модификация включает использование назального физиологического раствора для регидратации клеток с целью повышения прозрачности клеток и сочетается с использованием спиртового формалина для улучшения цвета ядер.Окрашивание по папаниколау теперь используется вместо цитологического окрашивания во всех типах органов из-за его повышения морфологического качества, уменьшения времени окрашивания и снижения стоимости. Часто используется для окрашиванияОбразцы мазка Папаниколау . [11] Он использует комбинацию гематоксилина , оранжевый G , эозин Y , светло - зеленый SF желтоватый , а иногда Bismarck Brown Y . [10] [11] [12]
Окрашивание ПАС [ править ]
[13] Периодическая кислота-Шифф - это специальный краситель для гистологии, используемый для маркировки углеводов ( гликоген , гликопротеин , протеогликаны).). PAS обычно используется в тканях печени, где образуются отложения гликогена, что делается для того, чтобы различать различные типы болезней накопления гликогена. PAS важен, потому что он может обнаруживать гранулы гликогена, обнаруженные в опухолях яичников и поджелудочной железы эндокринной системы, а также в мочевом пузыре и почках почечной системы. Базальные мембраны также могут отображаться при окрашивании PAS и могут быть важны при диагностике заболевания почек. Из-за большого количества углеводов в клеточной стенке гиф и дрожжевых форм грибов окрашивание Периодной кислотой по Шиффу может помочь найти эти виды в образцах тканей человеческого тела.
Трихром Массона [ править ]
Трихром Массона - это (как следует из названия) протокол трехцветного окрашивания. Рецепт развился из оригинальной техники Массона для различных конкретных применений, но все они хорошо подходят для различения клеток от окружающей соединительной ткани . Большинство рецептов производят красный кератин и мышечные волокна, синее или зеленое окрашивание коллагена и кости , светло-красное или розовое окрашивание цитоплазмы и ядер черных клеток .
Романовские пятна [ править ]
Эти пятна Романовского считаются полихромными окрашиваниями эффекта и основаны на сочетании эозина плюса (химически восстановленный эозин ) и деметилируют метиленовый синие (содержащий свои продукты окисления лазури A и лазурный B ). Это окрашивание проявляет различные цвета для всех клеточных структур («эффект Романовского-Гимзы») и поэтому использовалось для окрашивания полиморфов нейтрофилов и ядер клеток. Общие варианты включают пятно Райта , пятно Дженнер , Май-Грюнвальд пятно, Leishman пятно и Гимз .
Все они используются для исследования образцов крови или костного мозга . Они предпочтительнее H&E для исследования клеток крови, потому что различные типы лейкоцитов ( лейкоцитов ) можно легко различить. Все они также подходят для анализа крови на наличие паразитов, передающихся через кровь, таких как малярия . [14]
Серебряное окрашивание [ править ]
Окрашивание серебром - это использование серебра для окрашивания гистологических срезов . Такое окрашивание важно для демонстрации белков (например, коллагена III типа ) и ДНК . Он используется, чтобы показать как вещества внутри, так и снаружи клеток . Окрашивание серебром также используется в гель-электрофорезе в температурном градиенте .
Аргентаффинные клетки восстанавливают раствор серебра до металлического серебра после фиксации формалином . Этот метод был открыт итальянцем Камилло Гольджи с помощью реакции между нитратом серебра и дихроматом калия , в результате чего в некоторых клетках осаждается хромат серебра (см . Метод Гольджи ). A rgyrophilic клетка уменьшает раствор серебра до металлического серебра после воздействия на пятно , который содержит восстановитель . Примером этого может быть гидрохинон или формалин.
Окрашивание Суданом [ править ]
При окрашивании суданом используются судановые красители для окрашивания суданофильных веществ, часто включая липиды . Часто используются Судан III , Судан IV , Oil Red O , четырехокись осмия и Sudan Black B. Окрашивание суданом часто используется для определения уровня фекального жира при диагностике стеатореи .
Окрашивание Виртца-Конклина [ править ]
Окрашивание Виртца-Конклина - это специальная техника, разработанная для окрашивания настоящих эндоспор с использованием красителя малахитовый зеленый в качестве основного красителя и сафранина в качестве контрастного красителя. После окрашивания они не обесцвечиваются. Добавление тепла во время процесса окрашивания является огромным фактором. [15] Тепло помогает открыть мембрану спор, чтобы краситель мог проникнуть внутрь. Основная цель этого красителя - показать прорастание спор бактерий. Если идет процесс прорастания, то спора станет зеленой из-за малахитового зеленого цвета, а окружающая клетка станет красной из-за сафранина. Это окрашивание также может помочь определить ориентацию спор внутри бактериальной клетки; будь то терминал (на кончике), субтерминальный (внутри ячейки) или центральный (полностью в середине ячейки).
Окрашивание пептидов, гибридизующих коллаген [ править ]
Окрашивание гибридизирующим пептидом коллагена (ГПК) позволяет легко и напрямую окрашивать денатурированные коллагены любого типа (типа I, II, IV и т. Д.), Независимо от того, были ли они повреждены или разложены ферментативными, механическими, химическими или термическими способами. Они работают, свертываясь в тройную спираль коллагена с доступными одиночными нитями в ткани. КГП можно визуализировать с помощью простого флуоресцентного микроскопа .
Общие биологические пятна [ править ]
Различные пятна реагируют или концентрируются в разных частях клетки или ткани, и эти свойства используются для выявления определенных частей или областей. Некоторые из наиболее распространенных биологических пятен перечислены ниже. Если не указано иное, все эти красители можно использовать с фиксированными клетками и тканями; отмечены витальные красители (пригодные для использования с живыми организмами).
Акридиновый апельсин [ править ]
Акридиновый оранжевый (АО) представляет собой флуоресцентный катионный краситель, селективный к нуклеиновым кислотам, полезный для определения клеточного цикла. Он проницаем для клеток и взаимодействует с ДНК и РНК посредством интеркаляции или электростатического притяжения. Когда он связан с ДНК, он очень похож по спектру на флуоресцеин. Подобно флуоресцеину, он также полезен в качестве неспецифического красителя для подсветки традиционно окрашенных клеток на поверхности твердого образца ткани (окрашивание с подсветкой флуоресценцией [16] ).
Бисмарк Браун [ править ]
[17] Бисмарк коричневый (также Бисмарк коричневый Y или манчестерский коричневый) придает желтый цвет кислым муцинам . и интенсивный коричневый цвет тучных клеток. Одно из значений этого пятна по умолчанию состоит в том, что оно скрывает любую окружающую его структуру и снижает качество контраста. Чтобы оно было полезным, его нужно сочетать с другими пятнами. Некоторыми дополнительными красителями, используемыми вместе с коричневым Бисмарком, являются гематоксилин и толуидиновый синий, которые обеспечивают лучший контраст в гистологическом образце.
Кармин [ править ]
Кармин - это ярко-красный краситель, используемый для окрашивания гликогена , в то время как карминные квасцы - это ядерный краситель. Пятна кармина требуют использования протравы, обычно алюминиевой .
Кумасси синий [ править ]
Кумасси синий (также блестящий синий) неспецифически окрашивает белки в ярко-синий цвет. Его часто используют в гель-электрофорезе.
Cresyl violet [ править ]
Крезиловый фиолетовый окрашивает кислотные компоненты цитоплазмы нейронов в фиолетовый цвет, особенно тельца Ниссля . Часто используется в исследованиях мозга.
Кристально-фиолетовый [ править ]
Кристаллический фиолетовый в сочетании с подходящей протравой окрашивает клеточные стенки в фиолетовый цвет. Кристаллический фиолетовый - это краситель, используемый при окрашивании по Граму.
DAPI [ править ]
DAPI представляет собой флуоресцентный краситель ядер, возбуждаемый ультрафиолетовым светом и демонстрирующий сильную синюю флуоресценцию при связывании с ДНК . DAPI связывается с A = T-богатыми повторами хромосом. DAPI также не виден при обычной просвечивающей микроскопии. Его можно использовать в живых или фиксированных клетках. Клетки, окрашенные DAPI, особенно подходят для подсчета клеток. [18]
Эосин [ править ]
Эозин чаще всего используется в качестве контрастного красителя гематоксилину, придавая розовый или красный цвет цитоплазматическому материалу, клеточным мембранам и некоторым внеклеточным структурам. Он также придает сильный красный цвет эритроцитам . Эозин также может использоваться в качестве контрастного красителя в некоторых вариантах окрашивания по Граму и во многих других протоколах. На самом деле существует два очень близких соединения, обычно называемых эозином. Чаще всего используется эозин Y(также известный как эозин Y ws или эозин желтоватый); он имеет слегка желтоватый оттенок. Другое соединение эозина - это эозин B (эозин голубоватый или имперский красный); у него очень слабый голубоватый оттенок. Эти два красителя взаимозаменяемы, и использование того или другого является скорее вопросом предпочтений и традиций.
Бромид этидия [ править ]
Бромид этидия интеркалирует и окрашивает ДНК, образуя флуоресцентное красно-оранжевое окрашивание. Хотя он не окрашивает здоровые клетки, его можно использовать для идентификации клеток, находящихся на последних стадиях апоптоза - такие клетки имеют гораздо более проницаемые мембраны . Следовательно, бромистый этидий часто используется в качестве маркера апоптоза в популяциях клеток и для определения местоположения полос ДНК при гель-электрофорезе . Краситель также можно использовать в сочетании с акридиновым оранжевым (АО) при подсчете жизнеспособных клеток. Это комбинированное окрашивание EB / AO заставляет живые клетки флуоресцировать зеленым, в то время как апоптозные клетки сохраняют характерную красно-оранжевую флуоресценцию.
Кислый фуксин [ править ]
Кислый фуксин можно использовать для окрашивания коллагена, гладких мышц или митохондрий . Кислотный фуксин используется в качестве окраски ядер и цитоплазмы в методе трихрома Мэллори. Кислый фуксин окрашивает цитоплазму в некоторых вариантах трихрома Массона. В пикрофуксине Ван Гизона кислый фуксин придает красный цвет коллагеновым волокнам. Кислый фуксин также является традиционным красителем для митохондрий (метод Альтмана).
Гематоксилин [ править ]
Гематоксилин (гематоксилин в Северной Америке) - это ядерное пятно. [10] Используется с протравой, окрашивающей ядра гематоксилином в сине-фиолетовый или коричневый цвет. [10] Он чаще всего используется с эозином при окрашивании H&E (гематоксилин и эозин), одной из наиболее распространенных процедур в гистологии . [10]
Пятна Hoechst [ править ]
Хехст является бис - бензимидазолом производного соединения , которое связывается с малой бороздкой в ДНК . Пятна Hoechst, часто используемые в флуоресцентной микроскопии для окрашивания ДНК, выглядят желтыми при растворении в водных растворах и излучают синий свет при УФ-возбуждении. Существует два основных типа Hoechst : Hoechst 33258 и Hoechst 33342 . Эти два соединения функционально похожи, но имеют небольшую разницу в структуре. Hoechst 33258 содержит концевую гидроксильную группу и, таким образом, более растворим в водном растворе, однако эти характеристики снижают его способность проникать через плазматическую мембрану . Hoechst 33342 содержитзамещение этила в концевой гидроксильной группе (т.е. этиловой эфирной группе), что делает ее более гидрофобной для облегчения прохождения через плазматическую мембрану
Йод [ править ]
Йод используется в химии как индикатор крахмала . Когда крахмал смешивается с йодом в растворе, появляется интенсивный темно-синий цвет, представляющий комплекс крахмал / йод. Крахмал - это вещество, обычное для большинства растительных клеток, поэтому слабый раствор йода окрашивает крахмал, присутствующий в клетках. Йод является одним из компонентов метода окрашивания, известного как окрашивание по Граму , используемого в микробиологии . Йод, используемый в качестве протравы при окрашивании по Граму, усиливает проникновение красителя через поры, присутствующие в клеточной стенке / мембране.
Раствор Люголя или йод Люголя (IKI) представляет собой коричневый раствор, который становится черным в присутствии крахмалов и может использоваться в качестве окрашивания клеток, делая ядра клеток более заметными.
Раствор Люголя, используемый с обычным уксусом (уксусной кислотой), используется для выявления предраковых и раковых изменений в тканях шейки матки и влагалища во время контрольных обследований «мазок Папаниколау» при подготовке к биопсии. Уксусная кислота заставляет аномальные клетки бледнеть, а нормальные ткани окрашивают йод в коричневый цвет красного дерева. [19]
Малахитовый зеленый [ править ]
Малахитовый зеленый (также известный как ромбовидный зеленый B или зеленый виктория B) можно использовать в качестве сине-зеленого контрастного окрашивания сафранину в технике окрашивания по Гименесу для бактерий. Его также можно использовать для прямого окрашивания спор .
Метиловый зеленый [ править ]
Метиловый зеленый обычно используется в светлопольных микроскопах, а также в флуоресцентных микроскопах [20] для окрашивания хроматина клеток, чтобы их было легче рассмотреть.
Метиленовый синий [ править ]
Метиленовый синий используется для окрашивания клеток животных, таких как клетки щек человека, чтобы сделать их ядра более заметными. Также используется для окрашивания мазков крови в цитологии.
Нейтральный красный [ править ]
Нейтральный красный (или толуиленовый красный) окрашивает вещество Ниссля в красный цвет. Обычно его используют в качестве контрастного красителя в сочетании с другими красителями.
Нильский синий [ править ]
Нильский синий (или Нильский синий А) окрашивает ядра в синий цвет. Его можно использовать с живыми клетками.
Нил красный [ править ]
Нильский красный (также известный как оксазон нильского синего) образуется при кипячении нильского синего с серной кислотой . Это дает смесь нильского красного и нильского синего. Нильский красный - липофильное пятно; он будет накапливаться в липидных глобулах внутри клеток, окрашивая их в красный цвет. Нильский красный можно использовать с живыми клетками. Он сильно флуоресцирует при разделении на липиды, но практически не светится в водном растворе.
Тетраоксид осмия (официальное название: тетраоксид осмия) [ править ]
Тетраоксид осмия используется в оптической микроскопии для окрашивания липидов . Он растворяется в жирах и восстанавливается органическими веществами до элементарного осмия, легко видимого черного вещества.
Иодид пропидия [ править ]
Иодид пропидия представляет собой флуоресцентный интеркалирующий агент, который можно использовать для окрашивания клеток. Иодид пропидия используется в качестве окраски ДНК в проточной цитометрии для оценки жизнеспособности клеток или содержания ДНК в анализе клеточного цикла или в микроскопии для визуализации ядра и других ДНК-содержащих органелл. Йодид пропидия не может проникать через мембрану живых клеток, что делает его полезным для дифференциации некротических, апоптотических и здоровых клеток. PI также связывается с РНК, что требует обработки нуклеазами, чтобы различать окрашивание РНК и ДНК.
Родамин [ править ]
Родамин - это флуоресцентный краситель, специфичный для белка, обычно используемый в флуоресцентной микроскопии.
Сафранин [ править ]
Сафранин (или сафранин О) - красный катионный краситель. Он связывается с ядрами (ДНК) и другими тканевыми полианионами, включая гликозаминогликаны в хрящевых и тучных клетках, а также с компонентами лигнина и пластид в тканях растений. [21] Сафранин не следует путать с шафраном, дорогим натуральным красителем, который используется в некоторых методах для придания желтого цвета коллагену, чтобы контрастировать с синим и красным цветами, которые другие красители придают ядрам и цитоплазме у животных (включая человека). ткани.
Часто используется неправильное написание «сафранин». Окончание -ine подходит для сафранина О, потому что этот краситель является амином, [22] [23] [4]
Окрашиваемость тканей [ править ]
Ткани, впитывающие пятна, называются хроматическими . Хромосомы были названы так из-за их способности поглощать фиолетовое пятно.
Положительное сродство к конкретному красителю может быть обозначено суффиксом -фильный . Например, ткани, окрашенные лазурным пятном, можно назвать азурофильными . Это также может использоваться для более общих свойств окрашивания, таких как ацидофильный для тканей, окрашиваемых кислотными пятнами (в первую очередь эозином ), базофильный при окрашивании основными красителями и амфофильный [24] при окрашивании кислотными или основными красителями. Напротив, хромофобные ткани не сразу поглощают цветной краситель.
Электронная микроскопия [ править ]
Как и в световой микроскопии, красители можно использовать для увеличения контраста в просвечивающей электронной микроскопии . Обычно используются электронно-плотные соединения тяжелых металлов.
Фосфорновольфрамовая кислота [ править ]
[25] Фосфорновольфрамовая кислота является обычным негативным пятном для вирусов , нервов , полисахаридов и других биологических тканевых материалов. Он в основном используется в форме 0,5–2% pH, что делает его нейтральным, и в сочетании с водой образует водный раствор. Фосфорновольфрамовая кислота заполнена электронно-плотным веществом, которое окрашивает фон, окружающий образец, темным, а сам образец - светлым. Этот процесс не является нормальным положительным методом окрашивания, когда образец темный, а фон остается светлым.
Четырехокись осмия [ править ]
Четырехокись осмия используется в оптической микроскопии для окрашивания липидов . Он растворяется в жирах и восстанавливается органическими веществами до элементарного осмия, легко видимого черного вещества. Поскольку это тяжелый металл, который поглощает электроны, это, пожалуй, самый распространенный краситель, используемый для морфологии в биологической электронной микроскопии. Он также используется для окрашивания различных полимеров с целью изучения их морфологии с помощью ПЭМ. OsO
4очень летуч и чрезвычайно токсичен. Это сильный окислитель, так как осмий имеет степень окисления +8. Он агрессивно окисляет многие материалы, оставляя после себя отложения нелетучего осмия в более низкой степени окисления.
Четырехокись рутения [ править ]
Четырехокись рутения столь же летучая и даже более агрессивная, чем четырехокись осмия, и способна окрашивать даже материалы, устойчивые к пятнам осмия, например полиэтилен.
Другие химические вещества , используемые в электронной микроскопии окрашивании включают в себя: молибдат аммония , кадмий йодид , карбогидразид , хлорид трехвалентный железа , уротропин , индий трихлорид , нитрат лантана , ацетат свинца , цитрат свинца , свинец (II) , нитратом , периодические кислоты , фосфорна кислота , феррицианида калии , калий ферроцианида , рутений красный , нитрат серебра , серебра протеинат , chloroaurate натрия, нитрат таллия , тиосемикарбазид , уранилацетат , уранилнитрат и сульфат ванадила .
См. Также [ править ]
- Цитология : исследование клеток
- Гистология : исследование тканей
- Иммуногистохимия : использование антисыворотки для мечения специфических антигенов
- Трис (дисульфонат батофенантролина) рутения (II) , белковый краситель.
- Жизненно важное пятно : пятна, не убивающие клетки
- СТРАНИЦА : разделение белковых молекул
- Бариевая клизма - разновидность окрашивания in vivo, создающая контраст в рентгеновской части светового спектра.
- Диафонизация
Ссылки [ править ]
- ^ а б в г д Паркер Н. (2012). Микробиология . OpenStax.
- ^ a b Поммервиль JC (2017). Основы микробиологии . Я . Джонс и Бартлетт Обучение. стр. 248, 249. ISBN 978-1-284-10095-2.
- ^ Penney DP, Пауэрс JM, Франк М, Уиллис C, Churukian C (2002). «Анализ и тестирование биологических пятен - Процедура Комиссии по биологическим пятнам». Биотехника и гистохимия . 77 (5–6): 237–75. DOI : 10.1080 / 714028210 . PMID 12564600 .
- ^ а б Хоробин Р., Кирнан Дж., ред. (2002). Биологические пятна Конна: Справочник красителей, пятен и флуорохромов для использования в биологии и медицине . Тейлор и Фрэнсис. ISBN 978-1-85996-099-8.
- ^ "Список поставщиков - Комиссия по биологическим пятнам" . biostaincommission.org . Проверено 25 марта 2018 года .
- ^ Кларк G (1981). Процедуры окрашивания (4-е изд.). Балтимор: Уильямс и Уилкинс. п. 412. ISBN 978-0-683-01707-6.
- ^ Elementary Микробиология Vol - я .
- ^ Стоун, Ребекка Б.; Стил, Джон CH (2009-07-01). «Влияние сообщения результатов окрашивания по Граму от посевов крови на выбор противомикробных агентов» . Американский журнал клинической патологии . 132 (1): 5–6. DOI : 10.1309 / AJCP9RUV0YGLBVHA . ISSN 0002-9173 . PMID 19864226 .
- ↑ Schaeffer AB, Fulton MD (февраль 1933 г.). «Упрощенный метод окрашивания эндоспор». Наука . 77 (1990): 194. Bibcode : 1933Sci .... 77..194S . DOI : 10.1126 / science.77.1990.194 . PMID 17741261 .
- ^ a b c d e f Бэнкрофт Дж., Стивенс А., ред. (1982). Теория и практика гистологических методов (2-е изд.). Longman Group Limited.
- ^ a b Gill GW (2013). «Пятно Папаниколау». Цитопрепарат . Основы цитопатологии. 12 . С. 143–189. DOI : 10.1007 / 978-1-4614-4933-1_10 . ISBN 978-1-4614-4932-4. ISSN 1574-9053 .
- ^ Тхакур M, Guttikonda VR (2017). «Модифицированная сверхбыстрая методика окрашивания Папаниколау: сравнительное исследование» . Журнал цитологии . 34 (3): 149–153. DOI : 10,4103 / JOC.JOC_23_16 . PMC 5492752 . PMID 28701828 .
- ^ "Periodic Acid-Schiff (PAS): Диагностические приложения - LabCE.com, Лаборатория непрерывного образования" . labce.com . Проверено 16 апреля 2020 .
- ^ Безруков А.В. (2017-01-02). «Окраска по Романовскому, эффект Романовского и размышления о научном приоритете». Биотехника и гистохимия . 92 (1): 29–35. DOI : 10.1080 / 10520295.2016.1250285 . PMID 28098484 . S2CID 37401579 .
- ↑ Кори L (март 1986). «Лабораторная диагностика инфекций, вызванных вирусом простого герпеса. Принципы разработки быстрых диагностических тестов». Диагностическая микробиология и инфекционные болезни . 4 (3 доп.): 111С – 119С. DOI : 10.1016 / s0732-8893 (86) 80049-9 . PMID 3009082 .
- Перейти ↑ Wells J (1988). «Методика окрашивания поверхностных клеток вырванных волосяных фолликулов и других твердых тканей». Пятнистая технология . 63 (3).
- ^ Тома N, N Димитрова (2017). «Модифицированное окрашивание Бисмарком коричневым для демонстрации тучных клеток мягких тканей» (PDF) . Научный журнал Тракия . 15 (3): 195–197. DOI : 10.15547 / tjs.2017.03.001 .
- ^ Левенфус I (2011). Эффективный метод подсчета клеток, окрашенных DAPI, с использованием Фиджи . Мюнхен: Грин. ISBN 978-3-640-86284-9.
- ^ Sellors JW, Sankaranarayanan R (ред.). «Глава 4: Введение в кольпоскопию: показания к кольпоскопии, инструменты, принципы и документирование результатов». Кольпоскопия и лечение интраэпителиальной неоплазии шейки матки: пособие для начинающих . Всемирная организация здравоохранения. Архивировано из оригинала на 31 января 2019 года.
- ^ Прието D, G Апарисио, Morande PE, Zolessi FR (сентябрь 2014). «Быстрый, недорогой и высокоэффективный метод флуоресцентной маркировки ДНК с использованием метилового зеленого». Гистохимия и клеточная биология . 142 (3): 335–45. DOI : 10.1007 / s00418-014-1215-0 . PMID 24671497 . S2CID 11094194 .
- ^ Berlyn GP, Микше JP (1976). Ботаническая микротехника и цитохимия . Издательство государственного университета Айовы.
- ^ Baker JR (1958). Принципы биологической микротехники . стр. 329 и сл. Лондон: Метуэн.
- ^ Кирнан JA (2001). «Классификация и обозначение красителей, красителей и флюорохромов». Биотехника и гистохимия . 76 (5–6): 261–78. DOI : 10.1080 / bih.76.5-6.261.278 . PMID 11871748 . S2CID 32479873 .
- ^ thefreedictionary.com> Амфофильное цитирование: Большой ветеринарный словарь Сондерса , 3-е изд. 2007 Elsevier, Inc
- ^ "Негативное окрашивание | Центр исследования микроскопии" . cmrf.research.uiowa.edu . Проверено 16 апреля 2020 .
Дальнейшее чтение [ править ]
- Бэнкрофт Дж. Д., Гэмбл М., ред. (2002). Теория и практика гистологических методов (5-е изд.). Лондон: Черчилль-Ливингстон. ISBN 978-0-443-06435-7.
- Кирнан Дж. А. (2015). Гистологические и гистохимические методы. Теория и практика . Банбери, Великобритания: Scion. ISBN 978-1-907904-32-5.
- Преснелл Дж. К., Шрейбман депутат (1997). Методы животных тканей Хумасона (5-е изд.). Балтимор: Издательство Университета Джона Хопкинса.
- Рузин С.Е. (1999). Микротехника и микроскопия растений . Нью-Йорк: Издательство Оксфордского университета. ISBN 978-0-19-508956-1.
Внешние ссылки [ править ]
| Ресурсы библиотеки по окрашиванию |
|
 | Викискладе есть материалы, связанные с методами окрашивания при микроскопии . |
- Комиссия по биологическим пятнам - это независимая некоммерческая компания, которая тестирует красители с начала 1920-х годов и выдает Сертификаты одобрения на партии красителей, которые соответствуют международно признанным стандартам.
- StainsFile Справочник по красителям и методам окрашивания.
- Жизненно важное окрашивание простейших и соответствующие методы временного крепления ~ Howey, 2000
- Говоря о фиксации: часть 1 и часть 2 - М. Халит Умар
- Микрофотографии гистологических пятен
- Часто задаваемые вопросы по упражнениям по окрашиванию на домашней странице Шридхара Рао ПН
