Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Пример системы T-REx, контролирующей экспрессию shRNA

Активация транскрипции, контролируемая тетрациклином, представляет собой метод индуцируемой экспрессии генов, при котором транскрипция обратимо включается или выключается в присутствии антибиотика тетрациклина или одного из его производных (например, доксициклина ). [1]

Экспрессия гена, контролируемая тетрациклином, основана на механизме устойчивости к лечению тетрациклиновыми антибиотиками, обнаруженного у грамотрицательных бактерий . В природе промотор P tet экспрессирует TetR, репрессор , и TetA, белок, который выкачивает тетрациклиновый антибиотик из клетки. [2]

Разница между Tet-On и Tet-Off не в том, включает или выключает трансактиватор ген, как следует из названия; скорее, оба белка активируют экспрессию. Разница связана с их соответствующей реакцией на тетрациклин или доксициклин (Dox, более стабильный аналог тетрациклина); Tet-Off активирует экспрессию в отсутствие Dox, тогда как Tet-On активируется в присутствии Dox.

Тет-офф и Тет-он [ править ]

Две наиболее часто используемые индуцибельные системы экспрессии для исследования биологии эукариотических клеток называются Tet-Off и Tet-On. [3] Система ТЕТ-Off для контроля экспрессии генов , представляющего интереса в клетках млекопитающих была разработана профессорами Hermann Bujard и Манфред Госсен в Гейдельбергском университете и впервые опубликована в 1992 году [4]

Система Tet-Off использует тетрациклин трансактиватор (TTA) белок, который создается путем слияния один белка , TetR (репрессор тетрациклина), найденный в кишечных палочках бактерий, с доменом активации другого белка, VP16 , найденным в Герпеса Симплексный вирус . [5]

Полученный в результате белок tTA способен связываться с ДНК в определенных последовательностях оператора TetO . В большинстве систем Tet-Off несколько повторов таких последовательностей TetO размещаются выше минимального промотора, такого как промотор CMV . Совокупность нескольких последовательностей TetO с минимальным промотором называется элементом ответа на тетрациклин (TRE) , потому что он реагирует на связывание белка трансактиватора тетрациклина tTA повышенной экспрессией гена или генов ниже его промотора.

В системе Tet-Off экспрессия TRE-контролируемых генов может подавляться тетрациклином и его производными. Они связывают tTA и делают его неспособным связываться с последовательностями TRE, тем самым предотвращая трансактивацию TRE-контролируемых генов.

Система Tet-On работает аналогично, но наоборот. В то время как в системе Tet-Off, tTA способен связывать оператора, только если он не связан с тетрациклином или одним из его производных, таким как доксициклин, в системе Tet-On белок rtTA способен связывать оператора, только если он связан тетрациклином. Таким образом, введение доксициклина в систему инициирует транскрипцию генетического продукта. Систему Tet-On иногда предпочитают Tet-Off из-за ее более быстрого реагирования.

Системы экспрессии Tet-Off также используются для создания трансгенных мышей, которые условно экспрессируют интересующий ген.

Tet-On Advanced и Tet-On 3G [ править ]

Трансактиватор Tet-On Advanced (также известный как rtTA2 S -M2) представляет собой альтернативную версию Tet-On, которая демонстрирует пониженную базальную экспрессию и функционирует при концентрации Dox в 10 раз ниже, чем Tet-Off. Кроме того, его экспрессия считается более стабильной в эукариотических клетках из-за того, что он оптимизирован для кодонов человека и использует 3 минимальных домена активации транскрипции. Он был обнаружен в 2000 году как один из двух улучшенных мутантов Х. Бужардом и его коллегами после случайного мутагенеза части Tet Repressor гена трансактиватора. [6] Tet-On 3G (также известный как rtTA-V10 [7] ) похож на Tet-On Advanced, но является производным от rtTA2 S -S2, а не rtTA2 S.-M2. Он также оптимизирован по кодонам человека и состоит из 3 минимальных доменов активации VP16. Однако белок Tet-On 3G имеет 5 аминокислотных отличий по сравнению с Tet-On Advanced, что, по-видимому, еще больше увеличивает его чувствительность к Dox. Tet-On 3G чувствителен к 100 раз меньше Dox и в 7 раз более активен, чем оригинальный Tet-On. [8]

Другие системы [ править ]

Другие системы, такие как система T-REx от Life Technologies, работают иначе. [9] Представляющий интерес ген фланкирован вышестоящим промотором CMV и двумя сайтами TetO2. Экспрессия интересующего гена подавляется за счет высокого сродства связывания гомодимеров TetR с каждой последовательностью TetO2 в отсутствие тетрациклина. Введение тетрациклина приводит к связыванию одного тетрациклина с каждым гомодимером TetR с последующим высвобождением TetO2 гомодимерами TetR. Несвязывание гомодимеров TetR и TetO2 приводит к дерепрессии интересующего гена.

Модифицированная версия T-REx - это синтетическая биологическая схема Linearizer , оптимизированная для настройки экспрессии генов в эукариотических (почкующихся дрожжах, человеческих и т. Д.) Клетках. Путем включения сайтов TetO2 в промотор, управляющий экспрессией TetR, он создает отрицательную обратную связь , которая обеспечивает однородную экспрессию (низкий уровень шума) и линейную реакцию на дозу для аналогов тетрациклина. [10]

Элемент ответа на тетрациклин (TRE) [ править ]

В наиболее часто используемых плазмидах элемент ответа на тетрациклин состоит из 7 повторов бактериальной последовательности TetO длиной 19 п.о. (TCCCTATCAGTGATAGAGA), разделенных последовательностями спейсера (например: ACGATGTCGAGTTTAC). Именно TetO распознается и связывается частью TetR Tet-On или Tet-Off. TRE обычно размещается выше минимального промотора, который имеет очень низкую базальную экспрессию в отсутствие связанного Tet-Off (или Tet-On).

Преимущества и недостатки [ править ]

Система Tet имеет преимущества перед системами условной экспрессии генов Cre , FRT и ER (рецептор эстрогена). В системах Cre и FRT активация или нокаут гена необратимы после завершения рекомбинации, тогда как в системах Tet и ER это обратимо. Система Tet очень жестко контролирует экспрессию, тогда как система ER несколько негерметична. [11] Однако система Tet, которая зависит от транскрипции и последующей трансляции целевого гена, не так быстро действует, как ER-система, которая стабилизирует уже экспрессированный целевой белок при введении гормона. Кроме того, поскольку последовательность tet-o длиной 19 п.н. естественным образом отсутствует в клетках млекопитающих, плейотропиясчитается минимальным по сравнению с гормональными методами контроля. При использовании системы Tet в культуре клеток важно подтвердить, что каждая партия фетальной бычьей сыворотки тестируется, чтобы подтвердить, что контаминирующие тетрациклины отсутствуют или их содержание слишком мало, чтобы влиять на индуцибельность.

Механизм действия антибактериального эффекта тетрациклинов основан на нарушении трансляции белков в бактериях, тем самым нарушая способность микробов расти и восстанавливаться; однако трансляция белка также нарушается в митохондриях эукариот, что приводит к эффектам, которые могут искажать экспериментальные результаты. [12] [13]

См. Также [ править ]

  • Мышиные модели метастазов рака груди
  • Захват генов

Ссылки [ править ]

  1. ↑ Gossen M, Freundlieb S, Bender G, Müller G, Hillen W, Bujard H (июнь 1995 г.). «Активация транскрипции тетрациклинами в клетках млекопитающих». Наука . 268 (5218): 1766–9. Bibcode : 1995Sci ... 268.1766G . DOI : 10.1126 / science.7792603 . PMID  7792603 .
  2. ^ Орт Р, Schnappinger D, Hillen Вт, Saenger Вт, Хинрикс Вт (2000). «Структурные основы регуляции генов с помощью тетрациклин-индуцибельной системы репрессор-оператор Tet» (PDF) . Структурная и молекулярная биология природы . 7 (3): 215–219. DOI : 10.1038 / 73324 . PMID 10700280 . S2CID 19973826 .   
  3. ^ Tet-On и Tet-Off являются зарегистрированными товарными знаками Clontech Laboratories, Inc. в США.
  4. ^ Госсен M, Bujard H (июнь 1992). «Жесткий контроль экспрессии генов в клетках млекопитающих с помощью промоторов, чувствительных к тетрациклину» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 89 (12): 5547–51. Bibcode : 1992PNAS ... 89.5547G . DOI : 10.1073 / pnas.89.12.5547 . PMC 49329 . PMID 1319065 .  
  5. ^ Allen ND, Плагге A, G Kelsey (2000). «Направленный мутагенез в эмбриональных стволовых клетках». В Jackson IJ, Abbott CM (ред.). Генетика и трансгеника мышей: практический подход . Издательство Оксфордского университета. С. 259–263. ISBN 978-0-19-963708-9.
  6. ^ Urlinger S, барон U, Thellmann М, Hasan МТ, Bujard Н, Hillen Вт (июль 2000 г.). «Изучение пространства последовательностей для тетрациклин-зависимых активаторов транскрипции: новые мутации дают расширенный диапазон и чувствительность» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 97 (14): 7963–8. Bibcode : 2000PNAS ... 97.7963U . DOI : 10.1073 / pnas.130192197 . PMC 16653 . PMID 10859354 .  
  7. ^ Das AT, Тененбаум L, Berkhout B (июнь 2016). «Системы Tet-On для экспрессии гена, индуцируемого доксициклином» . Современная генная терапия . 16 (3): 156–67. DOI : 10.2174 / 1566523216666160524144041 . PMC 5070417 . PMID 27216914 .  
  8. ^ Чжоу X, Винк M, Klaver B, Berkhout B, Das AT (октябрь 2006). «Оптимизация системы Tet-On для регулируемой экспрессии генов посредством вирусной эволюции» . Gene Ther . 13 (19): 1382–90. DOI : 10.1038 / sj.gt.3302780 . PMID 16724096 . 
  9. ^ "Система T-REx" . ThermoFisher Scientific .
  10. ^ Nevozhay D, Адамс Р., Мерфи KF, Josic K, Balázsi G (31 марта 2009). «Отрицательная ауторегуляция линеаризует реакцию на дозу и подавляет неоднородность экспрессии генов» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 106 (13): 5123–8. Bibcode : 2009PNAS..106.5123N . DOI : 10.1073 / pnas.0809901106 . PMC 2654390 . PMID 19279212 .  
  11. ^ Sohal DS, Нгьем M, Crackower М.А., Witt С.А., Кимбалл TR, Tymitz К.М., Пеннингер JM, Molkentin JD (июль 2001). «Временно регулируемые и тканеспецифичные генные манипуляции во взрослом и эмбриональном сердце с использованием индуцируемого тамоксифеном белка Cre» . Circ. Res . 89 (1): 20–25. DOI : 10.1161 / hh1301.092687 . PMID 11440973 . 
  12. ^ Moullan N, Mouchiroud л, Ван Х, Рю D, Williams Е.Г., Mottis А, Jovaisaite В, Frochaux М.В., Quiros П.М., Deplancke В, Houtkooper RH, Auwerx J (март 2015). «Тетрациклины нарушают функцию митохондрий в моделях эукариот: призыв к осторожности в биомедицинских исследованиях» . Cell Rep . 10 (10): 1681–1691. DOI : 10.1016 / j.celrep.2015.02.034 . PMC 4565776 . PMID 25772356 .  
  13. ^ Chatzispyrou И.А., Held Н.М., Mouchiroud л, Auwerx Дж, Houtkooper RH (ноябрь 2015 г.). «Тетрациклиновые антибиотики нарушают функцию митохондрий, и их экспериментальное использование затрудняет исследования» . Cancer Res . 75 (21): 4446–9. DOI : 10.1158 / 0008-5472.CAN-15-1626 . PMC 4631686 . PMID 26475870 .  

Внешние ссылки [ править ]

  • Лаборатория Германа Бухарда, ZMBH, Гейдельберг, Германия
  • Расширенная анимация Tet-On на YouTube
  • Подробный обзор Tet-систем в функциональных исследованиях рака и онкогеномике