Бисульфи́тное секвени́рование — общее название группы методов, направленных на изучение паттерна метилирования ДНК посредством обработки её бисульфитом.
Метилирование — первое открытое эпигенетическое маркирование. Оно влияет на уровень экспрессии генов, подавляя транскрипционную активность. Кроме того, во многих случаях метилирование наследуемо[1][2], что придает дополнительный интерес его исследованию.
Бисульфит действует на одноцепочечную ДНК, превращая цитозин в урацил[3]. Если же этот цитозин метилирован, то есть к его пятому атому углерода присоединена метильная группа, то такой цитозин не подвергается превращению. Таким образом, бисульфит изменяет последовательность ДНК в зависимости от её паттерна метилирования, и после его воздействия можно установить, какие CpG-динуклеотиды были метилированы, сравнив изменённую последовательность с исходной.
Описанные ниже методы используют секвенирование обработанных бисульфитом участков ДНК для определения паттерна метилирования. Существуют также методы, не основанные на секвенировании, например, комбинированный бисульфитный рестриктационный анализ (COBRA[англ.]) и иммунопреципитация метилированной ДНК (MeDIP[англ.]). Задачи изучения паттернов метилирования могут состоять как в исследовании метилирования конкретного цитозина, так и в определении доли метилированных цитозинов на каком-то участке ДНК, или даже по всему геному в целом. Из приводимых далее методов некоторые больше приспособлены для изучения конкретных сайтов метилирования, другие же — для изучения метилирования на более высоких уровнях. В идеале необходимо определять метилирование каждого аллеля. Описанию методов бисульфитного секвенирования посвящены несколько обзоров[4][5][6][7][8].
Первый метод бисульфитного секвенирования описан в 1992 году[9]. Для определения паттерна метилирования использовали ПЦР, праймеры для которой были специфичными как к изменённой, так и к неизменённой бисульфитом ДНК, то есть они не содержали цитозинов, входящих в CpG-динуклеотиды[англ.]. Для праймеров использовали участки, близкие к интересующему сайту метилирования, но не содержащие его. В случае, когда цитозин не был метилирован, в амплифицированной последовательности обнаруживался тимин (урацил), а в синтезированной комплементарной последовательности — аденин. Если цитозин был метилирован, то в амплифицированной последовательности он и остался, а в комплементарной синтезировался гуанин. Такой метод очень трудозатратен, поскольку требует клонирования продуктов ПЦР для достижения необходимой чувствительности. Эту же проблему можно решить при помощи вложенной ПЦР[англ.].
В пиросеквенировании используют ПЦР с праймерами, амплифицирующими как изменённую, так и не изменённую бисульфитом ДНК. Соотношение числа метилированных и неметилированных цитозинов в амплифицируемой последовательности определяется по соотношению количества нуклеотидов А и Г в синтезируемой комплементарной последовательности[10][11].