Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Формирование белковых комплексов с использованием BiFC. Сначала происходит взаимодействие между белком А и белком В, за которым следует повторное образование и флуоресценция флуоресцентного репортерного белка.

Комплементация бимолекулярной флуоресценции (также известная как BiFC ) - это технология, обычно используемая для проверки взаимодействия белков . Он основан на ассоциации фрагментов флуоресцентного белка, которые присоединены к компонентам одного и того же макромолекулярного комплекса. Белки, которые предположительно взаимодействуют, сливаются с развернутыми комплементарными фрагментами флуоресцентного репортерного белка и экспрессируются в живых клетках. Взаимодействие этих белков приведет к сближению флуоресцентных фрагментов, позволяя репортерному белку преобразоваться в свою естественную трехмерную структуру и испускать свой флуоресцентный сигнал. [1]Этот флуоресцентный сигнал может быть обнаружен и локализован внутри клетки с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа, который позволяет визуализировать флуоресценцию в клетках. Кроме того, интенсивность испускаемой флуоресценции пропорциональна силе взаимодействия, причем более высокие уровни флуоресценции указывают на близкие или прямые взаимодействия, а более низкие уровни флуоресценции указывают на взаимодействие внутри комплекса. [2] Таким образом, посредством визуализации и анализа интенсивности и распределения флуоресценции в этих клетках можно идентифицировать как расположение, так и партнеров по взаимодействию интересующих белков.

История [ править ]

Биохимическая комплементация впервые была обнаружена в субтилизин-расщепленной бычьей панкреатической рибонуклеазе , а затем увеличена с использованием мутантов β-галактозидазы, которые позволяли клеткам расти на лактозе. [3] [4] [5]

Признание способности многих белков спонтанно собираться в функциональные комплексы, а также способности фрагментов белка собираться как следствие спонтанной сборки функциональных комплексов партнеров по взаимодействию, с которыми они сливаются, было позже описано для фрагментов убиквитина во взаимодействиях с дрожжевыми белками. [6]

В 2000 году Гош и др. Разработали систему, которая позволила повторно собрать зеленый флуоресцентный белок ( GFP ), используя антипараллельную лейциновую молнию в клетках E. coli . [7] Это было достигнуто путем разделения GFP на C- и N-концевые фрагменты GFP. Поскольку фрагмент GFP был прикреплен к каждой лейциновой молнии с помощью линкера, гетеродимеризация антипараллельной лейциновой молнии приводила к восстановленному или реформированному белку GFP, который можно было визуализировать. Успешный флуоресцентный сигнал показал, что отдельные фрагменты пептида GFP были способны правильно повторно собираться и достигать третичного фолдинга.. Следовательно, было постулировано, что с помощью этой техники фрагментированный GFP может быть использован для изучения взаимодействия белок-белковых пар, у которых N-C концы находятся в непосредственной близости.

После демонстрации успешного восстановления фрагментов флуоресцентного белка в клетках млекопитающих Hu et al . описали использование фрагментированного желтого флуоресцентного белка ( YFP ) в исследовании взаимодействий факторов транскрипции семейства bZIP и Rel . [8] Это был первый отчет о регуляции взаимодействия с белком bZIP регионами за пределами домена bZIP , регуляции субядерной локализации доменов bZIP Fos и Jun их различными взаимодействующими партнерами и модуляции активации транскрипции.белков bZIP и Rel посредством взаимных взаимодействий. Кроме того, это исследование было первым отчетом о методе in vivo , теперь известном как анализ бимолекулярной флуоресценции (BiFC), чтобы обеспечить понимание структурной основы образования белковых комплексов посредством обнаружения флуоресценции, вызванной сборкой флуоресцентного репортерного белка. фрагменты, привязанные к взаимодействующим белкам. [8]

Флуоресцентная маркировка [ править ]

Активация флуорофора происходит в результате реакции автокаталитической циклизации, которая происходит после того, как белок был правильно свернут. [9] Это было продвинуто с успешным восстановлением флуорофора YFP из фрагментов белка, которые были слиты с взаимодействующими белками в течение 8 часов после трансфекции, о чем сообщалось в 2002 году. [8]

Рабочий процесс [ править ]

Рабочий процесс для BiFC

Выбор системы производства гибридных белков [ править ]

Существуют различные производственные системы, которые можно использовать для полученного гибридного белка. Временная экспрессия генов используется для идентификации межбелковых взаимодействий in vivo, а также при субклеточной локализации комплекса BiFC. Однако следует проявлять осторожность в отношении чрезмерной экспрессии белка, поскольку это может исказить как предпочтительную локализацию, так и преобладающие образующиеся белковые комплексы. Вместо этого следует использовать слабые промоторы , использование низких уровней плазмидной ДНК при трансфекции и плазмидные векторы, которые не реплицируются в клетках млекопитающих, чтобы экспрессировать белки на своих эндогенных уровнях или около них, чтобы имитировать физиологическую клеточную среду. [10]Кроме того, важен тщательный выбор флуоресцентного белка, поскольку разные флуоресцентные белки требуют разной клеточной среды. Например, GFP можно использовать в клетках E. coli , а YFP - в клетках млекопитающих. [11]

Стабильные клеточные линии с вектором экспрессии, интегрированным в его геном, обеспечивают более стабильную экспрессию гена в популяции клеток, что приводит к более стабильным результатам. [1]

Определение сайтов слияния [ править ]

При выборе сайта слияния линкера на поверхности белка необходимо учитывать три основных момента. Во-первых, флуоресцентные белковые фрагменты должны иметь возможность связываться друг с другом при взаимодействии их связанных белков. [10] Структурная информация и расположение взаимодействующей поверхности могут быть полезны при определении сайта слияния для линкера, хотя эта информация не является необходимой, поскольку могут быть проверены множественные комбинации и перестановки. [10] Во-вторых, создание гибридного белка не должно существенно изменять локализацию, стабильность или экспрессию белков, с которыми связаны фрагменты, по сравнению с эндогенными белками дикого типа . [10]Наконец, добавление слияния флуоресцентных фрагментов не должно влиять на биологическую функцию белка, что предпочтительно проверяется с помощью анализов, которые оценивают все известные функции белков. [10]

Создание линковщиков [ править ]

Линкер представляет собой короткую аминокислотную последовательность, которая связывает фрагмент флуоресцентного репортерного белка с интересующим белком, образуя гибридный белок. При разработке линкерной последовательности необходимо убедиться, что линкер достаточно растворим и имеет длину, чтобы обеспечить флуоресцентным белковым фрагментам гибкость и свободу движения, так что этот фрагмент и его партнерский фрагмент будут сталкиваться достаточно часто, чтобы воссоздать во время взаимодействия их соответствующие слитые белки. [1] Хотя это не задокументировано, возможно, что длина или последовательность линкера могут влиять на комплементацию некоторых белков. [10]Сообщенные линкерные последовательности RSIAT и RPACKIPNDLKQKVMNH (код одной аминокислоты) и AAANSSIDLISVPVDSR (Sigma) успешно использовались в экспериментах BiFC. [8] [12]

Создание правильных векторов экспрессии плазмид [ править ]

При конструировании плазмидных векторов для экспрессии представляющих интерес белков конструкция должна обладать способностью экспрессировать белки, которые способны образовывать слитые белки с флуоресцентными фрагментами белка без нарушения функции белка. Кроме того, ожидаемый белковый комплекс должен быть способен принимать стабилизацию взаимодействия флуоресцентных белковых фрагментов, не влияя на функцию белкового комплекса или исследуемую клетку. В BiFC можно использовать многие фрагменты флуоресцентного белка, которые объединяются несколькими способами. [8] [12] Как правило, рекомендуется использовать YFP в качестве репортерного белка, расщепляемого по остатку155 (N-конец, состоящий из остатков 1–154, и C-конец, состоящий из остатков 155–238) или остаток 173, в частности, поскольку эти наборы фрагментов очень эффективны в их комплементации при слиянии со многими взаимодействующими белками, и они производят низкие уровни флуоресценция при слиянии с невзаимодействующими белками. Предполагается, что каждый целевой белок сливается с N- и С-концевыми фрагментами флуоресцентного репортерного белка по очереди, и что эти фрагменты сливаются на каждом из N- и С-концевых концов белков-мишеней. Это позволит в общей сложности восемь различных перестановок с тестированием взаимодействий: [1]

N-концевой фрагмент, слитый с N-концевым белком 1 + C-концевой фрагмент, слитый с N-концевым белком 2
N-концевой фрагмент, слитый с N-концевым белком 1 + C-концевой фрагмент, слитый с C-концевым белком 2
N-концевой фрагмент, слитый с C-концевым белком 1 + C-концевой фрагмент, слитый с N-концевым белком 2
N-концевой фрагмент, слитый с C-концевым белком 1 + C-концевой фрагмент, слитый с C-концевым белком 2
С-концевой фрагмент, слитый с N-концевым белком 1 + N-концевой фрагмент, слитый с N-концевым белком 2
С-концевой фрагмент, слитый с N-концевым белком 1 + N-концевой фрагмент, слитый с С-концевым белком 2
C-концевой фрагмент, слитый с C-концевым белком 1 + N-концевой фрагмент, слитый с N-концевым белком 2
C-концевой фрагмент, слитый с C-концевым белком 1 + N-концевой фрагмент, слитый с C-концевым белком 2

Выбор подходящей системы культивирования клеток [ править ]

Как указывалось ранее, важно убедиться, что флуоресцентный репортерный белок, используемый в BiFC, является подходящим и может быть экспрессирован в выбранной системе культивирования клеток , поскольку не все репортерные белки могут флуоресцировать или визуализироваться во всех модельных системах .

Выбор соответствующих элементов управления [ править ]

Флуоресцентные фрагменты белка могут связываться и флуоресцировать с низкой эффективностью в отсутствие специфического взаимодействия. Следовательно, важно включить средства контроля, чтобы гарантировать, что флуоресценция от восстановления флуоресцентного репортерного белка не вызвана неспецифическим контактом. [13]

Некоторые контроли включают фрагменты флуорофоров, связанные с невзаимодействующими белками, поскольку присутствие этих слияний имеет тенденцию к снижению неспецифической комплементации и ложноположительных результатов. [7]

Другой контроль создается путем связывания фрагмента флуоресцентного белка с белками с мутированными гранями взаимодействия. [8] [12] Пока флуоресцентный фрагмент сливается с мутировавшими белками таким же образом, как и белок дикого типа, а уровни экспрессии и локализация гена не зависят от мутации , это служит сильным отрицательным контролем, поскольку мутантные белки и, следовательно, флуоресцентные фрагменты не могут взаимодействовать.

Внутренний контроль также необходим для нормализации различий в эффективности трансфекции и экспрессии генов в разных клетках. Это достигается путем котрансфекции клеток плазмидами, кодирующими интересующие слитые белки, а также целым (нефрагментированным) белком, который флуоресцирует на длине волны, отличной от длины волны флуоресцентного репортерного белка. Во время визуализации определяют интенсивности флуоресценции комплекса BiFC и внутреннего контроля, которые после вычитания фонового сигнала становятся соотношением. Это соотношение представляет собой эффективность BiFC и может сравниваться с другими соотношениями для определения относительной эффективности образования различных комплексов. [10]

Трансфекция клеток [ править ]

После того, как слитые белки и контроли были сконструированы и созданы в соответствующей системе экспрессии, плазмиды должны быть трансфицированы в исследуемые клетки. После трансфекции необходимо подождать, обычно около восьми часов, чтобы дать время для взаимодействия гибридных белков и связывания и флуоресценции их связанных фрагментов флуоресцентных репортерных белков. [8]

Визуализация и анализ [ править ]

По прошествии достаточного времени для взаимодействия слитых белков и связанных с ними флуоресцентных фрагментов и флуоресценции клетки можно наблюдать под инвертированным флуоресцентным микроскопом, который может визуализировать флуоресценцию в клетках. Хотя интенсивность флуоресценции комплексов BiFC обычно составляет <10% от интенсивности, вызванной экспрессией интактных флуоресцентных белков, чрезвычайно низкая аутофлуоресценция в видимом диапазоне очень большинства клеток часто делает сигнал BiFC на порядки выше, чем фоновая флуоресценция. [14]

Если флуоресценция обнаруживается, когда слитые белки экспрессируются, но отсутствует или значительно снижается после экспрессии мутировавшего отрицательного контроля, вполне вероятно, что между двумя интересующими белками-мишенями происходит специфическое взаимодействие. Однако, если интенсивность флуоресценции не отличается значительно между мутированным слитым белком отрицательного контроля и его аналогом дикого типа, то флуоресценция, вероятно, вызвана неспецифическими взаимодействиями белков, поэтому следует протестировать другую комбинацию конформаций слитого белка.

Если флуоресценция не обнаружена, взаимодействие между интересующими белками все еще может существовать, поскольку создание гибридного белка может изменить структуру или поверхность взаимодействия целевого белка, или фрагменты флуоресценции могут быть физически неспособны связываться. Чтобы гарантировать, что этот результат не является ложноотрицательным , что нет взаимодействия, взаимодействие белков должно быть проверено в ситуации, когда для комплементации и активации флуоресценции требуется внешний сигнал. В этом случае, если внешний сигнал не может вызвать ассоциацию флуоресцентных фрагментов, вероятно, что белки не взаимодействуют или существует физическое препятствие для комплементации флуоресценции. [10]

Сильные стороны [ править ]

Соответствующий биологический контекст [ править ]

Белки взаимодействуют с различными белками-партнерами и другими макромолекулами для достижения функций, которые поддерживают различные функции в клетках, которые поддерживают выживание организма. Идентификация этих взаимодействий может дать ключ к разгадке их влияния на клеточные процессы. Поскольку на эти взаимодействия могут влиять как внутренняя среда, так и внешние стимулы, изучение этих взаимодействий in vivo и на эндогенных уровнях, как рекомендуется в BiFC, обеспечивает физиологически релевантный контекст, из которого можно сделать выводы о взаимодействиях белков.

Прямая визуализация [ править ]

BiFC обеспечивает прямую визуализацию белковых взаимодействий в живых клетках с ограниченными клеточными возмущениями , вместо того, чтобы полагаться на вторичные эффекты или окрашивание экзогенными молекулами, которые могут не распределяться равномерно. [1] Это, а также возможность наблюдать за живыми клетками в течение длительных периодов времени, стало возможным благодаря сильной собственной флуоресценции восстановленного репортерного белка, что снижает вероятность неправильного считывания, связанного с процессом выделения белка. [1] [15]

Чувствительность [ править ]

В отличие от многих анализов взаимодействия белков in vivo , BiFC не требует, чтобы белковые комплексы образовывались большой долей белков или в стехиометрических пропорциях. Вместо этого BiFC может обнаруживать взаимодействия между субпопуляциями белков , слабые взаимодействия и белки с низкой экспрессией из-за стабильной комплементации флуоресцентного репортерного белка. [11] [16] Кроме того, сообщалось об успешном восстановлении флуоресцентного белка для белков-партнеров, находящихся на расстоянии более 7 нм друг от друга, при условии, что линкеры, связывающие фрагмент флуорофора с интересующим белком, обладают гибкостью, необходимой для связывания с его соответствующим фрагментом. [13]Кроме того, сила белкового взаимодействия может быть количественно определена по изменениям силы флуоресцентного сигнала. [2]

Пространственное разрешение [ править ]

BiFC позволяет измерять пространственные и временные изменения в белковых комплексах, даже в ответ на активацию и ингибирования наркотики и subcellularly, обеспечивая самое высокое пространственное разрешение в в естественных условиях анализов белок-белковых взаимодействий. [8] [17] [18]

Нет специального оборудования [ править ]

BiFC не требует специального оборудования, так как визуализация возможна с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа, который может обнаруживать флуоресценцию в клетках. [13] Кроме того, анализ не требует сложной обработки данных или корректировки других источников флуоресценции. [8]

Никакой структурной информации не требуется [ править ]

BiFC может выполняться без структурной информации о партнерах по взаимодействию при условии, что фрагменты флуоресцентного репортерного белка могут ассоциироваться внутри комплекса, поскольку можно проводить скрининг нескольких комбинаций слитых белков. Это связано с предположением, что, поскольку функции белков повторяются в контексте in vivo , сложная структура будет напоминать структуру интактных белков, видимую физиологически. [14]

Несколько приложений [ править ]

Технология BiFC была усовершенствована и расширена, чтобы включить возможность одновременной визуализации нескольких белковых комплексов в одной и той же клетке , взаимодействия РНК / белков , быстрого обнаружения изменений в путях генной трансдукции, демонстрации скрытых фенотипов лекарств , где прогнозируется результат лечения (т. Е. гибель клеток, дифференцировка, морфологические изменения) не наблюдается in vivo , изучайте комплексообразование в различных клеточных компартментах и картируйте поверхности взаимодействия белков [12] [18] [19] [20] [21]

Ограничения [ править ]

Обнаружение в реальном времени [ править ]

Флуоресцентный сигнал вырабатывается только после взаимодействия белков, что обычно длится несколько часов. Следовательно, BiFC не может обеспечить обнаружение белковых взаимодействий в реальном времени. Задержка химических реакций для генерации флуорофора может также влиять на динамику диссоциации комплекса и обмена партнерами. [1] [7] [8] [22]

Необратимое образование BiFC [ править ]

Образование комплекса BiFC обратимо только на начальном этапе повторной сборки флуоресцентного репортерного белка, обычно в течение миллисекунд. После воссоздания флуорохрома in vitro он становится практически необратимым . Это предотвращает взаимодействие белков с другими и может нарушить ассоциацию / диссоциацию белковых комплексов в динамическом равновесии . [1]

Независимые ассоциации фрагментов флуоресцентных белков [ править ]

Флуоресцентные белковые фрагменты обладают ограниченной способностью связываться независимо от белков, с которыми они слиты. Хотя независимая от белка ассоциация будет варьироваться в зависимости от идентичности слитых белков и уровней их экспрессии, необходимо обеспечить необходимые и многочисленные элементы управления, чтобы различать истинные и ложноположительные взаимодействия белков. Как правило, это ограничение смягчается, гарантируя, что интересующие слитые белки экспрессируются в эндогенных концентрациях. [1]

Изменение структуры белка и стерические препятствия [ править ]

Связывание флуоресцентных фрагментов может изменять укладку или структуру интересующего белка, приводя к устранению сайта связывания на поверхности взаимодействующего белка. Кроме того, расположение флуоресцентных фрагментов может препятствовать восстановлению флуорофора из-за стерических препятствий , хотя стерические препятствия можно уменьшить или устранить с помощью линкерной последовательности, которая обеспечивает достаточную гибкость для связывания флуоресцентных фрагментов. Следовательно, отсутствие комплементации флуоресценции может быть ложноотрицательным и не обязательно доказывает, что рассматриваемого взаимодействия не происходит.

Облигатные анаэробы [ править ]

Из-за потребности в молекулярном кислороде для образования флуорофора BiFC нельзя использовать для облигатных анаэробов , которые не могут выжить в присутствии кислорода. Это ограничивает использование BiFC аэробными организмами . [1]

Автофлуоресценция [ править ]

Автофлуоресценция обычно не проблема, поскольку сигнал BiFC будет намного выше, чем фон. [23] [24] Однако некоторые организмы, особенно апикомплексы , имеют более высокую автофлуоресценцию, что затрудняет применение в них BiFC. [25] Некоторые грибы, такие как Candida albicans , также имеют высокий автофлуоресцентный фон, но BiFC часто все же можно проводить, если используются соответствующие контроли и штаммы. [26] [27]

Использование гибридных белков [ править ]

Поскольку эндогенные белки дикого типа не могут быть визуализированы in vivo , необходимо создавать гибридные белки и трансфицировать их плазмиды в исследуемые клетки. Эти слитые белки могут не повторять функции, локализацию и взаимодействия, общие для их аналогов дикого типа, обеспечивая неточную картину рассматриваемых белков. Эту проблему можно облегчить, используя структурную информацию и расположение сайтов взаимодействия для рациональной идентификации сайтов слияния на интересующих белках, используя соответствующие контроли и сравнивая уровни экспрессии и функции слитых белков и белков дикого типа с помощью вестерн-блоттинга и функционального анализа. анализы. [1]

Температурная зависимость [ править ]

Хотя низкие температуры способствуют восстановлению флуоресценции, когда фрагменты находятся в непосредственной близости, это может влиять на поведение целевых белков, приводя к неточным выводам относительно природы взаимодействия белков и их взаимодействующих партнеров. [16]

Точные отношения взаимодействия неизвестны [ править ]

Поскольку восстановление флуорофора может происходить на расстоянии 7 нм или более, комплементация флуоресценции может указывать на прямое или косвенное (т.е. в пределах одного комплекса) взаимодействие между слитыми белками флуоресцентных фрагментов. [15]

Заявление [ править ]

Помимо проверки взаимодействия белок-белок, описанной выше, BiFC был расширен и адаптирован для других приложений:

Сборка бактериальных рибосом [ править ]

Система BiFC применялась для регистрации событий биогенеза рибосом у E.coli . [28] Процесс сборки рибосом включает зарождение рибосомных белков в правильном порядке и ориентации. Нарушения сборки могут приводить к структурным дефектам в субъединицах рибосом, которые в результате не могут соединяться в правильной ориентации с образованием полностью функциональных рибосом. Таким образом, события присоединения субъединиц, сигнализируемые появлением BiFC, являются простым способом мониторинга биогенеза рибосом в отличие от трудоемких методов профилирования полисом.

Разноцветная флуоресценция [ править ]

Флуоресцентные белковые фрагменты, используемые в BiFC, были расширены и теперь включают синий, голубой, зеленый, желтый, красный, вишневый и цвет Венеры . [8] [12] [29] [30] Этот диапазон цветов сделал возможным развитие анализа комплементации многоцветной флуоресценции. [12] Этот метод позволяет одновременно визуализировать несколько белковых комплексов в одной и той же клетке. Кроме того, белки обычно имеют большое количество альтернативных партнеров по взаимодействию. Следовательно, путем слияния фрагментов различных флуоресцентных белков с белками-кандидатами можно изучать конкуренцию между альтернативными партнерами по взаимодействию за образование комплекса посредством комплементации различных флуоресцентных цветных фрагментов. [12]

Взаимодействие с РНК-связывающими белками [ править ]

BiFC был расширен, чтобы включить изучение взаимодействий РНК-связывающих белков в методе Рэкхема и Брауна, описанном как комплементация тримолекулярной флуоресценции (TriFC). [19] В этом методе фрагмент флуоресцентного белка Венеры сливается с интересующей мРНК , а комплементарный фрагмент Венеры сливается с РНК-связывающим белком.представляет интерес. Подобно BiFC, если мРНК и белок взаимодействуют, белок Венеры будет восстановлен и флуоресцирует. Также известный как метод РНК-мостика, поскольку флуорофор и другие взаимодействующие белки образуют мост между белком и интересующей РНК, это позволяет легко обнаруживать и локализовать взаимодействия РНК-белок в живой клетке и обеспечивает простой метод обнаружения прямая или непрямая ассоциация РНК-белок (т.е. внутри комплекса), которая может быть проверена посредством анализа очищенных соединений in vitro или путем нокдауна РНКи мостиковой молекулы (молекул). [19]

Организация путей и каскады передачи сигналов [ править ]

BiFC можно использовать для связывания генов друг с другом и их функции посредством измерения взаимодействий между белками, которые кодируют гены. [20] [21] Это приложение идеально подходит для новых генов, для которых мало что известно об их вышестоящих и нижних эффекторах , поскольку могут быть установлены новые связи между путями. Кроме того, эффекты лекарств, гормонов или делеции или нокдауна интересующего гена и последующие эффекты как на силу белок-белковых взаимодействий, так и на место взаимодействия можно наблюдать в течение нескольких секунд. [17] [18]

Комплексообразование в различных клеточных компартментах [ править ]

BiFC использовался для изучения ядерной транслокации через сложную локализацию, а также взаимодействий с участием интегральных мембранных белков . [8] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] » Таким образом, BiFC является важным инструментом в понимании локализации транскрипционных факторов в субклеточных компартментах.

Количественная оценка поверхностей взаимодействия белок-белок [ править ]

BiFC сочетается с проточной цитометрией (BiFC-FC). Это позволяет картировать поверхности взаимодействия белок-белок посредством введения сайт-направленных или случайных мутаций, которые влияют на образование комплексов. [2]

Сравнение с другими технологиями [ править ]

Большинство методов, используемых для изучения межбелковых взаимодействий, основаны на методах in vitro . К сожалению, изучение белков в искусственной системе вне их клеточного окружения сопряжено с рядом трудностей. Например, для этого может потребоваться удаление белков из их нормального клеточного окружения. Обработка, необходимая для выделения белка, может повлиять на его взаимодействие с другими белками. Кроме того, выделение белка из внутриклеточной передачи сигналов и механизмов, которые происходят в нормальной клетке, может дать ложную картину внутриклеточных и физиологических явлений. [1]Кроме того, белки, изученные in vitro, могут быть изучены при концентрациях, значительно отличающихся от их нормального уровня содержания, могут не обязательно эффективно транспортироваться в клетки или могут быть недостаточно селективными для функционирования в геноме хозяина. [38] [39] [40] [41] Наконец, изучая белки in vitro , невозможно определить влияние специфических межбелковых взаимодействий в клетке на функциональные или физиологические последствия.

Другие анализы in vivo, наиболее часто используемые для изучения межбелковых взаимодействий, включают флуоресцентный резонансный перенос энергии ( FRET ) и дрожжевой двухгибридный анализ ( Y2H ). Каждый из этих анализов имеет свои преимущества и недостатки по сравнению с BiFC:

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) [ править ]

Флуоресцентная резонансный перенос энергии ( FRET ), также известный как передачи Фёрстер энергии резонанса , резонансный перенос энергии ( RET ) или электронный перенос энергии ( EET ), основан на передаче энергии из возбужденного ( донора ) хромофор или флуорофоры (если хромофоры флуоресцентные) к ближайшему акцептору. В этом методе флуорофоры химически связаны или генетически слиты с двумя белками, которые предположительно взаимодействуют. Если белки взаимодействуют, это приведет к тому, что флуорофоры окажутся в непосредственной близости друг от друга. Если флуорофоры ориентированы таким образом, чтобы они открывали друг другу флуорофоры, что обычно обеспечивается при разработке и построении связи / слияния флуорофор-белок, то передача энергии от возбужденного донорного флуорофора приведет к изменению интенсивности флуоресценции или времени жизни. флуорофоров. [1] [13]

Дрожжи двугибридные (Y2H) [ править ]

Дрожжи дигибридный ( Y2H ) представляет собой генетический метод скрининга , который может быть использован для обнаружения физических (связывание) белок-белок или белок-ДНК взаимодействий. Обычно он применяется в модельных дрожжевых организмах Saccharomyces cerevisiae . Он тестирует белок-приманку с (неизвестной) функцией, который слит, например, с доменом связывания фактора транскрипции GAL4, против потенциально взаимодействующих белков или библиотеки кДНК, которые экспрессируют, например, домен активации GAL4 (' добыча'). [42] [43]

Сравнение технологий [ править ]

Технология сравненияСходство с BiFCПреимуществаНедостатки
FRETСпособность обнаруживать и определять местонахождение сайтов взаимодействия белков в живых клетках [13]Мгновенный мониторинг белковых взаимодействий в реальном времени
Это позволяет обнаруживать белки с короткоживущими ассоциациями. [16]

Обратимое взаимодействие флуорофора

Может быть обнаружена более сложная динамика взаимодействия (т.е. динамическое равновесие - непрерывное образование и диссоциация комплекса). [13] [14]
Близость к пространству [44]
Потенциально взаимодействующие белки должны быть близко друг к другу, обычно в пределах 60–100 Å, чтобы произошла передача энергии. Напротив, воссоздание флуорофора BiFC возможно на расстоянии более 7 нм и требует только того, чтобы связь между фрагментом флуорофора и представляющим интерес белком была достаточно гибкой, чтобы обеспечить ассоциацию. [16]

Пониженная чувствительность [44]

BiFC обычно более чувствителен из-за его стабильной белковой комплементации. Напротив, FRET вызывает фоновую флуоресценцию при возбуждении акцепторного флуорофора. Следовательно, необходимо проводить многочисленные контроли для количественной оценки изменения интенсивности флуоресценции в присутствии по сравнению с отсутствием передачи энергии между флуорофорами. Следовательно, с помощью FRET трудно обнаружить слабые взаимодействия.
FRET обычно требует более высоких уровней экспрессии генов для обнаружения передачи энергии, поскольку доля белков, которые образуют комплексы, должна быть достаточно высокой, чтобы вызвать заметное изменение интенсивности флуоресценции донора и акцептора.

Необратимое фотообесцвечивание [45] [46] [47]

Количественная оценка FRET требует необратимого фотообесцвечивания или визуализации продолжительности жизни флуоресценции с использованием инструментов, которые не являются широко доступными. Это усложняет процесс визуализации, так как флуоресценция со временем разрушается светом, необходимым для возбуждения флуорофоров.
FRET: взаимодействие между белком A и белком B объединяет два флуоресцентных белка, и происходит передача энергии между двумя флуоресцентными белками.
Y2HМетодика in vivo , используемая для выявления взаимодействийЭкран генетического взаимодействия
Y2H обеспечивает метод in vivo для изучения связывания фактора транскрипции на уровне последовательности в эукариотических клетках.
Предварительная связь между приманкой и добычей [13]
Связь между приманкой и добычей часто является условной и часто неоднозначной, поскольку изучение сверхэкспрессированных слитых белков в ядре дрожжей может привести к неспецифическим взаимодействиям и несовместимым системам (т.е. белки млекопитающих не всегда правильно экспрессируются в дрожжах. клетки, белки могут коэкспрессироваться неестественно).

Ошибочная активация транскрипции [13]

Репортерный ген может быть легко активирован транскрипцией, обеспечивая ложноположительное считывание взаимодействия белок-белок или белок-ДНК.

Генетическое дополнение [4] [5]

Различные аллели одного и того же гена могут привести к генетической комплементации, что приведет к неточным взаимодействиям белок-ДНК.

Дрожжи как модельный организм [48] [49]

Y2H имеет место в модельном организме Saccharomyces cerevisiae , что затрудняет тестирование белков других (недрожжевых) организмов, таких как растения, млекопитающие или организмы (например, Candida albicans ) с использованием кодонов, отличных от S. cerevisiae .

Сверхэкспрессия белков [15]

Y2H требует, чтобы белки были сверхэкспрессированы, что может исказить анализ данных, поскольку белки могут взаимодействовать с другими белками или ДНК при экспрессии на более высоком, чем обычно уровне, по сравнению с взаимодействиями, которые происходят на уровнях экспрессии эндогенных генов.

Ядерная локализация [15]

Y2H может использоваться только в ядре, где происходит активация транскрипции. Это одновременно удаляет белок из его физиологически релевантной среды, игнорируя роль нормального окружения белка во взаимодействиях с белками, и ограничивает обнаружение белками, которые активны в ядре.
Гибрид дрожжей-2: взаимодействие между протеином A и протеином B активирует транскрипцию

Ссылки [ править ]

  1. ^ a b c d e f g h i j k l m Kerppola, TK Разработка и реализация тестов бимолекулярной флуоресценции (BiFC) для визуализации белковых взаимодействий в живых клетках. Nat. Protoc. 1. С. 1278–1286 (2006).
  2. ^ a b c Морелл, М., Эспаргаро, А., Авилес, FX и Вентура, С. Изучение и выбор белковых взаимодействий in vivo путем сочетания бимолекулярной флуоресцентной комплементации и проточной цитометрии. Nat. Protoc. 3, 22–33 (2008).
  3. ^ Ричардс, FM по ферментативной активности субтилизин-модифицированной рибонуклеазы. Proc. Natl. Акад. Sci. USA 44, 162–166 (1958).
  4. ^ a b Ullmann, A., Jacob, F. и Monod, J. Характеристика путем комплементации in vitro пептида, соответствующего проксимальному к оператору сегменту структурного гена бета-галактозидазы Escherichia coli. J. Mol. Биол. 24. С. 339–343 (1967).
  5. ^ a b Ullmann, A., Jacob, F. и Monod, J. О структуре субъединиц дикого типа по сравнению с комплементированной бета-галактозидазой Escherichia coli. J. Mol. Биол. 32, 1–13 (1968).
  6. ^ Джонссон, Н. и Варшавский, А. Сплит убиквитин как датчик взаимодействия белков in vivo. Proc. Natl. Акад. Sci. USA 91, 10340-10344 (1994).
  7. ^ a b c Гош, И., Гамильтон, А.Д. и Реган, Л. Антипараллельная сборка белка, направленного на лейциновую молнию: применение к зеленому флуоресцентному белку. Журнал Американского химического общества 122, 5658 (2000).
  8. ^ a b c d e f g h i j k l Hu, CD, Chinenov, Y. & Kerppola, TK Визуализация взаимодействий между белками семейства bZIP и Rel в живых клетках с использованием бимолекулярной флуоресцентной комплементации. Мол. Cell 9, 789–798 (2002).
  9. ^ Цзянь, Р.Ю. Зеленый флуоресцентный белок. Анну. Rev. Biochem. 67, 509–544 (1998).
  10. ^ a b c d e f g h "Лаборатория Керпполы" .
  11. ^ а б Керппола, Т.К. Дополнительные методы исследования взаимодействия белков в живых клетках. Nat. Методы 3, 969–971 (2006).
  12. ^ a b c d e f g Hu, CD & Kerppola, TK Одновременная визуализация множественных белковых взаимодействий в живых клетках с использованием многоцветного флуоресцентного анализа комплементации. Nat. Biotechnol. 21. С. 539–545 (2003).
  13. ^ a b c d e f g h Морелл М. и др. Мониторинг интерференции белок-белковых взаимодействий in vivo с помощью комплементации бимолекулярной флуоресценции: случай DnaK. Протеомика 8, 3433–3442 (2008).
  14. ^ a b c Kerppola, Т.К. Анализ комплементации бимолекулярной флуоресценции (BiFC) как проба взаимодействия белков в живых клетках. Анну. Rev. Biophys. 37, 465–487 (2008).
  15. ^ а б в г http://www.vanderbilt.edu/cbi
  16. ^ a b c d Fan, JY et al. Split mCherry как новая система комплементации красной бимолекулярной флуоресценции для визуализации белок-белковых взаимодействий в живых клетках. Биохим. Биофиз. Res. Commun. 367, 47–53 (2008).
  17. ^ a b Michnick, SW, Ear, PH, Manderson, EN, Remy, I. & Stefan, E. Универсальные стратегии исследований и открытия лекарств, основанные на анализах комплементации фрагментов белков. Nat. Rev. Drug Discov. 6. С. 569–582 (2007).
  18. ^ а б в Макдональд, М.Л. и др. Выявление нецелевых эффектов и скрытых фенотипов лекарств в клетках человека. Nat. Chem. Биол. 2, 329–337 (2006).
  19. ^ a b c Rackham, O. & Brown, CM Визуализация взаимодействий РНК-белок в живых клетках: FMRP и IMP1 взаимодействуют на мРНК. EMBO J. 23, 3346–3355 (2004).
  20. ^ a b Реми, И., Уилсон, И.А., Мичник, С.В. Активация рецептора эритропоэтина изменением конформации, вызванным лигандом. Science 283, 990–993 (1999).
  21. ^ a b Реми, И., Монмаркет, А. и Мичник, SW PKB / Akt модулирует передачу сигналов TGF-бета посредством прямого взаимодействия с Smad3. Nat. Cell Biol. 6. С. 358–365 (2004).
  22. ^ Magliery, TJ et al. Обнаружение белок-белковых взаимодействий с помощью ловушки для повторной сборки фрагментов зеленого флуоресцентного белка: объем и механизм. Варенье. Chem. Soc. 127, 146–157 (2005).
  23. ^ Чен, Хонг; Видмер, Стефани; Ханиг, Саша; Энцерот, Рольф; Курт, Майкл (2013). "Развитие Eimeria nieschulzi (Coccidia, Apicomplexa) гамонтов и ооцист в первичных фетальных клетках крыс" . Журнал паразитологических исследований . 2013 : 591520. дои : 10,1155 / 2013/591520 . PMC 3703804 . PMID 23862053 .  
  24. ^ Kerppola, Том K (2008). «АНАЛИЗ БИМОЛЕКУЛЯРНОЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ КОМПЛЕМЕНТАЦИИ (BiFC) КАК ЗОНД ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ БЕЛКОВ В ЖИВЫХ КЛЕТКАХ» . Ежегодный обзор биофизики . 37 : 465–87. DOI : 10.1146 / annurev.biophys.37.032807.125842 . PMC 2829326 . PMID 18573091 .  
  25. ^ Вареа, М; Клавель, А; Дойз, О; Castillo, FJ; Рубио, MC; Гомес-Лус, Р. (1 декабря 1998 г.). «Флуоресценция и аутофлуоресценция фуксина в ооцистах Cryptosporidium, Isospora и Cyclospora». Международный журнал паразитологии . 28 (12): 1881–1883. DOI : 10.1016 / S0020-7519 (98) 00146-5 . ISSN 0020-7519 . PMID 9925267 .  
  26. ^ Суботич, Ана; Суиннен, Эрвин; Демуайзер, Лисбет; Де Кеерсмакер, Херлинде; Мизуно, Хидеаки; Турну, Элен; Ван Дейк, Патрик (2017). «Инструмент комплементации бимолекулярной флуоресценции для идентификации белок-белковых взаимодействий у Candida albicans» . G3: Гены, геномы, генетика . 7 (10): 3509–3520. DOI : 10,1534 / g3.117.300149 . PMC 5633398 . PMID 28860184 .  
  27. ^ Диас, Джакомо; Полонелли, Лучано; Конти, Стефания; Мессана, Ирэн; Кабрас, Тициана; Путцолу, Мартина; Фальчи, Анджела Мария; Фадда, Мария Элизабетта; Косентино, София; Изола, Рафаэлла (2005). «Митохондриальные изменения и аутофлуоресцентное преобразование Candida albicans, вызванные гистатинами». Микроскопические исследования и техника . 66 (5): 219–28. DOI : 10.1002 / jemt.20161 . PMID 15940680 . 
  28. ^ Шарма, Химаншу; Ананд, Баскаран (7 июля 2016 г.). «Флуоресцентная бимолекулярная комплементация позволяет легко обнаруживать дефекты сборки рибосом у Escherichia coli» . Биология РНК . 13 (9): 872–882. DOI : 10.1080 / 15476286.2016.1207037 . PMC 5014008 . PMID 27388791 .  
  29. ^ Jach, G .; Pesch, M .; Richter, K .; Frings, S .; Uhrig, JF. Улучшенный mRFP1 добавляет красный цвет к комплементации бимолекулярной флуоресценции. Nat. Методы. 3, 597–600 (2006)
  30. ^ Shyu, YJ, Liu, H., Deng, X., Hu, CD. Идентификация новых фрагментов флуоресцентного белка для анализа комплементации бимолекулярной флуоресценции в физиологических условиях. Биотехнологии. 40, 61–66 (2006).
  31. ^ de Virgilio, M., Kiosses, WB & Shattil, SJ Проксимальные, селективные и динамические взаимодействия между интегрином alphaIIbbeta3 и протеинтирозинкиназами в живых клетках. J. Cell Biol. 165, 305–311 (2004).
  32. ^ Тонг, Э. Х. и др. Регуляция ядерно-цитоплазматического переноса транскрипционного фактора OREBP / TonEBP / NFAT5. J. Biol. Chem. 281, 23870-23879 (2006).
  33. ^ Lopez-Gimenez, JF, Canals, M., Pediani, JD & Milligan, G. Альфа1b-адренорецептор существует как олигомер более высокого порядка: эффективная олигомеризация необходима для созревания рецептора, доставки на поверхность и функции. Мол. Pharmacol. 71, 1015–1029 (2007).
  34. ^ Накахара, С., Хоган, В., Инохара, Х. и Раз, А. Импортин-опосредованная ядерная транслокация галектина-3. J. Biol. Chem. 281, 39649-39659 (2006).
  35. ^ Лю, Х. и др. Взаимная регуляция c-Jun и ATF2 посредством активации транскрипции и субклеточной локализации. EMBO J. 25, 1058–1069 (2006).
  36. ^ Gwozdz, T.др. EcR и Usp, компоненты комплекса ядерных рецепторов экдистероидов, обнаруживают дифференциальное распределение молекулярных детерминант, управляющих субклеточным трафиком. Клетка. Сигнал. 19, 490–503 (2007).
  37. ^ Fan, M., Ahmed, KM, Coleman, MC, Spitz, DR & Li, JJ Ядерный фактор-kappaB и супероксиддисмутаза марганца опосредуют адаптивную радиорезистентность в эпителиальных клетках кожи мышей, облученных низкими дозами. Cancer Res. 67, 3220–3228 (2007).
  38. ^ Ву, П., Даниэль-Иссакани, С., ЛаМарко, К. и Струловичи, Б. Автоматический анализ фильтрации с высокой пропускной способностью: применение для идентификации ингибитора полимеразы. Анальный. Биохим. 245, 226–230 (1997).
  39. ^ Stoevesandt, O. & Brock, R. Одностадийный анализ белковых комплексов в микролитрах клеточного лизата с использованием непрямой иммуномаркировки и кросс-корреляционной спектроскопии флуоресценции. Nat. Protoc. 1. С. 223–229 (2006).
  40. ^ Bergendahl, V., Heyduk, T. & Burgess, RR Люминесцентный резонансный перенос энергии, основанный на высокопроизводительном скрининговом анализе ингибиторов основных белок-белковых взаимодействий в бактериальной РНК-полимеразе. Прил. Environ. Microbiol. 69, 1492–1498 (2003).
  41. ^ Ян, П. и др. Мультиплексное определение белок-пептидного взаимодействия и ингибирование с помощью капиллярного электрофореза. Анальный. Chem. 79, 1690–1695 (2007).
  42. ^ Филдс, С. & Сонг, О. Новая генетическая система для обнаружения белок-белковых взаимодействий. Nature 340, 245–246 (1989).
  43. ^ Stynen, B; Tournu, H; Тавернье, Дж; Ван Дейк, П. (июнь 2012 г.). «Разнообразие генетических методов in vivo для изучения взаимодействия белок-белок: от дрожжевой двугибридной системы до сплит-люциферазной системы млекопитающих» . Обзоры микробиологии и молекулярной биологии . 76 (2): 331–82. DOI : 10.1128 / MMBR.05021-11 . PMC 3372256 . PMID 22688816 .  
  44. ^ а б Керппола, Т.К. Визуализация молекулярных взаимодействий с помощью флуоресцентной комплементации. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7. С. 449–456 (2006).
  45. ^ Creemers, TM, Lock, AJ, Subramaniam, V., Jovin, TM и Volker, S. Фотофизика и оптическое переключение в зеленых флуоресцентных мутантах белка. Proc. Natl. Акад. Sci. USA 97, 2974–2978 (2000).
  46. ^ Терских, А. и др. «Флуоресцентный таймер»: белок, меняющий цвет со временем. Science 290, 1585–1588 (2000).
  47. ^ van Thor, JJ, Gensch, T., Hellingwerf, KJ & Johnson, LN Фототрансформация зеленого флуоресцентного белка с помощью УФ и видимого света приводит к декарбоксилированию глутамата 222. Nat. Struct. Биол. 9. С. 37–41 (2002).
  48. ^ Stynen, B; Tournu, H; Тавернье, Дж; Ван Дейк, П. (июнь 2012 г.). «Разнообразие генетических методов in vivo для изучения взаимодействия белок-белок: от дрожжевой двугибридной системы до сплит-люциферазной системы млекопитающих» . Обзоры микробиологии и молекулярной биологии . 76 (2): 331–82. DOI : 10.1128 / MMBR.05021-11 . PMC 3372256 . PMID 22688816 .  
  49. ^ Schoeters, F; Ван Дейк, П. (2019). «Белково-белковые взаимодействия в Candida albicans » . Границы микробиологии . 10 : 1792 DOI : 10,3389 / fmicb.2019.01792 . PMC 6693483 . PMID 31440220 .  

Внешние ссылки [ править ]

  • Лаборатория Kerppola онлайн - BiFC
  • Презентация д-ра CD Ху - Комплементация бимолекулярной флуоресценции (BiFC): принципы и применение