Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Не следует путать с микроскопией изображений второй гармоники .
Микроскопия двухфотонного возбуждения кишечника мыши . Красный: актин . Зеленый: ядра клеток . Синий: слизь бокаловидных клеток . Получено на длине волны 780 нм с использованием титан-сапфирового лазера .

Микроскопия с двухфотонным возбуждением ( TPEF или 2PEF ) - это метод флуоресцентной визуализации, который позволяет получать изображения живой ткани толщиной до одного миллиметра. В отличие от традиционной флуоресцентной микроскопии , в которой длина волны возбуждения короче длины волны излучения, двухфотонное возбуждение требует одновременного возбуждения двумя фотонами с большей длиной волны, чем излучаемый свет. В микроскопии с двухфотонным возбуждением обычно используется возбуждающий свет в ближней инфракрасной области (NIR), который также может возбуждать флуоресцентные красители.. Однако при каждом возбуждении поглощаются два фотона БИК-света. Использование инфракрасного света сводит к минимуму рассеяние в тканях. Из-за многофотонного поглощения фоновый сигнал сильно подавляется. Оба эффекта приводят к увеличению глубины проникновения для этой техники. Двухфотонное возбуждение может быть превосходной альтернативой конфокальной микроскопии из-за более глубокого проникновения в ткани, эффективного обнаружения света и уменьшения фотообесцвечивания . [1] [2]

Двухфотонное флуоресцентное изображение (зеленое) поперечного сечения корневища, окрашенного ландышом . Волнение происходит на 840 нм, а красный и синий цвета представляют другие каналы многофотонной техники, которые были наложены друг на друга.

Концепция [ править ]

Схематическое изображение уровней энергии (диаграммы Яблонского) процесса флуоресценции на примере флуоресцентного красителя, излучающего свет с длиной волны 460 нм. Один (фиолетовый, 1PEF), два (светло-красный, 2PEF) или три (темно-красный, 3PEF) фотона поглощаются, чтобы испустить фотон флуоресценции (бирюзовый).
Оптический отклик от точечного источника. Слева направо: рассчитанные распределения интенсивности xy (вверху) и rz (внизу) с логарифмической шкалой для точечного источника, полученного с помощью широкого поля (a), 2PEF (b) и конфокальной микроскопии (c). 2PEF и конфокальные формы имеют лучшее отношение сигнал / шум, чем широкое поле. Распределение 2PEF больше из-за того, что за распределение интенсивности отвечает длина волны в два раза больше, чем в случае широкого или конфокального поля. Эти распределения интенсивности также известны как функции рассеяния точки. Оптические условия: длины волн возбуждения 488 нм и 900 нм соответственно для 1PEF и 2PEF; длина волны излучения 520 нм; числовая апертура составляет 1,3 с целью погружения масла .

В двухфотонном возбуждении используется двухфотонное поглощение - концепция, впервые описанная Марией Гёпперт Майер (1906–1972) в ее докторской диссертации в 1931 году [3] и впервые обнаруженная в 1961 году в кристалле CaF 2 : Eu 2+ с использованием лазерного возбуждения. пользователя Wolfgang Kaiser . [4] Исаак Абелла показал в 1962 году в парах цезия, что возможно двухфотонное возбуждение отдельных атомов. [5]

Флуоресцентная микроскопия с двухфотонным возбуждением имеет сходство с другими методами конфокальной лазерной микроскопии, такими как лазерная сканирующая конфокальная микроскопия и рамановская микроскопия . Эти методы используют сфокусированные лазерные лучи, сканированные в растровом шаблоне, для создания изображений, и оба имеют эффект оптического разделения . В отличие от конфокальных микроскопов, многофотонные микроскопы не имеют отверстий-точечных отверстий, которые придают конфокальным микроскопам качество оптического сечения. Оптические срезы, полученные с помощью многофотонных микроскопов, являются результатом функции рассеяния точкивозбуждения: функция многофотонного рассеяния точки обычно имеет форму гантели (длиннее в плоскости xy) по сравнению с функцией рассеяния точки в форме вертикального шара для регби конфокальных микроскопов. Концепция двухфотонного возбуждения основана на идее, что два фотона со сравнительно меньшей энергией фотона, чем требуется для возбуждения одного фотона, также могут возбудить флуорофор в одном квантовом событии. Каждый фотон несет примерно половину энергии, необходимой для возбуждения молекулы. Возбуждение приводит к последующему излучению фотона флуоресценции с тем же квантовым выходомэто было бы результатом обычного однофотонного поглощения. Испускаемый фотон обычно имеет более высокую энергию (более короткую длину волны), чем любой из двух возбуждающих фотонов. Вероятность почти одновременного поглощения двух фотонов чрезвычайно мала. Поэтому обычно требуется высокий пиковый поток возбуждающих фотонов, обычно генерируемый фемтосекундным импульсным лазером . Целью использования двухфотонного эффекта является то, что осевой разброс функции рассеяния точки существенно меньше, чем при однофотонном возбуждении. В результате увеличивается размер по оси z, что позволяет вырезать тонкие оптические секции. Кроме того, во многих интересных случаях форма пятна и его размер могут быть изменены для достижения конкретных желаемых целей. [6] Лазеры возбуждения с более длинной длиной волны и меньшей энергией (обычно инфракрасные) в многофотонных микроскопах хорошо подходят для визуализации живых клеток, поскольку они наносят меньший ущерб, чем коротковолновые лазеры, обычно используемые для однофотонного возбуждения, поэтому клетки можно наблюдать на предмет обнаружения живых клеток. более длительные периоды с меньшим количеством токсических эффектов.

Наиболее часто используемые флуорофоры имеют спектры возбуждения в диапазоне 400–500 нм, тогда как лазер, используемый для возбуждения двухфотонной флуоресценции, находится в диапазоне ~ 700–1000 нм (инфракрасный), создаваемый титан-сапфировыми лазерами.. Если флуорофор поглощает два инфракрасных фотона одновременно, он будет поглощать достаточно энергии, чтобы перейти в возбужденное состояние. Затем флуорофор излучает одиночный фотон с длиной волны, которая зависит от типа используемого флуорофора (обычно в видимом спектре). Поскольку два фотона поглощаются во время возбуждения флуорофора, вероятность флуоресцентного излучения флуорофоров увеличивается квадратично с интенсивностью возбуждения. Следовательно, гораздо больше двухфотонной флуоресценции генерируется там, где лазерный луч сильно сфокусирован, чем там, где он более рассеян. Фактически возбуждение ограничено крошечным фокусным объемом (~ 1 фемтолитр), что приводит к высокой степени отклонения объектов, находящихся вне фокуса. Такая локализация возбуждения является ключевым преимуществом по сравнению смикроскопы с однофотонным возбуждением, в которых необходимо использовать такие элементы, как точечные отверстия, для подавления расфокусированной флуоресценции. Затем флуоресценция образца улавливается высокочувствительным детектором, например фотоумножителем . Эта наблюдаемая интенсивность света становится одним пикселем в конечном изображении; фокусная точка сканируется по всей желаемой области образца, чтобы сформировать все пиксели изображения.

Развитие [ править ]

Схема двухфотонного микроскопа.

Двухфотонная микроскопия была впервые и запатентовала по Винфриду Денку и Джеймс Стриклер в лаборатории Уатт У. Уэбба в Корнельском университете в 1990 году они объединили идею ДФПА с использованием лазерного сканера. [7] [8] В микроскопии с двухфотонным возбуждением инфракрасный лазерный луч фокусируется через линзу объектива. Ti-сапфировый лазер обычно используется имеет ширину импульса приблизительно 100 фемтосекунд (Fs) и частота повторения около 80 МГц, что позволяет с высокой плотностью фотонов и потоком , требующийся для поглощения двух фотонов и является перестраиваемым в широком диапазоне длин волн. Yb-легированный с синхронизацией модВолоконные лазеры с импульсами 325 фс также использовались для визуализации коллагена, демонстрируя глубину проникновения в коллаген более 320 мкм, что значительно превосходит глубины от 250 до 300 мкм, достижимые при подключении к обычному лазеру возбуждения на сапфировом титане.

Дополнительные преимущества дает использование инфракрасного света для возбуждения флуорофоров в светорассеивающей ткани. [9] Более длинные волны рассеиваются в меньшей степени, чем более короткие, что является преимуществом для получения изображений с высоким разрешением. Кроме того, эти фотоны с более низкой энергией с меньшей вероятностью вызовут повреждение за пределами фокального объема. По сравнению с конфокальным микроскопом обнаружение фотонов намного более эффективно, поскольку даже рассеянные фотоны вносят свой вклад в полезный сигнал. Эти преимущества для получения изображений в рассеивающих тканях были признаны только через несколько лет после изобретения микроскопии с двухфотонным возбуждением. [10]

Есть несколько предостережений при использовании двухфотонной микроскопии: импульсные лазеры, необходимые для двухфотонного возбуждения, намного дороже, чем лазеры непрерывного действия (CW), используемые в конфокальной микроскопии. Спектр двухфотонного поглощения молекулы может значительно отличаться от его однофотонного аналога. Для очень тонких объектов, таких как изолированные клетки, однофотонные (конфокальные) микроскопы могут создавать изображения с более высоким оптическим разрешением из-за более коротких длин волн возбуждения. С другой стороны, в случае рассеивающей ткани превосходные возможности двухфотонного микроскопа для оптического сечения и обнаружения света приводят к лучшим характеристикам.

Приложения [ править ]

Главная [ править ]

Двухфотонная микроскопия используется во многих областях, включая физиологию, нейробиологию, эмбриологию и тканевую инженерию. Благодаря этой технике даже тонкие, почти прозрачные ткани (например, клетки кожи) визуализируются с четкими деталями. [11] Возможности высокоскоростной визуализации двухфотонной микроскопии также могут быть использованы в неинвазивной оптической биопсии. [12] В клеточной биологии двухфотонная микроскопия удачно использовалась для получения локализованных химических реакций. [ требуется пояснение ] [10] Используя двухфотонную флуоресценцию и микроскопию на основе генерации второй гармоники , было показано, что молекулы органического порфиринового типа могут иметь разныедипольные моменты перехода для двухфотонной флуоресценции и генерации второй гармоники [13], которые иначе считаются происходящими из одного и того же дипольного момента перехода. [14] Было показано, что невырожденное двухфотонное возбуждение или использование двух фотонов с разными длинами волн увеличивает флуоресценцию всех протестированных малых молекул и флуоресцентных белков. [15]

Исследования рака [ править ]

2PEF также оказался очень ценным для характеристики рака кожи. [16] Также было показано, что он выявляет остановку опухолевых клеток, взаимодействие опухолевых клеток с тромбоцитами, взаимодействие опухолевых клеток и лейкоцитов и процессы метастатической колонизации. [17]

Неврология [ править ]

2PEF и 3PEF используются для характеристики интактных нервных тканей. [18]

Визуализация мозга in vivo [ править ]

Многофотонная флуоресценция (2PEF и 3PEF) - полезный способ визуализации мозга in vivo. [19]

Возбуждение высшего порядка [ править ]

Также возможно одновременное поглощение трех или более фотонов, что позволяет использовать микроскопию с более мощным многофотонным возбуждением. [20] Так называемая «трехфотонная флуоресцентная микроскопия» (3PEF) является наиболее часто используемым методом после 2PEF, к которому он дополняет.

Основная статья: Трехфотонная микроскопия

Красители и флуоресцентные белки для микроскопии с двухфотонным возбуждением [ править ]

В общем, все обычно используемые флуоресцентные белки (CFP, GFP, YFP, RFP) и красители можно возбуждать в двухфотонном режиме. Спектры двухфотонного возбуждения часто значительно шире, что затрудняет избирательное возбуждение флуорофоров путем переключения длин волн возбуждения. Существует несколько онлайн-баз данных двухфотонных спектров, доступных в Корнельском университете [1] и в Национальном институте химической физики и биофизики в Эстонии. [21]

Сообщалось о нескольких красителях, излучающих зеленый, красный и БИК (зонды и реактивные метки) с чрезвычайно высокими сечениями двухфотонного поглощения. [22] Из-за структуры типа донор-акцептор-донор сквараиновые красители, такие как Seta-670 , Seta-700 и Seta-660, демонстрируют очень высокую эффективность 2-фотонного поглощения (2PA) по сравнению с другими красителями, [22] [ 23] [24] SeTau-647 и SeTau-665 , новый тип скварин- ротаксана , демонстрируют чрезвычайно высокое сечение двухфотонного действия до 10 000 Гм в ближней ИК-области, непревзойденное для любого другого класса органических красителей. . [22]

См. Также [ править ]

  • 3D оптическое хранилище данных
  • Нелинейная оптика
  • Широкопольная многофотонная микроскопия
  • Двухфотонное поглощение
  • Трехфотонная микроскопия
  • Визуализирующая микроскопия второй гармоники

Источники [ править ]

  • Шмитт, Майкл; Майерхёфер, Томас; Попп, Юрген; Клеппе, Инго; Вайсхарт, Клаус (2013). «Взаимодействие света и материи». Справочник по биофотонике . DOI : 10.1002 / 9783527643981.bphot003 . ISBN 9783527643981.
  • Кениг, Карстен (2018). Многофотонная микроскопия и визуализация флуоресценции в течение жизни - приложения в биологии и медицине . Де Грюйтер. ISBN 978-3-11-042998-5.
  • Кейхосрави, Адиб; Bredfeldt, Jeremy S .; Сагар, Абдул Кадер; Элисейри, Кевин В. (2014). «Визуализация рака поколения второй гармоники». Количественная визуализация в клеточной биологии . Методы клеточной биологии. 123 . С. 531–546. DOI : 10.1016 / B978-0-12-420138-5.00028-8 . ISBN 9780124201385. PMID  24974046 .
  • Ханри Ю; Нур Аида Абдул Рахим (2020). Визуализация в клеточной и тканевой инженерии, 1-е издание . CRC Тейлор и Фрэнсис. ISBN 9780367445867.

Ссылки [ править ]

  1. ^ Денк W .; Стриклер Дж .; Уэбб В. (1990). «Двухфотонная лазерная сканирующая флуоресцентная микроскопия» . Наука . 248 (4951): 73–6. Bibcode : 1990Sci ... 248 ... 73D . DOI : 10.1126 / science.2321027 . PMID 2321027 . S2CID 18431535 .  
  2. ^ Хуан Карлос Стокерт, Альфонсо Бласкес-Кастро (2017). «Глава 19 Нелинейная оптика» . Флуоресцентная микроскопия в науках о жизни . Издательство Bentham Science. С. 642–686. ISBN 978-1-68108-519-7. Проверено 24 декабря 2017 года .
  3. ^ Гепперт-Майер М. (1931). "Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen" . Летопись физики . 9 (3): 273–95. Bibcode : 1931AnP ... 401..273G . DOI : 10.1002 / andp.19314010303 .
  4. ^ Kaiser, W .; Гаррет, К. (сентябрь 1961 г.). «Двухфотонное возбуждение в CaF 2 : Eu 2+ ». Письма с физическим обзором . 7 (6): 229–231. Bibcode : 1961PhRvL ... 7..229K . DOI : 10.1103 / PhysRevLett.7.229 .
  5. ^ Abella, ID (декабрь 1962 г.). «Оптическое двухфотонное поглощение в парах цезия». Письма с физическим обзором . 9 (11): 453–455. Полномочный код : 1962PhRvL ... 9..453A . DOI : 10.1103 / PhysRevLett.9.453 .
  6. ^ Каминер, Идо; Немировский Джонатан; Сегев Мордехай (2013). «Оптимизация 3D многофотонной флуоресцентной микроскопии». Письма об оптике . 38 (19): 3945–3948. Bibcode : 2013OptL ... 38.3945K . DOI : 10.1364 / OL.38.003945 . PMID 24081095 . 
  7. ^ Денк W .; Стриклер JH; Уэбб WW (1990). «Двухфотонная лазерная сканирующая флуоресцентная микроскопия» . Наука . 248 (4951): 73–76. Bibcode : 1990Sci ... 248 ... 73D . DOI : 10.1126 / science.2321027 . PMID 2321027 . S2CID 18431535 .  
  8. ^ США 5034613  «Двухфотонное лазерная микроскопия.»
  9. ^ Helmchen F .; Денк В. (2005). «Двухфотонная микроскопия глубоких тканей». Нат методы . 2 (12): 932–40. DOI : 10.1038 / nmeth818 . PMID 16299478 . S2CID 3339971 .  
  10. ^ a b Denk W .; Делани К. (1994). «Анатомическая и функциональная визуализация нейронов с использованием 2-фотонной лазерной сканирующей микроскопии». J Neurosci Methods . 54 (2): 151–62. DOI : 10.1016 / 0165-0270 (94) 90189-9 . PMID 7869748 . S2CID 3772937 .  
  11. ^ Мастерс BR .; Итак, PTC; Граттон Э. (1997). «Флуоресцентная микроскопия с многофотонным возбуждением и спектроскопия кожи человека in vivo» . Биофизический журнал . 72 (6): 2405–2412. Bibcode : 1997BpJ .... 72.2405M . DOI : 10.1016 / s0006-3495 (97) 78886-6 . PMC 1184440 . PMID 9168018 .  
  12. ^ Bewersdorf J, Rainer P, Ад SW (1998). «Многофокальная многофотонная микроскопия» . Письма об оптике . 23 (9): 665–667. Bibcode : 1998OptL ... 23..655B . DOI : 10.1364 / ol.23.000655 . PMID 18087301 . S2CID 17549598 .  
  13. ^ Khadria А, Coene Y, Gawel Р, Рош С, Глины К, Андерсон HL (2017). «Двухтактные пирофеофорбиды для нелинейно-оптической визуализации» . Органическая и биомолекулярная химия . 15 (4): 947–956. DOI : 10.1039 / C6OB02319C . PMID 28054076 . 
  14. ^ Рив JE, Corbett AD, Boczarow I, Wilson T, H Бэйли, Anderson HL (2012). «Исследование ориентационного распределения красителей в мембранах с помощью многофотонной микроскопии» . Биофизический журнал . 103 (5): 907–917. Bibcode : 2012BpJ ... 103..907R . DOI : 10.1016 / j.bpj.2012.08.003 . PMC 3433607 . PMID 23009840 .  
  15. ^ Sadegh, Sanaz; Ян, Му-Хан; Ферри, Кристофер Г.Л.; Тунеманн, Мартин; Saisan, Payam A .; Вэй, Чжэ; Родригес, Эрик А .; Адамс, Стивен Р .; Килич, Кивильчим; Боас, Дэвид А .; Сакаджич, Сава; Девор, Анна; Файнман, Йешайаху (18 сентября 2019 г.). «Эффективное невырожденное двухфотонное возбуждение для флуоресцентной микроскопии» . Оптика Экспресс . 27 (20): 28022–28035. Bibcode : 2019OExpr..2728022S . DOI : 10,1364 / OE.27.028022 . PMC 6825618 . PMID 31684560 .  
  16. ^ Паоли, Джон; Смед, Мария; Эриксон, Марика Б. (сентябрь 2009 г.). «Многофотонная лазерная сканирующая микроскопия - новый метод диагностики поверхностного рака кожи». Семинары по кожной медицине и хирургии . 28 (3): 190–195. DOI : 10.1016 / j.sder.2009.06.007 . PMID 19782943 . 
  17. ^ Танака, Кодзи; Тояма, Юдзи; Окугава, Ёсинага; Окигами, Масато; Иноуэ, Ясухиро; Учида, Кейчи; Араки, Тошимицу; Мохри, Ясухико; Мидзогути, Акира; Кусуноки, Масато (15 мая 2014 г.). «In vivo оптическая визуализация метастазов рака с использованием многофотонной микроскопии: краткий обзор» . Американский журнал трансляционных исследований . 6 (3): 179–187. PMC 4058302 . PMID 24936213 .  
  18. ^ Свобода, Карел; Ясуда, Рёхей (июнь 2006 г.). "Принципы микроскопии двухфотонного возбуждения и ее применения в неврологии". Нейрон . 50 (6): 823–839. DOI : 10.1016 / j.neuron.2006.05.019 . PMID 16772166 . S2CID 7278880 .  
  19. ^ Хортон, Николас G .; Ван, Кэ; Кобат, Демирхан; Кларк, Кэтрин Дж .; Мудрый, Фрэнк У .; Шаффер, Крис Б.; Сюй, Крис (2013). «Трехфотонная микроскопия in vivo подкорковых структур интактного мозга мыши» . Природа Фотоника . 7 (3): 205–209. Bibcode : 2013NaPho ... 7..205H . DOI : 10.1038 / nphoton.2012.336 . ISSN 1749-4885 . PMC 3864872 . PMID 24353743 .   
  20. ^ Сюй, С; Зипфель, Вт; Ножницы, JB; Уильямс, РМ; Уэбб, WW (1 октября 1996 г.). «Возбуждение многофотонной флуоресценции: новые спектральные окна для биологической нелинейной микроскопии» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 93 (20): 10763–10768. Bibcode : 1996PNAS ... 9310763X . DOI : 10.1073 / pnas.93.20.10763 . PMC 38229 . PMID 8855254 .  
  21. ^ "Спектры поглощения двух фотонов | KBFI KBFI" . KBFI . Проверено 3 сентября 2020 .
  22. ^ a b c Подгорский К .; Терпечниг Э .; Клочко О.П .; Обухова О.М.; Хаас К. (2012). «Сверхъяркие и стабильные квадратные флуорофоры красного и ближнего инфракрасного диапазона для двухфотонной визуализации in vivo» . PLOS ONE . 7 (12): e51980. Bibcode : 2012PLoSO ... 751980P . DOI : 10.1371 / journal.pone.0051980 . PMC 3522634 . PMID 23251670 .  
  23. ^ Лю, Линчжи; Шао, Мэй; Дун, Сяоху; Юй Сюэфэн; Лю, Чжихун; Он, Жике; Ван Цюйцюань (15 октября 2008 г.). «Гомогенный иммуноанализ на основе двухфотонного возбуждения флуоресцентного резонансного переноса энергии». Аналитическая химия . 80 (20): 7735–7741. DOI : 10.1021 / ac801106w . PMID 18800850 . 
  24. ^ Пржонская, Ольга В .; Вебстер, Скотт; Padilha, Lazaro A .; Ху, Хунхуа; Качковский, Алексей Д .; Хаган, Дэвид Дж .; Ван Страйланд, Эрик В. (2010). «Двухфотонное поглощение в сопряженных молекулах в ближнем ИК-диапазоне: стратегия проектирования и взаимосвязи между структурой и свойством». Advanced Флуоресцентные Репортеры в химии и биологии I . Серия Спрингера по флуоресценции. 8 . С. 105–147. DOI : 10.1007 / 978-3-642-04702-2_4 . ISBN 978-3-642-04700-8.

Внешние ссылки [ править ]

  • Двухфотонные подходящие красители
  • введение в многофотонную микроскопию
  • Получение нескольких изображений в реальном времени для лазерной сканирующей микроскопии (статья Сандерсона о микроскопии)
  • Создайте свой собственный видео-скоростной 2-фотонный микроскоп
  • Двухфотонная флуоресцентная световая микроскопия, ЭНЦИКЛОПЕДИЯ ЖИЗНЕННЫХ НАУК
  • «Многофотонная флуоресцентная микроскопия» . Праймер для микроскопии . Государственный университет Флориды . Проверено 3 марта 2018 .
  • Флуоресцентная микроскопия с многофотонным возбуждением. Университет Висконсина.
  • Основы и приложения в микроскопии многофотонного возбуждения . Nikon MicroscopyU.