Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Проточной цитометрии
FACS-buisje.JPG
Пробирка для проточного цитометра с трубочкой для всасывания
КлассификацияЦитометрия
АналитыКлетки или частицы
Другие техники
СвязанныйСчетчик сошников

Проточная цитометрия (FC) - это метод, используемый для обнаружения и измерения физических и химических характеристик популяции клеток или частиц. [1] [2] [3] [4]

В этом процессе образец, содержащий клетки или частицы, суспендируется в жидкости и вводится в проточный цитометр. Образец фокусируется так, чтобы идеально пропускать одну ячейку за раз через лазерный луч, при этом рассеянный свет характерен для ячеек и их компонентов. Клетки часто маркируются флуоресцентными маркерами, поэтому свет поглощается, а затем излучается в диапазоне длин волн. Десятки тысяч ячеек могут быть быстро исследованы, а собранные данные обрабатываются компьютером.

Проточная цитометрия обычно используется в фундаментальных исследованиях, клинической практике и клинических испытаниях . Использование проточной цитометрии включает:

Анализатор проточной цитометрии - это инструмент, который предоставляет количественные данные по образцу. Другие инструменты, использующие проточную цитометрию, включают сортировщики клеток, которые физически разделяют и, таким образом, очищают интересующие клетки на основе их оптических свойств.

История [ править ]

Первое устройство проточной цитометрии на основе импеданса , использующее принцип Коултера , было раскрыто в патенте США 2656508, выданном в 1953 году Уоллесу Х. Коултеру . Мак Фулвайлер был изобретателем предшественников современных проточных цитометров, особенно сортировщика клеток. [5] Фулвайлер разработал это в 1965 году в своей публикации в Science . [6] Первое устройство проточной цитометрии на основе флуоресценции (ICP 11) было разработано в 1968 году Вольфгангом Гёде из Университета Мюнстера , подано на патент 18 декабря 1968 года [7] и впервые введено в продажу в 1968/69 немецким разработчиком и производителем. Partec через Phywe AG в Геттингене. В то время другие ученые все еще отдавали предпочтение абсорбционным методам перед флуоресцентными . [8] Вскоре после этого были разработаны инструменты для проточной цитометрии, включая Cytofluorograph (1971) от Bio / Physics Systems Inc. (позже: Ortho Diagnostics), PAS 8000 (1973) от Partec, первый FACS (сортировка клеток с активацией флуоресценции) ) инструмент от Becton Dickinson (1974), ICP 22 (1975) от Partec / Phywe и Epics от Coulter (1977/78). Первый проточный высокочастотный импедансный цитометр без этикеток, основанный на запатентованной микрожидкостной «лаборатории на чипе», Ampha Z30, был представлен Amphasys (2012). [ необходима цитата ]

Название технологии [ править ]

Первоначальное название технологии проточной цитометрии на основе флуоресценции было «импульсная цитофотометрия» ( немецкий язык : Impulszytophotometrie ), основанное на первой заявке на патент на проточную цитометрию на основе флуоресценции. На 5-й конференции Американского инженерного фонда по автоматизированной цитологии в Пенсаколе (Флорида) в 1976 году - через восемь лет после появления первого проточного цитометра на основе флуоресценции (1968) - было решено использовать название «проточная цитометрия», термин это быстро стало популярным. [9]

Дополнительные исторические сведения см . В разделе цитометрия .

Проточные цитометры [ править ]

Принципиальная схема проточного цитометра, от фокусировки оболочки до сбора данных.

Современные проточные цитометры способны анализировать многие тысячи частиц в секунду в «реальном времени» и, если они настроены как сортировщики клеток, могут активно разделять и изолировать частицы с заданными оптическими свойствами с аналогичной скоростью. Проточный цитометр похож на микроскоп , за исключением того, что вместо получения изображения клетки проточная цитометрия предлагает высокопроизводительную автоматическую количественную оценку определенных оптических параметров для каждой клетки. Для анализа твердых тканей сначала необходимо приготовить одноклеточную суспензию.

Проточный цитометр состоит из пяти основных компонентов: проточной ячейки, измерительной системы, детектора, системы усиления и компьютера для анализа сигналов. Проточная ячейка имеет поток жидкости (жидкость оболочки), которая переносит и выравнивает ячейки так, что они проходят через световой луч одним файлом для измерения. В измерительной системе обычно используются измерения импеданса (или проводимости) и оптические системы - лампы ( ртутные , ксеноновые ); мощные лазеры с водяным охлаждением ( аргон , криптон , лазер на красителях); маломощные лазеры с воздушным охлаждением (аргон (488 нм), красный-HeNe (633 нм), зеленый-HeNe, HeCd (УФ)); диодные лазеры(синий, зеленый, красный, фиолетовый), что приводит к световым сигналам. Детектор и система аналого-цифрового преобразования (ADC) преобразует аналоговые измерения прямого рассеянного света (FSC) и бокового рассеянного света (SSC), а также сигналов флуоресценции, специфичных для красителя, в цифровые сигналы, которые могут обрабатываться компьютером. . Система усиления может быть линейной или логарифмической .

Процесс сбора данных из образцов с помощью проточного цитометра называется «сбором». Сбор данных опосредуется компьютером, физически подключенным к проточному цитометру, и программным обеспечением, которое обеспечивает цифровой интерфейс с цитометром. Программное обеспечение способно регулировать параметры (например, напряжение, компенсацию) для испытуемого образца, а также помогает отображать исходную информацию об образце при сборе данных об образце, чтобы гарантировать правильность установки параметров. Ранние проточные цитометры были, как правило, экспериментальными устройствами, но технический прогресс позволил широко использовать их в различных клинических и исследовательских целях. Благодаря этим разработкам появился значительный рынок контрольно-измерительных приборов, программного обеспечения для анализа, а также реагентов, используемых при приобретении, таких как были разработаны флуоресцентно меченые антитела .

Современные инструменты обычно имеют несколько лазеров и детекторов флуоресценции. Текущий рекорд для коммерческого прибора - десять лазеров [10] и 30 детекторов флуоресценции. [11] Увеличение количества лазеров и детекторов позволяет метить множественные антитела и может более точно идентифицировать целевую популяцию по их фенотипическим маркерам. Некоторые инструменты могут даже делать цифровые изображения отдельных клеток, что позволяет анализировать расположение флуоресцентного сигнала внутри или на поверхности клеток.

Оборудование [ править ]

Система флюидики проточного цитометра [ править ]

Клетки должны равномерно проходить через центр сфокусированных лазерных лучей для точного измерения оптических свойств клеток в любом проточном цитометре. [12] [13] [14] Целью жидкостной системы является перемещение ячеек одна за другой через луч лазера и через инструмент. Гидравлические системы в проточном цитометре с возможностью сортировки клеток также используют поток для переноса отсортированных клеток в пробирки или лунки для сбора. [12]

Гидродинамическая фокусировка [ править ]

Основная статья: Гидродинамическая фокусировка

Для точного позиционирования клеток в струе жидкости в большинстве цитометров используется гидродинамическая фокусировка. [12] [13] [14] Клетки в суспензии попадают в инструмент, заключенный во внешнюю оболочку жидкости. Образец керна поддерживается в центре жидкости оболочки. Скорость ввода пробы или скорость потока клеток через лазерный запрос можно контролировать с помощью давления жидкости оболочки на керне пробы. В оптимальных условиях центральный поток жидкости и жидкость оболочки не смешиваются.

Гидродинамическая фокусировка с акустической системой [ править ]

Технология акустической фокусировки используется в некоторых проточных цитометрах для поддержки гидродинамической фокусировки. [12] [14] Акустические волны (> 2 МГц) предварительно фокусируют образец перед введением в оболочку жидкости. Затем предварительно сфокусированный образец вводится в гидродинамическое ядро ​​и пропускается через инструмент. Это может помочь повысить точность данных при высокой частоте дискретизации.

Оптика и электроника [ править ]

Оптические фильтры [ править ]

Свет, излучаемый флуорофором, находится в спектре длин волн, поэтому сочетание нескольких флуорофоров может вызвать перекрытие. Чтобы добавить специфичности, используются оптические фильтры и дихроичные зеркала для фильтрации и перемещения света к детекторам, таким как фотоумножители (ФЭУ) или лавинные фотодиоды (ЛФД). [12] Оптические фильтры разработаны как полосовые (BP), длинные (LP) или короткие (SP) фильтры. В большинстве проточных цитометров используются дихроичные зеркала и полосовые фильтры для выбора определенных полос оптического спектра.

Призмы, решетки и спектральная проточная цитометрия [ править ]

В спектральной проточной цитометрии используются призмы или дифракционные решетки для рассеивания излучаемого света маркера по матрице детекторов. [12] [15] Это позволяет измерять полный спектр каждой частицы. Затем измеренные спектры отдельных клеток не смешиваются с использованием эталонных спектров всех используемых красителей и спектра автофлуоресценции. Это может позволить расширить дизайн панели и применить новые биологические маркеры.

Визуализирующая проточная цитометрия [ править ]

Проточная цитометрия с визуализацией (IFC) захватывает многоканальные изображения клеток. [12] [16] Детекторы, используемые в платформах визуализации, могут быть оснащены устройством с зарядовой связью (ПЗС) или дополнительным металлооксидным полупроводником (КМОП) для захвата изображений отдельных клеток.

Анализ данных [ править ]

Основная статья: Биоинформатика проточной цитометрии

Компенсация [ править ]

Основная статья: Компенсация (цитометрия)

Каждый флуорохром имеет широкий спектр флуоресценции. Когда используется более одного флуорохрома, может происходить перекрытие между флуорохромами. Эта ситуация называется перекрытием спектра. Эту ситуацию необходимо преодолеть. Например, спектр излучения для FITC и PE таков, что свет, излучаемый флуоресцеином, перекрывает ту же длину волны, что и проходит через фильтр, используемый для PE. Это спектральное перекрытие корректируется путем удаления части сигнала FITC из сигналов PE или наоборот. Этот процесс называется компенсацией цвета, при котором флуорохром вычисляется в процентах для измерения самого себя. [17]

Компенсация - это математический процесс, с помощью которого корректируется спектральное перекрытие данных многопараметрической проточной цитометрии. Поскольку флуорохромы могут иметь широкий диапазон спектра, они могут перекрываться, вызывая нежелательный результат путаницы при анализе данных. Это перекрытие, известное как вторичный эффект и количественно выражаемое в коэффициенте перелива, обычно вызывается детекторами определенного флуорохрома, измеряющими значимый пик длины волны другого флуорохрома. Чаще всего для этого используется линейная алгебра. [17]

В общем, когда отображаются графики одного или нескольких параметров, это означает, что другие параметры не влияют на показанное распределение. Эта проблема более серьезна, особенно при использовании параметров, превышающих вдвое. В настоящее время не обнаружено инструментов для эффективного отображения многомерных параметров. Компенсация очень важна, чтобы видеть разницу между клетками.

Анализ морского образца фотосинтетического пикопланктона с помощью проточной цитометрии, показывающий три разные популяции ( Prochlorococcus , Synechococcus и picoeukaryotes )

Gating [ править ]

Данные, полученные с помощью проточных цитометров, можно отобразить в одном измерении , чтобы получить гистограмму , или в виде двухмерных точечных диаграмм, или даже в трех измерениях. Области на этих графиках могут быть последовательно разделены на основе интенсивности флуоресценции путем создания серии выделений подмножества, называемых «воротами». Существуют специальные протоколы стробирования для диагностических и клинических целей, особенно в отношении гематологии . Отдельные одиночные клетки часто отличаются от дублетов клеток или более высоких агрегатов по их «времени пролета» (обозначаемому также как «ширина импульса») через узко сфокусированный лазерный луч [18]

Графики часто строятся в логарифмических масштабах. Поскольку спектры излучения различных флуоресцентных красителей перекрываются, [19] [20] сигналы на детекторах необходимо компенсировать как электронным, так и вычислительным способом. Данные, накопленные с помощью проточного цитометра, можно анализировать с помощью программного обеспечения. После сбора данных нет необходимости оставаться подключенным к проточному цитометру, и анализ чаще всего выполняется на отдельном компьютере. [ необходима цитата ] Это особенно необходимо на основных предприятиях, где использование этих машин пользуется большим спросом. [ необходима цитата ]

Вычислительный анализ [ править ]

Недавний прогресс в автоматизированной идентификации населения с использованием вычислительных методов предложил альтернативу традиционным стратегиям стробирования. Автоматизированные системы идентификации потенциально могут помочь в обнаружении редких и скрытых популяций. Типичные автоматизированные методы включают FLOCK [21] в базе данных иммунологии и портале анализа (ImmPort), [22] SamSPECTRAL [23] и flowClust [24] [25] [26] в Bioconductor и FLAME [27] в GenePattern.. T-распределенное стохастическое соседнее встраивание (tSNE) - это алгоритм, предназначенный для уменьшения размерности, чтобы обеспечить визуализацию сложных многомерных данных на двухмерной «карте». [28] Совместные усилия привели к открытому проекту под названием FlowCAP (Flow Cytometry: Critical Assessment of Population Identification Methods, [29] ), чтобы предоставить объективный способ сравнения и оценки методов кластеризации данных проточной цитометрии, а также разработать руководство по надлежащее использование и применение этих методов.

FMO контролирует [ править ]

Контроль флуоресценции минус один (FMO) важен для интерпретации данных при построении многоцветных панелей, на которых клетка окрашивается несколькими флуорохромами одновременно. Элементы управления FMO обеспечивают измерение перелива флуоресценции в заданном канале и позволяют выполнять компенсацию. Чтобы создать контроль FMO, образец окрашивают всеми флуорохромами, кроме того, который исследуется - это означает, что если вы используете 4 разных флуорохромы, ваш контроль FMO должен содержать только 3 из них (например: флуорохромы - A, B, C, D; FMOs - ABC_, AB_D, A_CD, _BCD).

Сортировка клеток с помощью проточной цитометрии [ править ]

Сортировка клеток - это метод очистки популяций клеток на основе наличия или отсутствия определенных физических характеристик. [12] [14] [30] В проточных цитометрах с возможностью сортировки прибор выявляет клетки, используя параметры, включая размер клеток, морфологию и экспрессию белка, а затем капельную технологию для сортировки клеток и извлечения подмножеств для пост-экспериментального использования. [12] [14]

Первый прототип сортировщика был построен в Лос-Аламосской национальной лаборатории (LANL) в 1965 году физиком Маком Дж. Фулвайлером путем соединения датчика объема Коултера с недавно изобретенным струйным принтером. [31] Сортировщик живых клеток или сортировщик активируемых флуоресценцией клеток (FACS) [a] был разработан Леном Герценбергом , который впоследствии получил Киотскую премию в 2006 году за свою основополагающую работу. [33]

Сортировка клеток с использованием проточной цитометрии и капельной технологии

Сортировщики клеток для проточной цитометрии имеют систему сбора, в отличие от анализаторов для проточной цитометрии. Процесс сбора начинается, когда образец вводится в поток жидкости оболочки, который проходит через проточную кювету и перекрывается лазером. [34]  Затем поток переносит ячейку через вибрирующее сопло, которое генерирует капли, большинство из которых содержат либо одну ячейку, либо не содержат ячеек. Электрическое зарядное кольцо помещается как раз в том месте, где поток разделяется на капли, и заряд помещается на кольцо непосредственно перед измерением интенсивности флуоресценции; противоположный заряд удерживается на капле, когда она отрывается от потока, и поэтому капли заряжаются. Затем заряженные капли падают из-за электростатического отклонения.система, которая отводит капли в контейнеры в зависимости от их заряда. В некоторых системах заряд прикладывается непосредственно к потоку, и при отрыве капли сохраняется заряд того же знака, что и у потока. Затем поток возвращается в нейтральное состояние после отрыва капли. После сбора эти клетки можно культивировать, обрабатывать и изучать.

Ярлыки [ править ]

Использование проточной цитометрии для измерения вариации числа копий конкретной последовательности ДНК ( Flow-FISH )

Проточная цитометрия использует световые свойства, рассеянные от клеток или частиц, для идентификации или количественного измерения физических свойств. Этикетки, красители и пятна можно использовать для многопараметрического анализа (узнайте больше о свойствах клетки). Иммунофенотипирование - это анализ гетерогенных популяций клеток с использованием меченых антител [35] и других реагентов, содержащих флуорофор, таких как красители и красители.

Флуоресцентные метки [ править ]

Основная статья: Флуорофор

Широкий спектр флуорофоров можно использовать в качестве меток в проточной цитометрии. [19] Флуорофоры, или просто «флюоры» [ необходима цитата ] , обычно присоединяются к антителу, которое распознает объект-мишень на или в клетке; они также могут быть присоединены к химическому соединению со сродством к клеточной мембране или другой клеточной структуре. Каждый флуорофор имеет характерную максимальную длину волны возбуждения и излучения , и спектры излучения часто перекрываются. Следовательно, комбинация этикеток, которую можно использовать, зависит от длины волны лампы (ламп) или лазера (ов), используемых для возбуждения флуорохромов, и от доступных детекторов. [36]Предполагается, что максимальное количество различимых флуоресцентных меток составляет 17 или 18, и этот уровень сложности требует трудоемкой оптимизации для ограничения артефактов, а также сложных алгоритмов деконволюции для разделения перекрывающихся спектров. [37] Проточная цитометрия использует флуоресценцию как количественный инструмент; максимальная чувствительность проточной цитометрии не имеет себе равных среди других платформ флуоресцентного обнаружения, таких как конфокальная микроскопия . Абсолютная чувствительность к флуоресценции в конфокальной микроскопии обычно ниже.потому что расфокусированные сигналы отклоняются конфокальной оптической системой и потому что изображение создается последовательно из отдельных измерений в каждом месте ячейки, сокращая количество времени, доступное для сбора сигнала. [38]

Квантовые точки [ править ]

Квантовые точки иногда используются вместо традиционных флуорофоров из-за их более узких пиков излучения.

Маркировка изотопов [ править ]

Основная статья: Массовая цитометрия

Массовая цитометрия преодолевает предел флуоресцентного мечения за счет использования изотопов лантаноидов, прикрепленных к антителам. Теоретически этот метод может позволить использовать от 40 до 60 различимых этикеток и был продемонстрирован для 30 этикеток. [37] Массовая цитометрия принципиально отличается от проточной цитометрии: клетки вводятся в плазму , ионизируются, а связанные изотопы количественно оцениваются с помощью времяпролетной масс-спектрометрии . Хотя этот метод позволяет использовать большое количество меток, в настоящее время он имеет меньшую пропускную способность, чем проточная цитометрия. Он также разрушает анализируемые клетки, препятствуя их восстановлению путем сортировки. [37]

Цитометрический набор шариков [ править ]

Помимо способности маркировать и идентифицировать отдельные клетки с помощью флуоресцентных антител, также можно измерять клеточные продукты, такие как цитокины, белки и другие факторы. Подобно сэндвич-анализам ELISA , матрица цитометрических шариков ( CBA) в анализах используются несколько популяций шариков, которые обычно различаются по размеру и разным уровням интенсивности флуоресценции, чтобы различать несколько аналитов в одном анализе. Количество захваченного аналита определяется с помощью биотинилированного антитела против вторичного эпитопа белка с последующей обработкой стрептавидин-R-фикоэритрином. Интенсивность флуоресценции R-фикоэритрина на гранулах количественно определяют на проточном цитометре, оборудованном источником возбуждения 488 нм. Концентрации представляющего интерес белка в образцах могут быть получены путем сравнения флуоресцентных сигналов с сигналами стандартной кривой, полученными при серийном разведении известной концентрации аналита. Обычно также называют набором гранул цитокинов (CBA).

Проточная цитометрия с импедансом [ править ]

Системы анализа отдельных ячеек на основе импеданса широко известны как счетчики Коултера . Они представляют собой хорошо зарекомендовавший себя метод подсчета и определения размеров практически любых клеток и частиц. Технология без этикеток недавно была усовершенствована за счет подхода « лаборатория на кристалле » и применения высокочастотного переменного тока (AC) в радиочастотном диапазоне (от 100 кГц до 30 МГц) вместо статического постоянного тока. ток (постоянный ток) или низкочастотное поле переменного тока. [39] [40] Эта запатентованная технология позволяет проводить высокоточный анализ клеток и предоставляет дополнительную информацию, такую ​​как емкость и жизнеспособность мембраны.. Относительно небольшой размер и надежность позволяют использовать аккумуляторную батарею на объекте в полевых условиях.

Измеряемые параметры [ править ]

  • Апоптоз (количественная оценка, измерение деградации ДНК, потенциал митохондриальной мембраны, изменения проницаемости, активность каспазы )
  • Адгезия клеток (например, адгезия патоген-хозяин)
  • Клеточные пигменты, такие как хлорофилл или фикоэритрин
  • Антигены клеточной поверхности ( маркеры кластера дифференцировки (CD))
  • Жизнеспособность клеток
  • Циркулирующие опухолевые клетки : выделение и очистка
  • Характеристика множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) раковых клеток
  • Хромосомный анализ и сортировка (построение библиотеки, раскраска хромосом)
  • Вариация количества копий ДНК (по технологии Flow-FISH или BACs-on-Beads)
  • Ферментативная активность
  • Глутатион
  • Внутриклеточные антигены (различные цитокины , вторичные медиаторы и др.)
  • Текучесть мембраны
  • Контроль электропроницаемости клеток
  • Ядерные антигены
  • Окислительный взрыв
  • pH , внутриклеточный ионизированный кальций , магний , мембранный потенциал
  • Экспрессия и локализация белка
  • Модификации белков, фосфопротеины
  • Рассеяние света можно использовать для измерения объема (за счет прямого рассеяния ) и морфологической сложности (за счет бокового рассеяния) клеток или других частиц, даже тех, которые не являются флуоресцентными. Условно они обозначаются как FSC и SSC соответственно.
  • Общее содержание ДНК ( анализ клеточного цикла , кинетика клеток , пролиферация , плоидность , анеуплоидия , эндоредупликация и т. Д.)
  • Общее содержание РНК
  • Трансгенные продукты in vivo , особенно зеленый флуоресцентный белок или родственные флуоресцентные белки
  • Различные комбинации (ДНК / поверхностные антигены и т. Д.)

Приложения [ править ]

Эта технология находит применение во многих областях, включая молекулярную биологию , патологию , иммунологию , вирусологию [41], биологию растений и морскую биологию . [42] Он имеет широкое применение в медицине, особенно в трансплантации, гематологии, иммунологии опухолей и химиотерапии, пренатальной диагностике, генетике и сортировке сперматозоидов для предварительного выбора пола . Проточная цитометрия широко применяется для обнаружения аномалий сперматозоидов, связанных с фрагментацией ДНК [43], в анализах мужской фертильности . [44]Кроме того, он широко используется в исследованиях для обнаружения повреждений ДНК , [45] [46] расщепления каспаз и апоптоза . [47] Фотоакустическая проточная цитометрия используется при исследовании бактерий с множественной лекарственной устойчивостью (чаще всего MRSA) для обнаружения, дифференциации и количественного определения бактерий в крови, отмеченных окрашенными бактериофагами. [48] В нейробиологии также может быть проанализирована совместная экспрессия поверхностных и внутриклеточных антигенов. [49] В морской биологии автофлуоресцентные свойства фотосинтетического планктонаможет быть использован с помощью проточной цитометрии для характеристики численности и структуры сообщества. В микробиологии его можно использовать для скрининга и сортировки мутантных библиотек транспозонов, созданных с помощью транспозонов, кодирующих GFP (TnMHA) [50], или для оценки жизнеспособности. [51] В белковой инженерии проточная цитометрия используется в сочетании с дрожжевым дисплеем и бактериальным дисплеем.идентифицировать варианты белка с желаемыми свойствами, отображаемые на клеточной поверхности. Основное преимущество проточной цитометрии перед гистологией и ИГХ - это возможность точно измерить количество антигенов и возможность окрашивать каждую клетку множеством антител-флуорофоров, в современных лабораториях с каждой клеткой может быть связано около 10 антител. Это намного меньше, чем массовый цитометр, где в настоящее время можно измерить до 40, но по более высокой цене и медленнее.

Протоколы проточной цитометрии, используемые для исследований, часто нуждаются в валидации из-за риска связывания антител с рецепторами Fc. [52]

Анализ CFSE [ править ]

Клеточная пролиферация - основная функция иммунной системы. Часто требуется проанализировать пролиферативную природу клеток, чтобы сделать какие-то выводы. Одним из таких анализов для определения пролиферации клеток является отслеживающий краситель карбоксифлуоресцеиндиацетат сукцинимидиловый эфир (CFSE). Это помогает контролировать пролиферативные клетки. Этот анализ дает количественные, а также качественные данные во время экспериментов с временными рядами. [53] Этот краситель ковалентно связывается с долгоживущими молекулами внутри клетки. Когда клетки делятся, делятся и молекулы, и дочерние клетки обладают половиной красителя, чем родительская популяция. Это снижение интенсивности можно визуализировать с помощью проточной цитометрии. [54] В литературе этот мощный метод проточной цитометрии и CFSE использовался для определения эффективности Т-клеток в уничтожении клеток-мишеней при раке, таком как лейкемия. Чтобы визуализировать гибель клеток-мишеней, как быструю, так и медленную, ученые использовали метку CFSE с окрашиванием антителами определенных типов клеток и флуоресцентно меченных микрогранул. Это также дало информацию о пролиферации клеток-мишеней при обработке определенных цитокинов. [55]

См. Также [ править ]

  • Анализ сродства к аннексину A5 , тест для клеток, подвергающихся апоптозу, часто использует проточную цитометрию.
  • Анализ клеточного цикла
  • Счетчик сошников
  • Цитометрия
  • Диэлектрофорез
  • Стандарт проточной цитометрии
  • Массовая цитометрия
  • Микрофлуориметрия
  • Анализ жизнеспособности

Библиография [ править ]

  • Проточная цитометрия в микробиологии Дэвида Ллойда. ISBN  3-540-19796-6
  • Практическая проточная цитометрия Говарда М. Шапиро. ISBN 0-471-41125-6 
  • Проточная цитометрия для биотехнологии Ларри А. Склар. ISBN 0-19-515234-4 
  • Справочник по методам проточной цитометрии, автор J. Paul Robinson, et al. ISBN 0-471-59634-5 
  • Текущие протоколы цитометрии , Wiley-Liss Pub. ISSN 1934-9297 
  • Проточная цитометрия в клинической диагностике , версия 4, (Кэри, Маккой и Керен, ред.), ASCP Press, 2007. ISBN 0-89189-548-5 
  • '' Основные методы цитометрии '' З. Дарзинкевич, Дж. П. Робинсон и М. Родерер, Elsevier / Academic Press, 2010. ISBN 978-0-12-375045-7 
  • ′ ′ Ормерод, М.Г. (ред.) (2000) Проточная цитометрия - практический подход . 3-е издание. Издательство Оксфордского университета , Оксфорд, Великобритания. ISBN 0-19-963824-1 
  • Ормерод, М.Г. (1999) Проточная цитометрия . 2-е издание. Издательство BIOS Scientific , Оксфорд. ISBN 1-85996-107-X 
  • Проточная цитометрия - базовое введение . Майкл Г. Ормерод, 2008. ISBN 978-0-9559812-0-3 
  • '' Методы клеточной биологии, цитометрии, 4-е издание, т. 75. З. Дарзинкевич, М. Родерер и Х. Дж. Танке. Elsevier / Academic Press, 2004, ISBN 0-12-480283-4 . 
  • ′ ′ Последние достижения в цитометрии. ЧАСТЬ A ′ ′ З. Дарзинкевич и др., «Методы клеточной биологии», т. 102, Elsevier / Academic Press, 2011. ISBN 978-0-12-374912-3 . 
  • ′ ′ Последние достижения в цитометрии. ЧАСТЬ B ′ ′ З. Дарзинкевич и др., «Методы клеточной биологии», Vol. 103, Elsevier / Academic Press, 2011. ISBN 978-0-12-385493-3 

Примечания [ править ]

  1. ^ Аббревиатура FACS является торговой маркой и принадлежит BD Biosciences-Immunocytometry Systems, подразделению Becton-Dickinson, которое лицензировало патенты Стэнфорда. [30] [32]

Ссылки [ править ]

  1. Перейти ↑ Picot J, Guerin CL, Le Van Kim C, Boulanger CM (март 2012). «Проточная цитометрия: ретроспектива, основы и новейшее оборудование» . Цитотехнология . 64 (2): 109–30. DOI : 10.1007 / s10616-011-9415-0 . PMC 3279584 . PMID 22271369 .  
  2. ^ «проточная цитометрия» . TheFreeDictionary.com . Проверено 18 сентября 2018 .
  3. ^ "Практическая проточная цитометрия - Бекман Коултер" . www.beckman.com . Проверено 18 сентября 2018 .
  4. ^ Givan, Элис Л. (2011). «Проточная цитометрия: введение». В Hawley, T .; Хоули, Р. (ред.). Протоколы проточной цитометрии . Методы молекулярной биологии. 699 . Humana Press. С. 1–29. DOI : 10.1007 / 978-1-61737-950-5_1 . ISBN 978-1-61737-949-9. PMID  21116976 .
  5. ^ США 3380584 , Mack Fulwyler, "Сепаратор частиц", выданный 1965-06-01 
  6. ^ Fulwyler MJ (ноябрь 1965). «Электронное разделение биологических клеток по объему». Наука . 150 (3698): 910–1. Bibcode : 1965Sci ... 150..910F . DOI : 10.1126 / science.150.3698.910 . PMID 5891056 . S2CID 459342 .  
  7. ^ DE 1815352 , Вольфганг Дитрих и Вольфганг Göhde, «Проточные палат для фотометров для измерения и подсчета количества частиц в дисперсионной среде» 
  8. Перейти ↑ Osborn, RA (1970). «Автоматизация цитологии». В DMD Evans (ред.). Труды второго симпозиума Tenovus . 24–25 октября 1968 г. Эдинбург и Лондон: Э. и С. Ливингстон (опубликовано в 1971 г.). DOI : 10.1016 / S0031-3025 (16) 39506-X . S2CID 58286041 . 
    Каменцкий, Луи А. (1973). «Автоматизация цитологии». Успехи биологической и медицинской физики . 14 : 93–161. DOI : 10.1016 / B978-0-12-005214-1.50007-8 . ISBN 9780120052141. PMID  4579761 .
  9. ^ Мешок, Ульрих; и другие. Zelluläre Diagnostik . Karger Publishers (2006).
  10. ^ "Столетний институт - ресурсы и оборудование" .
  11. ^ «BD Biosciences - Продукты специального заказа» .
  12. ^ a b c d e f g h i Cossarizza A, Chang HD, Radbruch A, Akdis M, Andrä I, Annunziato F, et al. (Октябрь 2017 г.). «Рекомендации по использованию проточной цитометрии и сортировки клеток в иммунологических исследованиях» (PDF) . Европейский журнал иммунологии . 47 (10): 1584–1797. DOI : 10.1002 / eji.201646632 . PMID 29023707 .  
  13. ^ a b «Система жидкостей - Руководство по проточной цитометрии» . Bio-Rad . Проверено 18 сентября 2018 .
  14. ^ a b c d e "Как работает проточный цитометр" . Thermo Fisher Scientific . Проверено 18 сентября 2018 .
  15. ^ Нолан JP, Condello D (январь 2013). «Спектральная проточная цитометрия» . Текущие протоколы цитометрии . 63 (1): 1.27.1–1.27.13. DOI : 10.1002 / 0471142956.cy0127s63 . ISBN 978-0471142959. PMC  3556726 . PMID  23292705 .
  16. ↑ Han Y, Gu Y, Zhang AC, Lo YH (ноябрь 2016 г.). «Обзор: технологии визуализации для проточной цитометрии» . Лаборатория на чипе . 16 (24): 4639–4647. DOI : 10.1039 / c6lc01063f . PMC 5311077 . PMID 27830849 .  
  17. ^ a b Roederer M (ноябрь 2001 г.). «Спектральная компенсация для проточной цитометрии: артефакты визуализации, ограничения и предостережения» . Цитометрия . 45 (3): 194–205. DOI : 10.1002 / 1097-0320 (20011101) 45: 3 <194 :: АИД-cyto1163> 3.0.co; 2-C . PMID 11746088 . 
  18. ^ Шарплесс Т, Р Traganos, Darzynkiewicz Z, Меламед MR (1975). «Проточная цитофлуорометрия: различение отдельных клеток и клеточных агрегатов путем прямого измерения размера». Acta Cytol . 19 (6): 577–581. PMID 1108568 . 
  19. ^ a b «Таблица флуорохромов (инструменты)» . Сеть проточной цитометрии .
  20. ^ «Таблица флуорохромов» . Архивировано из оригинального 20 октября 2014 года.
  21. ↑ Qian Y, Wei C, Eun-Hyung Lee F, Campbell J, Halliley J, Lee JA, Cai J, Kong YM, Sadat E, Thomson E, Dunn P, Seegmiller AC, Karandikar NJ, Tipton CM, Mosmann T, Sanz I, Scheuermann RH (2010). «Выявление семнадцати субпопуляций В-клеток периферической крови человека и количественная оценка ответа от столбняка с использованием метода на основе плотности для автоматической идентификации клеточных популяций в данных многомерной проточной цитометрии» . Цитометрии Часть B . 78 (Дополнение 1): S69–82. DOI : 10.1002 / cyto.b.20554 . PMC 3084630 . PMID 20839340 .  
  22. ^ "База данных иммунологии и аналитический портал" . Архивировано из оригинального 26 июля 2011 года . Проверено 3 сентября 2009 .
  23. ^ Заре H, Shooshtari P, Гупта A, Бринкмен RR (июль 2010). «Обработка данных для спектральной кластеризации для анализа данных проточной цитометрии с высокой пропускной способностью» . BMC Bioinformatics . 11 : 403. DOI : 10,1186 / 1471-2105-11-403 . PMC 2923634 . PMID 20667133 .  
  24. ^ "flowClust" . Проверено 3 сентября 2009 .
  25. Перейти ↑ Lo K, Brinkman RR, Gottardo R (апрель 2008 г.). «Автоматическое управление данными проточной цитометрии с помощью надежной кластеризации на основе моделей» . Цитометрия. Часть A . 73 (4): 321–32. DOI : 10.1002 / cyto.a.20531 . PMID 18307272 . 
  26. ^ Lo K, F Хане, Бринкмен RR, Готтардо R (май 2009). «flowClust: пакет Bioconductor для автоматического стробирования данных проточной цитометрии» . BMC Bioinformatics . 10 : 145. DOI : 10,1186 / 1471-2105-10-145 . PMC 2701419 . PMID 19442304 .  
  27. ^ «Анализ расхода с автоматизированной многомерной оценкой (ПЛАМЯ)» . Архивировано из оригинального 21 августа 2009 года . Проверено 3 сентября 2009 .
  28. ^ Уоттенберг M, Viégas F, Джонсон I (13 октября 2016). «Как эффективно использовать t-SNE» . Дистиллировать . 1 (10). DOI : 10,23915 / distill.00002 .
  29. ^ «FlowCAP - проточная цитометрия: критическая оценка методов идентификации населения» . Проверено 3 сентября 2009 .
  30. ^ a b Перкель, Джеффри (19 июля 2004 г.). «Сортировщик клеток, активируемый флуоресценцией» . Ученый . Проверено 18 сентября 2018 .
  31. ^ "Блок записи 9554, История интервью с сортировщиком ячеек" . Архивы Смитсоновского института . Фулвайлер, Мак Джетт. интервьюируемый, Герценберг, Леонард А. интервьюируемый, Герценберг, Леонора А. интервьюируемый, Бах, Брюс Аллен. интервьюируемый, Краснов, интервьюируемый Марк А., Мхатре, интервьюируемый Нагеш С. 1991 . Проверено 18 сентября 2018 .CS1 maint: другие ( ссылка )
  32. ^ Бушнелл, Тим (2016-05-04). «12 терминов и определений проточной цитометрии, которые ошибаются большинством ученых» . Экспертная цитометрия . Проверено 18 сентября 2018 .
  33. ^ Julius MH Масуда T, Герценберг LA (июль 1972). «Демонстрация того, что антигенсвязывающие клетки являются предшественниками антителопродуцирующих клеток после очистки с помощью клеточного сортировщика, активируемого флуоресценцией» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 69 (7): 1934–8. Bibcode : 1972PNAS ... 69.1934J . DOI : 10.1073 / pnas.69.7.1934 . PMC 426835 . PMID 4114858 .  
  34. ^ "Сортировка клеток - средство проточной цитометрии медицинского факультета" . flowcytometry.utoronto.ca . Проверено 18 сентября 2018 .
  35. ^ «Конъюгация моноклональных антител» . www.drmr.com . Проверено 18 сентября 2018 .
  36. Перейти ↑ Loken, MR (1990). Методы иммунофлуоресценции в проточной цитометрии и сортировке (2-е изд.). Вайли. С. 341–53.
  37. ^ a b c Орнатский О., Бандура Д., Баранов В., Ниц М., Винник М. А., Таннер С. (сентябрь 2010 г.). «Многопараметрический анализ методом массовой цитометрии». Журнал иммунологических методов . 361 (1–2): 1–20. DOI : 10.1016 / j.jim.2010.07.002 . PMID 20655312 . 
  38. ^ Basiji DA, Ortyn WE, Лян L, Венкатачалам V, Моррисси P (сентябрь 2007). «Анализ клеточных изображений и визуализация с помощью проточной цитометрии» . Клиники лабораторной медицины . 27 (3): 653–70, viii. DOI : 10.1016 / j.cll.2007.05.008 . PMC 2034394 . PMID 17658411 .  
  39. ↑ Sun T, Morgan H (апрель 2010 г.). "Микрожидкостная цитометрия одноклеточного импеданса: обзор". Микрофлюидика Нанофлюидика . 8 (4): 423–443. DOI : 10.1007 / s10404-010-0580-9 . S2CID 95631023 . 
  40. ↑ Cheung KC, Di Berardino M, Schade-Kampmann G, Hebeisen M, Pierzchalski A, Bocsi J, Mittag A, Tárnok A (июль 2010 г.). «Микрофлюидная проточная цитометрия на основе импеданса» . Цитометрия. Часть A . 77 (7): 648–66. DOI : 10.1002 / cyto.a.20910 . PMID 20583276 . 
  41. ^ Замора JLR, Агилар HC (февраль 2018). «Проточная вирометрия как инструмент изучения вирусов» . Рассмотрение. Методы . 134–135: 87–97. DOI : 10.1016 / j.ymeth.2017.12.011 . PMC 5815898 . PMID 29258922 .  
  42. ^ Мерфи RW, Лоукок Л.А., Смит C, Даревский И.С., Орлов Н., МакКаллок Р.Д., Аптон Д.Е. (1997). «Проточная цитометрия в исследованиях биоразнообразия: методы, полезность и ограничения». Амфибия-Рептилии . 18 : 1–13. DOI : 10.1163 / 156853897x00260 .
  43. ^ Gorczyca Вт, Traganos Ж, Jesionowska Н, Darzynkiewicz Z (1993). «Наличие разрывов цепи ДНК и повышенная чувствительность ДНК in situ к денатурации в аномальных человеческих сперматозоидах: аналогия апоптозу соматических клеток». Exp Cell Res . 207 (1): 202–5. DOI : 10.1006 / excr.1993.1182 . PMID 8391465 . 
  44. ^ Эвенсон Д.П. (2017). «Оценка структуры хроматина сперматозоидов и разрывов цепей ДНК является важной частью клинической оценки мужской фертильности» . Перевод Андрол Урол . 6 (Дополнение 4): S495 – S500. DOI : 10,21037 / tau.2017.07.20 . PMC 5643675 . PMID 29082168 .  
  45. ^ Танака Т, Halicka HD, Хуанг Х, Traganos F, Darzynkiewicz Z (2006). «Конститутивное фосфорилирование гистона H2AX и активация ATM, репортеры повреждения ДНК эндогенными оксидантами» . Клеточный цикл . 5 (17): 1940–1945. DOI : 10.4161 / cc.5.17.3191 . PMC 3488278 . PMID 16940754 .  
  46. ^ MacPhail SH, Banáth JP, Yu Y, Chu E, Olive PL (2003). «Зависимая от клеточного цикла экспрессия фосфорилированного гистона H2AX: снижение экспрессии в необлученных, но не облученных Х-лучами клетках G1-фазы». Radiat Res . 159 (6): 759–67. Bibcode : 2003RadR..159..759M . DOI : 10.1667 / rr3003 . PMID 12751958 . 
  47. ^ Darzynkiewicz Z, Хуан G, Ли X, Gorczyca W, Мураками M, Traganos F (1997). «Цитометрия в некробиологии клеток. Анализ апоптоза и случайной гибели клеток (некроза)» . Цитометрия . 27 (1): 1–20. DOI : 10.1002 / (SICI) 1097-0320 (19970101) 27: 1 <1 :: AID-CYTO2> 3.0.CO; 2-L . PMID 9000580 . 
  48. ^ Виатор, Джон А .; Келлум, Джон А .; Хемпель, Джон Д .; Повар, Джастин; Саевский, Андреа; Фитцпатрик, Мэтью; Фернандес, Рэйчел; Минард, Остин; Ноэль, Сьерра (27 февраля 2019 г.). Ван, Лихонг V; Ораевский, Александр А (ред.). «Идентификация инфекции MRSA в крови с помощью фотоакустической проточной цитометрии». Photons Plus Ultrasound: визуализация и зондирование 2019 . Международное общество оптики и фотоники. 10878 : 1087860. Bibcode : 2019SPIE10878E..60E . DOI : 10.1117 / 12.2510210 . ISBN 9781510623989. S2CID  86428267 .
  49. ↑ Menon V, Thomas R, Ghale AR, Reinhard C, Pruszak J (декабрь 2014 г.). «Протоколы проточной цитометрии для поверхностного и внутриклеточного анализа антигенов типов нервных клеток» . Журнал визуализированных экспериментов (94): e52241. DOI : 10.3791 / 52241 . PMC 4396953 . PMID 25549236 .  
  50. ^ Antypas Н, Veses-Гарсиа М, Вейбулла Е, Андерссон-Svahn Н, Рихтер-Dahlfors А (июнь 2018). «Универсальная платформа для отбора и фенотипического скрининга с высоким разрешением бактериальных мутантов с использованием слайда с нанолунками» . Лаборатория на чипе . 18 (12): 1767–1777. DOI : 10.1039 / c8lc00190a . PMC 5996734 . PMID 29781496 .  
  51. ^ Дэви HM (2011). «Жизнь, смерть и промежуточное: значения и методы в микробиологии» . Прикладная и экологическая микробиология . 77 (16): 5571–5576. DOI : 10,1128 / AEM.00744-11 . PMC 3165249 . PMID 21705550 .  
  52. ^ Андерсен М.Н., Аль-Karradi С.Н., Kragstrup TW, Hokland М (2016). «Устранение ошибочных результатов в проточной цитометрии, вызванных связыванием антител с рецепторами Fc на человеческих моноцитах и ​​макрофагах». Цитометрия . 89 (11): 1001–1009. DOI : 10.1002 / cyto.a.22995 . PMID 27731950 . 
  53. ^ Хокинс, ED; Hommel, M .; Тернер, ML; Бэтти, Флорида; Маркхэм, JF; Ходжкин, П.Д. (2007). «Измерение пролиферации, выживаемости и дифференциации лимфоцитов с использованием данных временного ряда CFSE». Nat. Protoc . 2 (9): 2057–67. DOI : 10.1038 / nprot.2007.297 . PMID 17853861 . S2CID 13550456 .  
  54. ^ Quah, BJ; Приход, CR (2010). «Использование сукцинимидилового эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) для мониторинга пролиферации лимфоцитов» . J Vis Exp (44). DOI : 10.3791 / 2259 . PMC 3185625 . PMID 20972413 .  
  55. ^ Jedema, I .; Ван дер Верфф, Нью-Мексико; Баржа, РМ; Willemze, R .; Фалькенбург, JH (2004). «Новый анализ на основе CFSE для определения предрасположенности к лизису цитотоксическими Т-клетками лейкозных клеток-предшественников в гетерогенной популяции клеток-мишеней» . Кровь . 103 (7): 2677–2682. DOI : 10.1182 / кровь-2003-06-2070 . PMID 14630824 . S2CID 1984056 .  

Внешние ссылки [ править ]

Ресурсы библиотеки о
проточной цитометрии
  • Ресурсы в вашей библиотеке
  • Ресурсы в других библиотеках
  • СМИ, связанные с проточной цитометрией, на Викискладе?
  • Проточная + цитометрия по медицинским предметным рубрикам Национальной медицинской библиотеки США (MeSH)