Фокусная молография
Фокальная молография (сокращенно «молография») — это биофизический метод надежного и чувствительного обнаружения биомолекулярных взаимодействий без использования меток. Новый метод позволяет проводить анализ биомолекулярных взаимодействий в сложных биологических образцах без использования дополнительных флуоресцентных меток. Молография расширяет аналитическую область методов анализа биомолекулярных взаимодействий в широком диапазоне приложений, например, безметочный анализ следов целевой молекулы (называемой биомаркером) в сложных образцах, таких как сыворотка крови, биореакторная жидкость или среда для культивирования клеток. В отличие от рефрактометрических методов анализа биомолекулярных взаимодействий без меток, таких как поверхностный плазмонный резонанс (SPR) и рефлектометрическая интерференционная спектроскопия (RIfS).Молография позволяет количественно оценить молекулярные взаимодействия в живых клетках в режиме реального времени.
Принцип работы молографии показан на рис. 1. Молография основана на дифракции лазерного излучения на специальном двумерном наноструктуре молекулярных участков связывания на поверхности сенсорного чипа, называемой молограммой. [1] [2] [3] Молограмма представляет собой когерентную совокупность сайтов связывания на чипе, которые образуют схему молекулярной голограммы. [3] [1] [2] Голограмма имеет форму фокусирующей дифракционной линзы и освещается затухающей волной. Эванесцентные волны возникают, когда свет полностью внутренне отражается на границе раздела двух диэлектриков. [4] [5]Биомолекулы, которые связываются с молограммой, преломляют лазерный свет в фокусное пятно с ограниченной дифракцией в трехмерном пространстве, фокальную точку молограммы. [3] [1] [2] Интенсивность сфокусированного света квадратично коррелирует с количеством связанных молекул на молограмме и, следовательно, также с количеством происходящих биомолекулярных взаимодействий. [4] [5]
В сложных биологических образцах концентрация нецелевых молекул обычно значительно выше, чем молекул-мишеней. Поэтому даже в отсутствие элементов распознавания нецелевые молекулы легко адсорбируются на поверхности сенсора. [3] [1] [2] Однако это случайный процесс, и нецелевые молекулы не связываются с упорядоченными сайтами связывания на молограмме. [3] [1] [2] Таким образом, рассеяние нецелевых молекул равномерно во всех пространственных направлениях, и поэтому нецелевые молекулы практически не дают вклада в измеряемую интенсивность света в узком телесном угле фокального пятна. [3] [1] [2]По сути, фокальная молография формирует высокочастотную блокировку пространственного сродства, которая измеряет только компонент Фурье распределения показателя преломления, который соответствует связывающей модуляции молограммы. [6] Поскольку шум окружающей среды (температурные градиенты, изменения буфера и неспецифическое связывание нецелевых молекул) обратно пропорционален пространственной частоте и, следовательно, расположен в основном на «длинных» пространственных периодах, большая часть шума может быть отклонена. Это свойство делает молографию чрезвычайно надежной и делает температурную стабилизацию или уравновешивание датчиков ненужными. [7]
Кристоф Фаттингер из Хоффманн-Ла-Рош в Базеле уже сформулировал физические принципы фокальной молографии в 1990-х годах, когда исследовал бидифракционную решетку-ответвитель. [1] [8] [9] Тем не менее, он появился только в результате научного сотрудничества между ETH Zürich и Инновационным центром Roche в Базеле в Швейцарии с 2014 по 2020 год.
Синтез молограмм на сенсорном чипе осуществляется с помощью правильно разработанной химии поверхности и реактивной иммерсионной литографии (РИЛ). [3] [10] С помощью процесса RIL можно создать биомолекулярную распознающую структуру молограммы на светочувствительном незагрязняющемся привитом сополимерном слое с помощью стандартных методов литографии. [3] [10] [11] Слой сополимера функционализирован фотоотщепляемыми защитными группами, которые при освещении создают реактивные амины. [1] [3] [10] Последующие этапы химии поверхности позволяют легко адаптировать распознающие молекулы к желаемому аналитическому приложению. [10] [12] [13] [14]
