Начало строительства костёла связывают с закладкой города «Новый Пльзень» Вацлавом II в 1295 году[1]. С закладкой города было принято решение и о создании двух храмов, один для доминикацев, второй для францисканцев. Первое упоминание о проведённой мессе в ещё недостроенном храме относится к 2 мая 1307 года[1].
Практически с самого основания собора, в 1322 году чешским королём Иоанном Люксембургским он был передан под духовное управление Тевтонскому ордену, которое продлилось более двух столетий, до 1546 года[1].
Башня собора высотой 102,26 м, во время своего создания была вторым высочайшим сооружением, и до сих пор она делает собор Святого Варфоломея высочайшим религиозным сооружением Богемии. На высоте 62 метров расположена смотровая площадка, с 2001 года обнесённая специальной защитной сеткой из-за частых попыток самоубийств. К смотровой площадке ведёт 301 ступенька, в ясную погоду с площадки открывается вид на десятки километров[2][3]. Длина здания — 57,4 м, ширина — 26,0 м[2].
Одна из святынь собора и объект паломничества — статуя Пльзенской Девы Марии. Автор скульптуры неизвестен, скульптуру датируют примерно 1390 годом[4]. Уже во второй половине XIV начале XV веков, во времена Гуситских войн были созданы множество копий данной скульптуры, это была так называемая «эпоха красивых мадонн». Возможно, в этот период образ Пльзенской Мадонны рассматривался как один из символов католической веры во время религиозных беспорядков[5]. Скульптура вытесана из песчанистого мергеля, имеет высоту 134 сантиметра. В настоящее время скульптура украшает углубление в главном алтаре, реконструкцию которого выполнили в 1883 году по проекту известного архитектора Йосефа Моцкера в неоготическом стиле. Известно, что примерно к 1750 году в храме насчитывалось 33 алтаря[6].
Пресвитерий является самой старой частью храма из сохранившихся в первозданном виде, он был построен в тридцатые годы XIV столетия. Около 1476 года было завершено строительство трёхнефного зала и внутренне пространство храма примерно достигло нынешних размеров. Во время правления Карла IV было завершено строительство одной башни, несмотря на то, что были заложены две[2].
В XVI веке недалеко от костёла была построена Городская ратуша. Костёл окружало кладбище, в 1784 году снесённое по решению императора Иосифа II[8], образовавшуюся на его месте площадь Республики[чеш.] замостили булыжником.[9]В июле 2010 года на площади были установлены три позолоченных фонтана в современном стиле[10].