Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Taptag simple.png

Тандемная аффинная очистка ( TAP ) - это метод очистки на основе иммунопреципитации для изучения межбелковых взаимодействий . Цель состоит в том, чтобы извлечь из клетки только интересующий белок в комплексе с любыми другими белками, с которыми он взаимодействует. TAP использует два типа гранул агарозы, которые связываются с представляющим интерес белком и которые могут быть отделены от клеточного лизата центрифугированием, не нарушая, не денатурируя или не загрязняя вовлеченные комплексы. Чтобы белок, представляющий интерес, мог связываться с гранулами, он помечается специальной частью, тегом TAP.

Оригинальный метод TAP включает слияние тега TAP с С-концом исследуемого белка. Тег TAP состоит из кальмодулинсвязывающего пептида (CBP) с N-конца, за которым следует сайт расщепления протеазой TEV и два домена белка A , которые прочно связываются с IgG (что делает тег TAP типом эпитопной метки).

Многие другие комбинации метки / гранул / элюента были предложены с тех пор, как принцип TAP был впервые опубликован.

Теги вариантов [ править ]

Этот тег также известен как C-терминальный TAP-тег, потому что также доступна N-терминальная версия. Однако описываемый метод предполагает использование тега C-терминала, хотя принцип, лежащий в основе метода, остается тем же.

История [ править ]

TAP-тегирование было изобретено группой исследователей, работающей в Европейской лаборатории молекулярной биологии в конце 1990-х (Rigaut et al., 1999, [1] Puig et al., 2001 [2] ), и предложено в качестве нового инструмента для исследования протеома. Команда использовала его для характеристики нескольких белковых комплексов (Rigaut et al., 1999, [1] Caspary et al. 1999, [3] Bouveret et al., 2000, [4] Puig et al., 2001 [2]).). Первое крупномасштабное применение этой техники было в 2002 году, когда исследовательская группа работала в сотрудничестве с учеными из протеомической компании Cellzome, чтобы разработать визуальную карту взаимодействия более 230 мультибелковых комплексов в дрожжевой клетке путем систематического исследования. тегирование TAP-тега к каждому белку. Первое успешное сообщение об использовании технологии TAP tag на растениях появилось в 2004 году (Rohila et al., 2004, [5] ).

Процесс [ править ]

Существует несколько методов, с помощью которых слитый белок можно ввести в клетки-хозяева. Если хозяином являются дрожжи , то одним из методов может быть использование плазмид , которые в конечном итоге будут транслировать гибридный белок внутри хозяина. Какой бы метод ни использовался, предпочтительно поддерживать экспрессию гибридного белка как можно ближе к его естественному уровню. Как только гибридный белок транслируется внутри хозяина, он будет взаимодействовать с другими белками, в идеале таким образом, чтобы на него не влияла метка TAP.

Впоследствии меченый белок (с его партнерами по связыванию) извлекается с использованием процесса отбора по аффинности .

Добавленные шарики первого типа покрыты иммуноглобулином G , который связывается с внешним концом метки TAP. Гранулы с представляющими интерес белками отделяются от лизата центрифугированием. Затем белки высвобождаются из гранул ферментом ( протеазой TEV ), который разрушает метку в центре расщепления TEV.

После этой первой стадии очистки к высвободившимся белкам добавляют второй тип гранул (покрытых кальмодулином ), которые обратимо связываются с оставшейся частью метки TAP, все еще находящейся на белках. Гранулы снова разделяют центрифугированием, в результате чего удаляются загрязнения, а также протеаза TEV. [2] Наконец, шарики высвобождаются с помощью EGTA , оставляя после себя нативный элюат, содержащий только интересующий белок, его связанные белки-партнеры и оставшуюся часть CBP тега TAP.

Затем нативный элюат можно проанализировать с помощью гель-электрофореза и масс-спектрометрии для идентификации партнеров по связыванию белка.

Преимущества [ править ]

Преимущество этого метода состоит в том, что можно реально определять белковые партнеры количественно in vivo без предварительного знания сложного состава. Он также прост в исполнении и часто обеспечивает высокую доходность. [2] Одним из препятствий при изучении взаимодействия белков с белками является загрязнение целевого белка, особенно когда у нас нет никаких предварительных сведений о нем. TAP предлагает эффективные и высокоспецифичные средства очистки целевого белка. После двух последовательных аффинных очисток вероятность удержания загрязняющих веществ в элюате значительно снижается.

Недостатки [ править ]

Однако существует также вероятность того, что метка, добавленная к белку, может скрыть связывание нового белка с его взаимодействующими партнерами. Кроме того, метка также может влиять на уровни экспрессии белка. С другой стороны, метка также может недостаточно подвергаться воздействию аффинных шариков, что исказит результаты.

Также может существовать возможность расщепления белков протеазой TEV , хотя это маловероятно, учитывая высокую специфичность протеазы TEV. [6]

Пригодность [ править ]

Поскольку этот метод включает по крайней мере 2 цикла отмывки, он может не подходить для скрининга переходных белковых взаимодействий , в отличие от дрожжевого двухгибридного метода или сшивания in vivo с фотореактивными аналогами аминокислот . Тем не менее, это хороший метод для тестирования стабильных белковых взаимодействий, который позволяет проводить различные исследования, контролируя, сколько раз очищается белковый комплекс. [ необходима цитата ]

Приложения [ править ]

В 2002 году тег TAP был впервые использован с масс-спектрометрией в крупномасштабном подходе для систематического анализа протеомики дрожжей путем характеристики мультибелковых комплексов. [7] В ходе исследования был выявлен 491 комплекс, из них 257 - совершенно новые. Остальные были знакомы по другим исследованиям, но теперь было обнаружено, что практически все они имеют новые компоненты. Они составили карту, связывающую все белковые компоненты функционально в сложной сети.

Многие другие протеомные анализы также включают использование тега TAP. Исследование EMBO (Dziembowski, 2004) выявило новый комплекс, необходимый для удержания и сплайсинга ядерной пре-мРНК. Они очистили новый тримерный комплекс, состоящий из 3 других субъединиц (Snu17p, Bud13p и Pml1p), и обнаружили, что эти субъединицы не важны для жизнеспособности, но необходимы для эффективного сплайсинга (удаления интронов) пре-мРНК. В 2006 году Fleischer et al. систематически идентифицированные белки, связанные с рибосомными комплексами эукариот. [8] Они использовали многогранный протеомный масс-спектрометрический скрининг для идентификации дрожжевых рибосомных комплексов, а затем использовали TAP-тегирование для функционального связывания всех этих белков.

Другие комбинации эпитоп-тег [ править ]

Принцип тандемно-аффинной очистки мультибелковых комплексов не ограничивается комбинацией меток CBP и Protein A, используемой в оригинальной работе Rigaut et al. (1999). Например, комбинация FLAG- и HA-тегов использовалась с 2000 года группой Накатани [9] [10] для очистки многочисленных белковых комплексов из клеток млекопитающих. После публикации принципа TAP было предложено множество других комбинаций тегов.

Ссылки [ править ]

  1. ^ a b Rigaut G, et al. (1999). «Общий метод очистки белка для характеристики белковых комплексов и исследования протеома». Природа Биотехнологии . 17 (10): 1030–1032. DOI : 10.1038 / 13732 . PMID  10504710 .
  2. ^ a b c d Puig, O .; и другие. (2001). «Метод тандемной аффинной очистки (TAP): общая процедура очистки белкового комплекса». Методы . 24 (3): 218–229. DOI : 10,1006 / meth.2001.1183 . PMID 11403571 . 
  3. ^ Caspary F, et al. (1999). «Частичная очистка дрожжевого U2 snRNP выявляет новый дрожжевой фактор сплайсинга пре-мРНК, необходимый для пре-сплайсосомной сборки» . Журнал EMBO . 18 (12): 3463–3474. DOI : 10.1093 / emboj / 18.12.3463 . PMC 1171425 . PMID 10369685 .  
  4. ^ Bouveret E, et al. (2000). «Sm-подобный белковый комплекс, который участвует в деградации мРНК» . Журнал EMBO . 19 (7): 1661–1671. DOI : 10.1093 / emboj / 19.7.1661 . PMC 310234 . PMID 10747033 .  
  5. ^ Рохила, Jai S .; Чен, Мэй; Черни, Рональд; Фромм, Майкл Э. (февраль 2004 г.). «Улучшенная тандемная аффинная метка очистки и методы выделения гетерокомплексов белков из растений» . Заводской журнал . 38 (1): 172–181. DOI : 10.1111 / j.1365-313X.2004.02031.x . PMID 15053770 . 
  6. ^ Догерти, WG, SM Cary и TD Parks (1989). «Молекулярно-генетический анализ сайта расщепления полипротеина вируса растений: модель». Вирусология . 171 (2): 356–364. DOI : 10.1016 / 0042-6822 (89) 90603-X . PMID 2669323 . CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  7. ^ Функциональная организация протеома дрожжей путем систематического анализа белковых комплексов , Gavin AC et al. Nature 415, 141-147 (10 января 2002 г.) | DOI : 10.1038 / 415141a ; Поступило 15 августа 2001 г .; Принята в печать 25 октября 2001 г.
  8. ^ Систематическая идентификация и функциональный скрининг неохарактеризованных белков, связанных с рибосомными комплексами эукариот , DOI: 10.1101 / gad.1422006, Genes Dev. 2006. 20: 1294-1307.
  9. ^ Икура Т. и др. «Участие гистонацетилазного комплекса TIP60 в репарации ДНК и апоптозе». Cell . 2000 102 (4): 463-73. [1]
  10. ^ Накатани Ю., Огрызко В. "Иммуноаффинная очистка белковых комплексов млекопитающих". Методы Энзимол . 2003; 370 : 430-44. [2]