Двухфото́нный ла́зерный микроско́п — лазерный микроскоп, позволяющий наблюдать живые ткани на глубине более одного миллиметра, используя явление флуоресценции. Двухфотонный микроскоп является разновидностью мультифотонного флуоресцентного микроскопа. Его преимущества по сравнению с конфокальным микроскопом — большая проникающая способность и низкая степень фототоксичности[1].
Двухфотонный микроскоп был впервые сконструирован Винфредом Денком в лаборатории В. В. Вебба в Корнеллском университете[2]. Он скомбинировал идею двухфотонного возбуждения с лазерным сканированием.
Двухфотонный лазерный микроскоп основан на физическом принципе, описанном Марией Гёпперт-Майер в её докторской диссертации[3] в 1931 г.
Процесс двухфотонного возбуждения происходит следующим образом: два фотона, обладающие низкой энергией, возбуждают флюорофор (способную к флюоресценции молекулу или часть молекулы) в течение одного квантового события. Результатом этого возбуждения является последующее испускание возбужденными молекулами флюоресцентного фотона. Энергия флуоресцентного фотона больше энергии возбуждающих фотонов.
Вероятность того, что оба фотона возбуждения будут поглощены одной молекулой, очень мала. Поэтому необходим большой поток возбуждающих фотонов, который можно получить при помощи лазера, испускающего фотоны с большой частотой следования импульсов (80 МГц). Наиболее часто используемые флюорофоры имеют спектр возбуждения в промежутке 400—500 нм, в то время как длина волны возбуждающего лазера находится в промежутке 700—1000 нм (область инфракрасных волн). Если флюорофор поглотит одновременно два фотона, то он получит достаточно энергии, чтобы перейти в возбужденное состояние. Далее возбужденный флюорофор испустит один фотон (в видимой части спектра), длина волны которого зависит от типа флюорофора.
Поскольку для того, чтобы флюорофор перешёл в возбуждённое состояние, необходимо поглощение двух фотонов, вероятность испускания флюорофором вторичного фотона пропорциональна квадрату интенсивности возбуждения. Поэтому флуоресценция будет сильнее в случае, когда луч лазера четко сфокусирован, а не рассеян. Максимальная флуоресценция наблюдается в фокальном объёме (объёме, где сфокусирован луч лазера) и демонстрирует резкое уменьшение в области вне фокуса.