Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Универсальность полимеразной цепной реакции (ПЦР) привела к появлению большого количества вариантов ПЦР .

Основные модификации [ править ]

Часто для достижения желаемой цели требуется внести лишь небольшие изменения в стандартный протокол ПЦР:

Мультиплексная ПЦР использует несколько пар праймеров, отжигаемых с различными целевыми последовательностями. Это позволяет одновременно анализировать несколько мишеней в одном образце. Например, при тестировании на генетические мутации можно комбинировать шесть или более амплификаций. В стандартном протоколе для снятия отпечатков пальцев исследуемые мишени часто амплифицируются группами по 3 или 4. Мультиплексная лигирование-зависимая амплификация зонда (или MLPA ) позволяет амплифицировать несколько мишеней с использованием только одной пары праймеров, избегая ограничений разрешения мультиплексная ПЦР. Мультиплексная ПЦР также использовалась для анализа микросателлитов и SNP . [1]

Вариации длины VNTR у 6 человек.

ПЦР с переменным числом тандемных повторов (VNTR) нацелена на области генома, которые демонстрируют вариацию длины . Анализ генотипов образца обычно включает определение размеров продуктов амплификации с помощью гель-электрофореза . Анализ более мелких сегментов VNTR, известных как короткие тандемные повторы (или STR), является основой для баз данных ДНК-отпечатков пальцев, таких как CODIS .

Асимметричная ПЦР предпочтительно усиливает одну цепь целевой ДНК. Он используется в некоторых методах секвенирования и гибридизационного зондирования для создания одной цепи ДНК в качестве продукта. Термоциклирование проводят так же, как в ПЦР, но с ограниченным количеством или без одного из праймеров. Когда ограничивающий праймер истощается, репликация увеличивается арифметически за счет удлинения избыточного праймера. [2] Модификация этого процесса, названная L inear- A fter- T he- E xponential-PCR (или LATE-PCR ), использует ограничивающий праймер с более высокой температурой плавления (T m), чем избыток праймера, чтобы поддерживать эффективность реакции, поскольку предельная концентрация праймера уменьшается в середине реакции. [3] (См. Также ПЦР с перекрытием и расширением ).

Некоторые модификации необходимы для проведения длинной ПЦР . Исходный процесс ПЦР на основе Кленова не давал продуктов размером более 400 пар оснований. Однако полимераза Taq может амплифицировать мишени длиной до нескольких тысяч п.н. [4] С тех пор модифицированные протоколы с ферментом Taq позволили амплифицировать мишени размером более 50 т.п.н. [5]

Вложенная ПЦР

Вложенная ПЦР используется для повышения специфичности амплификации ДНК. Два набора праймеров используются в двух последовательных реакциях. В первой ПЦР одна пара праймеров используется для создания продуктов ДНК, которые могут содержать продукты, амплифицированные из нецелевых областей. Продукты первой ПЦР затем используются в качестве матрицы во второй ПЦР с использованием одного («полугнездо») или двух разных праймеров, сайты связывания которых расположены (вложены) в пределах первого набора, что увеличивает специфичность. Вложенная ПЦР часто более успешна для специфической амплификации продуктов длинной ДНК, чем обычная ПЦР, но требует более детального знания последовательности мишени.

Количественная ПЦР используется для измерения определенного количества целевой ДНК (или РНК) в образце. Измеряя усиление только в фазе истинного экспоненциального увеличения, количество измеряемого продукта более точно отражает исходное количество цели. Используются специальные термоциклеры, контролирующие количество продукта во время амплификации. В методах количественной ПЦР в реальном времени (QRT-PCR) используются флуоресцентные красители, такие как Sybr Green, или флуорофорсодержащие ДНК-зонды, такие как TaqMan , для измерения количества амплифицированного продукта по мере продвижения амплификации.

См. Также: Димер праймера § ПЦР с горячим стартом

ПЦР с горячим стартом - это метод, выполняемый вручную путем нагревания компонентов реакции до температуры плавления ДНК (например, 95 ° C) перед добавлением полимеразы. Таким образом предотвращается неспецифическое усиление при более низких температурах. [6] В качестве альтернативы, специализированные реагенты ингибируют активность полимеразы при температуре окружающей среды либо за счет связывания антитела , либо за счет присутствия ковалентно связанных ингибиторов, которые диссоциируют только после стадии высокотемпературной активации. «ПЦР с горячим стартом / холодным окончанием» достигается с помощью новых гибридных полимераз, которые неактивны при температуре окружающей среды и активируются только при повышенных температурах.

В « Touchdown PCR» температура отжига постепенно снижается в более поздних циклах. Температура отжига в ранних циклах обычно на 3–5 ° C выше стандартной T m используемых праймеров, в то время как в более поздних циклах она на столько же ниже T m . Первоначальная более высокая температура отжига приводит к большей специфичности связывания праймера, в то время как более низкие температуры позволяют более эффективную амплификацию в конце реакции. [7]

Сборочная ПЦР (также известная как Циклическая сборка полимеразы или PCA ) - это синтез длинных структур ДНК путем выполнения ПЦР на пуле длинных олигонуклеотидов с короткими перекрывающимися сегментами, чтобы собрать два или более фрагмента ДНК в один фрагмент. Он включает в себя начальную ПЦР с перекрывающимися праймерами и вторую ПЦР с использованием продуктов в качестве матрицы, которая генерирует конечный полноразмерный продукт. Этот метод может заменитьсборкунаоснове лигирования . [8]

В ПЦР колоний бактериальные колонии подвергаются скринингу непосредственно с помощью ПЦР, например скрининга на предмет правильных векторных конструкций ДНК . Колонии берут с помощью наконечника стерильной пипетки и небольшое количество клеток переносят в смесь для ПЦР. Чтобы высвободить ДНК из клеток, ПЦР запускают либо с увеличенного времени при 95 ° C (при использовании стандартной полимеразы), либо с укороченной стадии денатурации при 100 ° C и специальной химерной ДНК-полимеразы. [9]

Цифровой полимеразной цепной реакции одновременно усиливает тысячи образцов, каждый в отдельной капле в пределах эмульсии.

Самоубийственная ПЦР обычно используется в палеогенетике или других исследованиях, где предотвращение ложноположительных результатов и обеспечение специфичности амплифицированного фрагмента является наивысшим приоритетом. Первоначально он был описан в исследовании для проверки наличия микроба Yersinia pestis в образцах зубов, взятых из могил 14-го века людей, предположительно погибших от чумы во время средневековой эпидемии черной смерти . [10]Этот метод предписывает использование любой комбинации праймеров только один раз в ПЦР (отсюда и термин «самоубийство»), который никогда не должен использоваться в какой-либо положительной контрольной реакции ПЦР, и праймеры всегда должны быть нацелены на область генома, никогда ранее не амплифицированную lab с использованием этого или любого другого набора праймеров. Это гарантирует, что в лаборатории не будет загрязняющей ДНК из предыдущих реакций ПЦР, которая в противном случае могла бы привести к ложноположительным результатам.

ХОЛОД-ПЦР ( совместно -amplification при л OWER д enaturation температурно-ПЦР) представляет собой модифицированный протокол , который обогащает вариант аллели из смеси дикого типа и содержащая мутации ДНК.

PANDAA (Pan-Degenerate Amplification and Adaptation) - это инновационный анализ точечных мутаций, который направлен на техническую часть традиционной кПЦР, при которой нестабильность последовательности в областях связывания зонда снижает надежность чувствительности и дает ложноотрицательные результаты. PANDAA использует ультравырожденные праймеры с 3'-концами, перекрывающими сайт связывания зонда, для адаптации мишени посредством сайт-направленного мутагенеза во время кПЦР для замены вариации последовательности. PANDAA уникально переносит разнообразие последовательностей de novo, обеспечивая сохранение диагностической целостности на протяжении всей эпидемии или пандемии. [11]

Предварительные процедуры и расширения [ править ]

Базовый процесс ПЦР иногда может предшествовать другому методу или следовать за ним.

ОТ-ПЦР (или R everse Т ranscription ПЦР ) используется для обратного-Расшифруйте и амплификации РНК в кДНК . ПЦР предшествует реакция с использованием обратной транскриптазы , фермента, превращающего РНК в кДНК. Эти две реакции можно объединить в пробирке, при этом начальный этап нагревания ПЦР используется для инактивации транскриптазы. [4] Tth-полимераза (описанная ниже) обладает RT-активностью и может осуществлять всю реакцию. ОТ-ПЦР широко используется для профилирования экспрессии , которая определяет экспрессию гена. Его также можно использовать для получения последовательности транскрипта РНК, которая может помочь в определениисайты начала и окончания транскрипции (с помощью RACE-PCR ) и облегчают картирование расположения экзонов и интронов в последовательности гена.

Двусторонняя ПЦР использует один праймер, который связывается с мишенью микроРНК как с 3 ', так и с 5' концами, так называемые гемипрозоны. [12] Оба конца должны дополнять друг друга, чтобы произошло связывание. Затем 3'-конец удлиняется обратной транскриптазой, образуя длинную кДНК. Затем кДНК амплифицируют с использованием двух целевых специфичных праймеров для ПЦР. Комбинация двух гемизондов, нацеленных на короткую мишень микроРНК, делает двусторонний анализ чрезвычайно чувствительным и специфичным.

ПЦР, опосредованная лигированием, использует небольшие ДНК-олигонуклеотидные «линкеры» (или адаптеры), которые сначала лигируют с фрагментами целевой ДНК. Праймеры ПЦР, которые отжигаются с линкерными последовательностями, затем используются для амплификации целевых фрагментов. Этот метод используется для секвенирования ДНК, обхода генома и снятия следов ДНК . [13] Родственный метод - это полиморфизм длины амплифицированного фрагмента , который генерирует диагностические фрагменты генома.

ПЦР, специфичная для метилирования ( MSP ), используется для идентификации паттернов метилирования ДНК на островках цитозин-гуанина (CpG) в геномной ДНК. [14] Целевая ДНК сначала обрабатывается бисульфитом натрия , который превращает неметилированные цитозиновые основания в урацил , который комплементарен аденозину в праймерах для ПЦР. Затем проводят две амплификации ДНК, обработанной бисульфитом: один набор праймеров отжигает ДНК с цитозином (соответствует метилированному цитозину), а другой набор отжигает ДНК с урацилом (соответствует неметилированному цитозину). MSP, используемый в количественной ПЦРпредоставляет количественную информацию о состоянии метилирования данного CpG-островка. [15]

Другие модификации [ править ]

Дополнительная информация: оптимизация ПЦР

Регулировка компонентов в ПЦР обычно используется для достижения оптимальной производительности.

Двухвалентный ион магния (Mg ++ ) необходим для активности полимеразы ПЦР. Более низкие концентрации Mg ++ повысят точность репликации, а более высокие концентрации приведут к большему количеству мутаций. [16]

Денатуранты (такие как ДМСО ) могут увеличивать специфичность амплификации за счет дестабилизации неспецифического связывания праймера. Другие химические вещества, такие как глицерин , являются стабилизаторами активности полимеразы во время амплификации. Моющие средства (такие как Triton X-100 ) могут предотвратить прилипание полимеразы к самой себе или к стенкам реакционной пробирки.

ДНК-полимеразы иногда включают основания несовпадения в удлиняющуюся цепь. В высокоточной ПЦР используются ферменты с 3'-5'- экзонуклеазной активностью, что снижает скорость неправильного включения. Примеры ферментов с корректирующей активностью включают Pfu ; корректировка концентраций Mg ++ и dNTP может помочь максимизировать количество продуктов, которые точно соответствуют исходной целевой ДНК. [ необходима цитата ]

Модификации праймера [ править ]

Корректировки синтетических олигонуклеотидов, используемых в качестве праймеров в ПЦР, являются богатым источником модификаций:

Обычно праймеры для ПЦР выбираются из инвариантной части генома и могут использоваться для амплификации полиморфной области между ними. В аллель-специфической ПЦР делается наоборот. По крайней мере, один из праймеров выбран из полиморфной области с мутациями, расположенными на (или около) его 3'-конце. В жестких условиях несовпадающий праймер не инициирует репликацию, тогда как подобранный праймер будет. Таким образом, появление продукта амплификации указывает на генотип. (Для получения дополнительной информации см. Генотипирование SNP .)

InterSequence-Specific PCR (или ISSR-PCR ) - это метод снятия отпечатков ДНК, при котором используются праймеры, выбранные из сегментов, повторяющихся по всему геному, для получения уникального отпечатка длины амплифицированного продукта. [17] Использование праймеров из часто повторяющегося сегмента называется Alu-PCR и может помочь амплифицировать последовательности, прилегающие (или между) этими повторами.

Праймеры также могут быть «вырожденными» - способными инициировать репликацию из большого количества целевых участков. Полногеномная амплификация (или WGA ) - это группа процедур, которые позволяют амплификации происходить во многих местах неизвестного генома и которые могут быть доступны только в небольших количествах. Другие методы используют вырожденные праймеры , которые синтезируются с использованием множества нуклеотидов в определенных положениях (полимераза «выбирает» правильно подобранные праймеры). Кроме того, праймеры можно синтезировать с аналогом нуклеозида инозином , который гибридизуется с тремя из четырех нормальных оснований. Подобный метод может заставить ПЦР выполнить сайт-направленный мутагенез . (также смПолимеразная цепная реакция с удлинением перекрытия )

Обычно используемые в ПЦР праймеры полностью комплементарны мишени. Однако полимераза устойчива к ошибочным совпадениям вдали от 3 'конца. Хвостатые праймеры включают некомплементарные последовательности на своих 5'-концах. Распространенной процедурой является использование линкеров-праймеров , которые в конечном итоге размещают сайты рестрикции на концах продуктов ПЦР, облегчая их более позднюю вставку в векторы клонирования.

Расширением метода «колония-ПЦР» (см. Выше) является использование векторных праймеров . Фрагменты целевой ДНК (или кДНК) сначала вставляются в вектор клонирования , и один набор праймеров конструируется для областей вектора, фланкирующих сайт вставки. Амплификация происходит для любой вставленной ДНК. [4]

ПЦР можно легко модифицировать для получения меченого продукта для последующего использования в качестве зонда для гибридизации . Один или оба праймера могут использоваться в ПЦР с уже прикрепленной радиоактивной или флуоресцентной меткой, или метки могут быть добавлены после амплификации. Эти методы мечения можно комбинировать с «асимметричной ПЦР» (см. Выше) для получения эффективных гибридизационных зондов.

РНКаза H-зависимая ПЦР (рчПЦР) может снизить образование димера праймера и увеличить количество анализов в мультиплексной ПЦР. В этом методе используются праймеры с расщепляемым блоком на 3'-конце, который удаляется под действием термостабильного фермента РНКазы HII. [18]

ДНК-полимеразы [ править ]

Есть несколько ДНК-полимераз, которые используются в ПЦР.

Фрагмент Кленова , полученный из исходной ДНК - полимеразы I из Е. coli , был первым ферментом , использовали в ПЦР. Из-за отсутствия стабильности при высоких температурах его необходимо пополнять во время каждого цикла, поэтому он обычно не используется в ПЦР.

ДНК-полимераза бактериофага Т4 (семейство A) также первоначально использовалась в ПЦР. Он имеет более высокую точность репликации, чем фрагмент Кленова, но также разрушается при нагревании. ДНК-полимераза Т7 (семейство B) имеет аналогичные свойства и цели. Он был применен для сайт-направленного мутагенеза [19] и секвенирования по Сэнгеру . [20]

Полимераза Taq , ДНК-полимераза I от Thermus aquaticus , была первой термостабильной полимеразой, использованной в ПЦР, и до сих пор остается наиболее часто используемой. Фермент может быть выделен из его природного источника или из его клонированного гена, экспрессированного в E. coli . [4] Укороченный фрагмент 61 кДа из-за отсутствия 5'-3'-экзонуклеазной активности известен как фрагмент Stoffel и экспрессируется в E. coli . [21] Отсутствие экзонуклеазной активности может позволить ему амплифицировать более длинные мишени, чем нативный фермент. Он был коммерциализирован как AmpliTaq и Klentaq . [22]Также был разработан вариант, разработанный для ПЦР с горячим стартом, который называется «полимераза Faststart». Он требует сильной тепловой активации, что позволяет избежать неспецифической амплификации из-за активности полимеразы при низкой температуре. Создано много других вариантов . [23]

Другие полимеразы Thermus , такие как полимераза Tth I ( P52028 ) от Thermus thermophilus , нашли некоторое применение. Tth обладает активностью обратной транскриптазы в присутствии ионов Mn 2+ , что позволяет амплификацию ПЦР от мишеней РНК. [24]

Архей рода Pyrococcus доказал богатый источник термостабильных полимераз с корректурой активностью. ДНК-полимераза Pfu , выделенная из P. furiosus, показывает 5-кратное снижение частоты ошибок репликации по сравнению с Taq. [25] Поскольку количество ошибок увеличивается по мере продвижения ПЦР, Pfu является предпочтительной полимеразой, когда продукты должны быть индивидуально клонированы для секвенирования или экспрессии. Другие менее используемые полимеразы из этого рода включают Pwo ( P61876 ) из Pyrococcus woesei , Pfx из безымянного вида, полимеразу "Deep Vent" ( Q51334 ) из штамма GB-D. [26]

Полимераза Vent или Tli - чрезвычайно термостабильная ДНК-полимераза, выделенная из Thermococcus litoralis . Полимераза из Thermococcus fumicolans ( Tfu ) также поступила в продажу . [26]

Модификации механизма [ править ]

Иногда можно изменить даже основной механизм ПЦР.

Обратная ПЦР.

В отличие от обычной ПЦР, обратная ПЦР позволяет амплифицировать и секвенировать ДНК, окружающую известную последовательность. Он включает в себя сначала подвергание целевой ДНК серии перевариваний рестрикционными ферментами , а затем циркуляризацию полученных фрагментов путем самолигирования . Праймеры предназначены для расширения наружу от известного сегмента, что приводит к усилению остальной части круга. Это особенно полезно при идентификации последовательностей по обе стороны от различных геномных вставок. [27]

Точно так же термическая асимметричная ПЦР с чересстрочной разверткой (или TAIL-PCR ) используется для выделения неизвестных последовательностей, фланкирующих известную область генома. В пределах известной последовательности TAIL-PCR использует вложенную пару праймеров с разными температурами отжига. «Вырожденный» праймер используется для амплификации в направлении, противоположном неизвестной последовательности. [28]

Методы изотермического усиления [ править ]

Были разработаны некоторые протоколы амплификации ДНК, которые можно использовать как альтернативу ПЦР. Они изотермические, что означает, что они работают при постоянной температуре. [29]

Геликазозависимая амплификация (HDA) похожа на традиционную ПЦР, но использует постоянную температуру, а не циклическое переключение между стадиями денатурации и отжига / удлинения. ДНК-геликаза , фермент, раскручивающий ДНК, используется вместо тепловой денатурации. [30] Петлевой изотермической амплификации является аналогичная идея, но выполняется с помощью полимеразы с замещением цепи. [31]

Реакция амплификации никелирующего фермента (NEAR) и амплификация со смещением родственной цепи (SDA) являются изотермическими, реплицирующими ДНК при постоянной температуре с использованием полимеразы и никелирующего фермента. [29]

Амплификация рекомбиназной полимеразы (RPA) [32] использует рекомбиназу для специфического спаривания праймеров с двухцепочечной ДНК на основе гомологии, тем самым направляя синтез ДНК из определенных последовательностей ДНК, присутствующих в образце. Присутствие целевой последовательности инициирует амплификацию ДНК, при этом не требуется термического или химического плавления ДНК. Реакция быстро прогрессирует и приводит к специфической амплификации ДНК от нескольких копий-мишеней до обнаруживаемых уровней, как правило, в течение 5–10 минут. Вся реакционная система стабильна в виде высушенного состава и не требует охлаждения. RPA может использоваться для замены ПЦР в различных лабораторных приложениях, и пользователи могут создавать свои собственные анализы. [33]

Другие типы изотермической амплификации включают амплификацию всего генома (WGA), амплификацию на основе последовательностей нуклеиновых кислот (NASBA) и транскрипционную амплификацию (TMA). [29]

См. Также [ править ]

  • Vectorette PCR

Ссылки [ править ]

  1. ^ Hayden MJ, Нгуен Т.М., Waterman A, Чалмерс KJ (2008). «ПЦР с мультиплексированием: новый метод мультиплексного генотипирования SSR и SNP» . BMC Genomics . 9 : 80. DOI : 10.1186 / 1471-2164-9-80 . PMC  2275739 . PMID  18282271 .
  2. ^ Иннис М.А., Myambo KB, Гельфанд DH, Brow MA (декабрь 1988). «Секвенирование ДНК с помощью ДНК-полимеразы Thermus aquaticus и прямое секвенирование ДНК, амплифицированной с помощью полимеразной цепной реакции» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 85 (24): 9436–40. Bibcode : 1988PNAS ... 85.9436I . DOI : 10.1073 / pnas.85.24.9436 . PMC 282767 . PMID 3200828 .  
  3. ^ Pierce KE, Wangh LJ (2007). Линейная после экспоненциальной полимеразной цепной реакции и родственные технологии Стратегии обнаружения в реальном времени для быстрой и надежной диагностики отдельных клеток . Методы Mol Med . Методы молекулярной медицины ™. 132 . С. 65–85. DOI : 10.1007 / 978-1-59745-298-4_7 . ISBN 978-1-58829-578-1. PMID  17876077 .
  4. ^ а б в г Сайки Р.К., Гельфанд Д.Х., Стоффель С. и др. (Январь 1988 г.). «Праймер-направленная ферментативная амплификация ДНК с термостабильной ДНК-полимеразой» . Наука . 239 (4839): 487–91. Bibcode : 1988Sci ... 239..487S . DOI : 10.1126 / science.239.4839.487 . PMID 2448875 . 
  5. ^ Ченг S, Fockler С, Barnes WM, Хигути R (июнь 1994). «Эффективная амплификация длинных мишеней из клонированных вставок и геномной ДНК человека» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 91 (12): 5695–9. Bibcode : 1994PNAS ... 91.5695C . DOI : 10.1073 / pnas.91.12.5695 . PMC 44063 . PMID 8202550 .  
  6. Перейти ↑ Chou Q, Russell M, Birch DE, Raymond J, Bloch W (апрель 1992 г.). «Предотвращение неправильного прайминга перед ПЦР и димеризации праймеров улучшает амплификации с низким числом копий» . Nucleic Acids Res . 20 (7): 1717–23. DOI : 10.1093 / NAR / 20.7.1717 . PMC 312262 . PMID 1579465 .  
  7. ^ Дон RH, Cox PT, Wainwright BJ, Baker K, Mattick JS (июль 1991). « ПЦР « Touchdown »для предотвращения ложного праймирования во время амплификации гена» . Nucleic Acids Res . 19 (14): 4008. DOI : 10,1093 / NAR / 19.14.4008 . PMC 328507 . PMID 1861999 .  
  8. ^ Stemmer WP, Crameri A, Ha KD, Brennan TM, Heyneker HL (1995). «Одностадийная сборка гена и всей плазмиды из большого количества олигодезоксирибонуклеотидов». Джин . 164 (1): 49–53. DOI : 10.1016 / 0378-1119 (95) 00511-4 . PMID 7590320 . 
  9. ^ Павлов А.Р., Павлова Н.В., Козявкин С.А., Слесарев А.И. (2006). «Термостабильные ДНК-полимеразы для широкого спектра применений: сравнение надежного гибридного TopoTaq с другими ферментами». В Kieleczawa J (ред.). Секвенирование ДНК II: Оптимизация подготовки и очистки . Джонс и Бартлетт. С. 241–257. ISBN 978-0-7637-3383-4.
  10. ^ Рауль, D; Г Абудхарам; Э Крубези; G Larrouy; B Ludes; М. Дранкур (2000-11-07). «Молекулярная идентификация с помощью« самоубийственной ПЦР »Yersinia pestis как агента средневековой черной смерти» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 97 (23): 12800–12803. Bibcode : 2000PNAS ... 9712800R . DOI : 10.1073 / pnas.220225197 . ISSN 0027-8424 . PMC 18844 . PMID 11058154 .   
  11. ^ MacLeod IJ, Rowley CF, Essex M (февраль 2021). «PANDAA намеренно нарушает стандартную схему КПЦР, чтобы обеспечить надежное, независимое от несоответствия обнаружение высокополиморфных патогенов». Commun Biol . 4 (227): 1–13. DOI : 10.1038 / s42003-021-01751-9 . PMID 33603155 . 
  12. ^ Андрович, Питер; Валихрах, Лукас; Эллинг, Джули; Шобак, Роберт; Кубиста, Микаэль (2017). «Двусторонняя RT-qPCR: новый метод высокоточного количественного определения miRNA» . Исследования нуклеиновых кислот . 45 (15): e144. DOI : 10.1093 / NAR / gkx588 . ISSN 0305-1048 . PMC 5587787 . PMID 28911110 .   
  13. ↑ Mueller PR, Wold B (ноябрь 1989 г.). «Поступление in vivo мышечного специфического усилителя с помощью лигирования опосредованной ПЦР». Наука . 246 (4931): 780–6. Bibcode : 1989Sci ... 246..780M . DOI : 10.1126 / science.2814500 . PMID 2814500 . 
  14. ^ Herman JG , Graff JR, Myöhänen S, Нелькин BD, Baylin SB (сентябрь 1996). «Метилирование-специфическая ПЦР: новый ПЦР-анализ статуса метилирования CpG-островков» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 93 (18): 9821–6. Bibcode : 1996PNAS ... 93.9821H . DOI : 10.1073 / pnas.93.18.9821 . PMC 38513 . PMID 8790415 .  
  15. ^ Эрнандес, H; Це, МОЙ; Пан, Южная Каролина; Arboleda, H; Forero, DA (октябрь 2013 г.). «Оптимизация методик анализа метилирования ДНК на основе ПЦР» . Биотехнологии . 55 (4): 181–197. DOI : 10.2144 / 000114087 . PMID 24107250 . 
  16. ^ Маркулатос, P; Сиафакас, Н; Монкань, М. (2002). «Мультиплексная полимеразная цепная реакция: практический подход» . Журнал клинических лабораторных анализов . 16 (1): 47–51. DOI : 10.1002 / jcla.2058 . PMC 6808141 . PMID 11835531 .  
  17. ^ Э. Зиткевич; А. Рафальски и Д. Лабуда (1994). «Фингерпринт генома путем амплификации полимеразной цепной реакции, закрепленной простым повторением последовательности (SSR)». Геномика . 20 (2): 176–83. DOI : 10.1006 / geno.1994.1151 . PMID 8020964 . 
  18. ^ Dobosy JR, Rose SD, Beltz KR, Рапп SM, Пауэрс К.М., Behlke М.А., Walder JA (август 2011). «РНКаза H-зависимая ПЦР (rhPCR): улучшенная специфичность и обнаружение однонуклеотидного полиморфизма с использованием блокированных расщепляемых праймеров» . BMC Biotechnology . 11 : 80. DOI : 10,1186 / 1472-6750-11-80 . PMC 3224242 . PMID 21831278 .  
  19. ^ Venkitaraman AR (апрель 1989). «Использование модифицированной ДНК-полимеразы Т7 (версия 2.0 секвеназы) для сайт-направленного мутагенеза олигонуклеотидов» . Исследования нуклеиновых кислот . 17 (8): 3314. DOI : 10,1093 / NAR / 17.8.3314 . PMC 317753 . PMID 2726477 .  
  20. ^ "Термосеквеназа ДНК-полимераза" .
  21. ↑ Юрист, ФК; Stoffel, S .; Сайки, РК; Chang, SY; Ландре, Пенсильвания; Abramson, RD; Гельфанд, DH (1993-05-01). «Высокий уровень экспрессии, очистки и ферментативной характеристики полноразмерной ДНК-полимеразы Thermus aquaticus и укороченной формы с дефицитом экзонуклеазной активности от 5 'до 3'» . Методы и приложения ПЦР . 2 (4): 275–287. DOI : 10.1101 / gr.2.4.275 . ISSN 1054-9803 . PMID 8324500 .  
  22. ^ «Прикладные биосистемы - Поддержка» . www6.appliedbiosystems.com .
  23. ^ Виллбрандт, B; Собек, H; Фрей, B; Шомбург, Д. (сентябрь 2000 г.). «Обмен доменами: химеры ДНК-полимеразы Thermus aquaticus, ДНК-полимеразы I Escherichia coli и ДНК-полимеразы Thermotoga neapolitana» . Белковая инженерия . 13 (9): 645–54. DOI : 10,1093 / белок / 13.9.645 . PMID 11054459 . 
  24. ^ https://www.promega.in/products/pcr/rt-pcr/tth-dna-polymerase/
  25. ^ Cline J, Braman JC, Hogrefe HH (сентябрь 1996). «ПЦР-точность ДНК-полимеразы pfu и других термостабильных ДНК-полимераз» . Nucleic Acids Res . 24 (18): 3546–51. DOI : 10.1093 / NAR / 24.18.3546 . PMC 146123 . PMID 8836181 .  
  26. ^ a b van Pelt-Verkuil E, van Belkum A, Hays JP (2008). «Taq и другие термостабильные ДНК-полимеразы». Принципы и технические аспекты амплификации ПЦР . С. 103–18. DOI : 10.1007 / 978-1-4020-6241-4_7 . ISBN 978-1-4020-6240-7.
  27. ^ Ochman Н, Гербера А.С., Hartl DL (1 ноября 1988 г.). «Генетические применения обратной полимеразной цепной реакции» . Генетика . 120 (3): 621–3. PMC 1203539 . PMID 2852134 .  
  28. ^ Лю YG, Whittier РФ (февраль 1995). «Термическая асимметричная чересстрочная ПЦР: автоматическая амплификация и секвенирование концевых фрагментов вставки из клонов P1 и YAC для ходьбы по хромосомам». Геномика . 25 (3): 674–81. DOI : 10.1016 / 0888-7543 (95) 80010-J . PMID 7759102 . 
  29. ^ a b c «Изотермическое усиление - Обзор применения» . Новая Англия BioLabs, Inc. 2020 . Дата обращения 13 августа 2020 .
  30. Перейти ↑ Vincent M, Xu Y, Kong H (август 2004 г.). «Геликазозависимая изотермическая амплификация ДНК» . EMBO Rep . 5 (8): 795–800. DOI : 10.1038 / sj.embor.7400200 . PMC 1249482 . PMID 15247927 .  
  31. ^ Notomi Т, Окаяма Н, Masubuchi Н, Ёнекав Т, Ватанабе К, Амин Н, Hase Т (2000). «Петлевая изотермическая амплификация ДНК» . Nucleic Acids Res . 28 (12): 63e – 63. DOI : 10.1093 / NAR / 28.12.e63 . PMC 102748 . PMID 10871386 .  
  32. ^ Piepenburg О, СН Williams, Стемпл Д.Л., Армс Н.А. (2006). «Обнаружение ДНК с использованием рекомбинационных белков» . PLOS Biol . 4 (7): e204. DOI : 10.1371 / journal.pbio.0040204 . PMC 1475771 . PMID 16756388 .  
  33. ^ Lutz S, Weber P, Focke M, Faltin B, Hoffmann J, Müller C, Mark D, Roth G, Munday P, Armes N, Piepenburg O, Zengerle R, von Stetten F (апрель 2010 г.). «Микрожидкостная лаборатория на фольге для анализа нуклеиновых кислот на основе изотермической рекомбиназной полимеразной амплификации (RPA)». Лабораторный чип . 10 (7): 887–93. DOI : 10.1039 / b921140c . PMID 20300675 . 

Внешние ссылки [ править ]

  • Руководство по применению ПЦР (от Roche Diagnostics).
  • Ссылка в qPCR - академическая и промышленная информационная платформа
  • Портал потоковой передачи www.eConferences.de - Расширьте свои знания в области qPCR, dPCR и NGS!