Хроматография

Тонкослойная хроматография используется для разделения компонентов растительного экстракта, иллюстрируя эксперимент с растительными пигментами, давший название хроматографии.

Хроматография является лабораторной методикой для разделения смеси. Смесь растворяется в жидкости (газ, растворитель, вода, ...), называемой подвижной фазой, которая переносит ее через систему (колонку, капиллярную трубку, пластину или лист), на которой закреплен материал. называется стационарной фазой.Различные составляющие смеси имеют разное сродство к неподвижной фазе. Различные молекулы остаются на неподвижной фазе дольше или короче, в зависимости от их взаимодействия с ее участками на поверхности. Таким образом, они движутся с разными кажущимися скоростями в подвижной жидкости, заставляя их разделяться. Разделение основано на дифференциальном разделении между подвижной и стационарной фазами. Незначительные различия в коэффициенте разделения соединения приводят к дифференциальному удерживанию на неподвижной фазе и, таким образом, влияют на разделение. ^[1]

Хроматография может быть препаративной или аналитической. Цель препаративной хроматографии - разделить компоненты смеси для последующего использования и, таким образом, является формой очистки . Аналитическая хроматография обычно проводится с меньшими количествами материала и предназначена для установления присутствия или измерения относительных пропорций аналитов в смеси. Эти два понятия не исключают друг друга. ^[2]

Этимология и произношение [ править ]

Хроматография, выраженный / ˌ к г oʊ м ə т ɒ ɡ г ə е I / , является производным от греческого χρῶμα насыщенности цвета , что означает « цвет », и γράφειν graphein , что означает «писать». Комбинация этих двух терминов была напрямую унаследована от изобретения техники, впервые использованной для разделения пигментов. ^[3]

История [ править ]

Хроматография была впервые изобретена в России ученым итальянского происхождения Михаилом Цветом в 1900 году. ^[4] Он разработал эту технику, он изобрел хроматографию, в первом десятилетии 20-го века, в первую очередь для разделения растительных пигментов, таких как хлорофилл и каротины. , и ксантофиллы . Поскольку эти компоненты разделены полосами разного цвета (зеленый, оранжевый и желтый соответственно), они напрямую вдохновили название техники. Новые типы хроматографии, разработанные в 1930-х и 1940-х годах, сделали эту технику полезной для многих процессов разделения . ^[5]

Техника хроматографии существенно развивалась в результате работы Арчера Джона Портера Мартина и Ричарда Лоуренса Миллингтона Синджа в 1940-х и 1950-х годах, за что они получили Нобелевскую премию по химии 1952 года . ^[6] Они установили принципы и основные методы распределительной хроматографии, и их работа способствовала быстрому развитию нескольких хроматографических методов: бумажной хроматографии , газовой хроматографии и так называемой высокоэффективной жидкостной хроматографии.. С тех пор технология быстро развивалась. Исследователи обнаружили, что основные принципы хроматографии Цвета можно применять по-разному, что приводит к различным разновидностям хроматографии, описанным ниже. Достижения постоянно улучшают технические характеристики хроматографии, позволяя разделять все более похожие молекулы.

Условия хроматографии [ править ]

• Анализируемое вещество представляет собой вещество, подлежащее отделяют во время хроматографии. Это также обычно то, что требуется от смеси.
• Аналитическая хроматография используется для определения наличия и, возможно, концентрации аналита (ов) в образце .
• Привитая фаза является неподвижной фазой , который ковалентно связан с частицами поддержки или к внутренней стенке трубы колонны.
• Хроматограмму является визуальной выход хроматографа. В случае оптимального разделения разные пики или рисунки на хроматограмме соответствуют разным компонентам разделенной смеси.

По оси абсцисс отложено время удерживания, а по оси ординат - сигнал (например, полученный спектрофотометром , масс-спектрометром или рядом других детекторов), соответствующий отклику, создаваемому аналитами, покидающими систему. В случае оптимальной системы сигнал пропорционален концентрации выделенного аналита.

• Хроматографа или аэрографа является инструментом , который обеспечивает сложное разделение, например , газовой хроматографии или жидкостной хроматографии разделения.
• Хроматография - это физический метод разделения, при котором компоненты распределяются между двумя фазами: одна неподвижная (неподвижная фаза), а другая (подвижная фаза) движется в определенном направлении.
• Элюят является подвижной фазой , выходящей из колонны. Это также называется сточными водами.
• Элюент представляет собой растворитель , который несет в себе аналит.
• Eluite является аналитом, элюированный растворенного вещества.
• Элюотропные серии представляют собой список растворителей ранжируются в соответствии с их элюированием силой.
• Иммобилизованная фаза является стационарной фазой , что иммобилизуют на частицах носителя, или на внутренней стенке трубы колонны.
• Подвижная фаза является фазой , которая движется в определенном направлении. Это может быть жидкость (ЖХ и капиллярная электрохроматография (CEC)), газ (GC) или сверхкритическая жидкость (сверхкритическая жидкостная хроматография, SFC). Подвижная фаза состоит из разделяемой / анализируемой пробы и растворителя, который перемещает пробу через колонку. В случае ВЭЖХ подвижная фаза состоит из неполярного растворителя (ей), такого как гексан, в нормальной фазе или полярного растворителя, такого как метанол, в хроматографии с обращенной фазой и разделяемого образца. Подвижная фаза движется через хроматографическую колонку (неподвижная фаза), где образец взаимодействует с неподвижной фазой и разделяется.
• Препаративная хроматография используется для очистки достаточных количеств вещества для дальнейшего использования, а не для анализа.
• Время удерживания - это характерное время, необходимое аналиту для прохождения через систему (от входа колонки до детектора) в заданных условиях. См. Также: Индекс удержания Коваца
• Образец является вопрос анализируется в хроматографии. Он может состоять из одного компонента или из смеси компонентов. Когда образец обрабатывается в ходе анализа, фаза или фазы, содержащие интересующие аналиты, называются образцом, тогда как все представляющее интерес, отделенное от образца до или в ходе анализа, относится к как отходы.
• Растворенное вещество относится к компонентам образца в распределительной хроматографии.
• Растворитель относится к любому веществу , способному растворять другое вещество, и особенно жидкой подвижной фазы в жидкостной хроматографии.
• Стационарная фаза представляет собой вещество , фиксируется на месте для процедуры хроматографии. Примеры включают слой диоксида кремния в тонкослойной хроматографии.
• Детектор относится к инструменту , используемый для качественного и количественного определения аналитов после разделения.

Хроматография основана на концепции коэффициента распределения. Любые перегородки растворенного вещества между двумя несмешивающимися растворителями. Когда мы делаем один растворитель неподвижным (путем адсорбции на твердой подложке), а другой - подвижным, это приводит к наиболее распространенным применениям хроматографии. Если матричный носитель или неподвижная фаза полярная (например, бумага, диоксид кремния и т. Д.), Это хроматография прямой фазы, а если она неполярная (C-18), это обратная фаза.

Методы по форме хроматографического слоя [ править ]

Колоночная хроматография [ править ]

Колоночная хроматография - это метод разделения, при котором неподвижный слой находится внутри пробирки. Частицы твердой неподвижной фазы или носителя, покрытого жидкой неподвижной фазой, могут заполнять весь внутренний объем трубы (насадочной колонны) или концентрироваться на внутренней стенке трубы или вдоль нее, оставляя открытый неограниченный путь для подвижной фазы в средняя часть трубки (открытая трубчатая колонна). Различия в скорости движения через среду рассчитываются для разных времен удерживания образца. ^{[7] [8]}

В 1978 году В. Кларк Стилл представил модифицированную версию колоночной хроматографии, названную флэш-хроматографией на колонке (флэш). ^{[9] [10]} Методика очень похожа на традиционную колоночную хроматографию, за исключением того, что растворитель пропускается через колонку под действием положительного давления. Это позволило выполнить большинство разделений менее чем за 20 минут с улучшенным разделением по сравнению со старым методом. Современные системы флэш-хроматографии продаются в виде предварительно упакованных пластиковых картриджей, и растворитель прокачивается через картридж. Системы также могут быть связаны с детекторами и коллекторами фракций, обеспечивая автоматизацию. Введение градиентных насосов привело к более быстрому разделению и меньшему расходу растворителя.

При адсорбции расширенным слоем используется псевдоожиженный слой, а не твердая фаза, образованная уплотненным слоем. Это позволяет пропускать начальные этапы очистки, такие как центрифугирование и фильтрация, для культуральных бульонов или суспензий поврежденных клеток.

Хроматография на фосфоцеллюлозе использует сродство связывания многих ДНК-связывающих белков с фосфоцеллюлозой. Чем сильнее белок взаимодействует с ДНК, тем выше концентрация соли, необходимая для элюирования этого белка. ^[11]

Планарная хроматография [ править ]

Планарная хроматография - это метод разделения, при котором неподвижная фаза присутствует в виде плоскости или на ней. Плоскость может быть бумагой, служащей таковой, или пропитанной веществом в качестве неподвижного слоя ( бумажная хроматография ) или слоем твердых частиц, нанесенных на подложку, такую ​​как стеклянная пластина ( тонкослойная хроматография ). Различные соединения в смеси образцов перемещаются на разные расстояния в зависимости от того, насколько сильно они взаимодействуют с неподвижной фазой по сравнению с подвижной фазой. Конкретный коэффициент удерживания (R _f ) каждого химического вещества может использоваться для помощи в идентификации неизвестного вещества.

Бумажная хроматография [ править ]

Бумажная хроматография - это метод, при котором небольшая точка или линия раствора образца наносится на полоску хроматографической бумаги . Бумага помещается в емкость с неглубоким слоем растворителя и запаивается. Когда растворитель поднимается через бумагу, он встречает смесь пробы, которая начинает перемещаться по бумаге вместе с растворителем. Эта бумага сделана из целлюлозы , полярного вещества , и соединения в смеси перемещаются дальше, если они менее полярны. Более полярные вещества связываются с целлюлозной бумагой быстрее и поэтому не распространяются так далеко.

Тонкослойная хроматография (ТСХ) [ править ]

Тонкослойная хроматография (ТСХ) - широко используемый лабораторный метод, используемый для разделения различных биохимических веществ на основе их относительной привлекательности для неподвижной и подвижной фаз. Это похоже на бумажную хроматографию . Однако вместо использования неподвижной фазы бумаги он включает неподвижную фазу тонкого слоя адсорбента, такого как силикагель , оксид алюминия или целлюлозу, на плоской инертной подложке . TLC очень универсален; несколько образцов могут быть разделены одновременно на одном слое, что делает его очень полезным для скрининга, например, для определения уровня лекарств и чистоты воды. ^[12]Вероятность перекрестного загрязнения мала, поскольку каждое разделение выполняется на новом слое. По сравнению с бумагой он имеет преимущество в более быстрых циклах, лучшем разделении, лучшем количественном анализе и выборе между различными адсорбентами. Для еще лучшего разрешения и более быстрого разделения с использованием меньшего количества растворителя можно использовать высокопроизводительную ТСХ . Более раннее популярное использование заключалось в том, чтобы дифференцировать хромосомы путем наблюдения за расстоянием в геле (разделение было отдельным этапом).

Замещающая хроматография [ править ]

Основной принцип вытесняющей хроматографии : молекула с высоким сродством к матрице хроматографии (вытеснитель) эффективно конкурирует за сайты связывания и, таким образом, вытесняет все молекулы с меньшим сродством. ^[13]Между вытеснительной и элюционной хроматографией есть явные различия. В режиме элюирования вещества обычно выходят из колонки в виде узких гауссовых пиков. Для максимальной очистки желательно широкое разделение пиков, предпочтительно до базовой линии. Скорость, с которой любой компонент смеси перемещается по колонке в режиме элюирования, зависит от многих факторов. Но для того, чтобы два вещества перемещались с разными скоростями и, таким образом, растворялись, должны быть существенные различия во взаимодействии между биомолекулами и хроматографической матрицей. Рабочие параметры регулируются для максимального эффекта от этой разницы. Во многих случаях разделение пиков по базовой линии может быть достигнуто только при градиентном элюировании и низкой загрузке колонки. Таким образом, два недостатка хроматографии в режиме элюирования, особенно в препаративном масштабе,- сложность эксплуатации из-за градиентной откачки растворителя и низкая производительность из-за низкой загрузки колонны. Вытеснительная хроматография имеет преимущества перед элюционной хроматографией в том, что компоненты разделяются на последовательные зоны чистых веществ, а не на «пики». Поскольку в процессе используется преимущество нелинейности изотерм, более крупное сырье для колонки может быть разделено на данной колонке с очищенными компонентами, извлеченными при значительно более высоких концентрациях.сырье большей колонки может быть разделено на данной колонке с выделением очищенных компонентов при значительно более высоких концентрациях.сырье большей колонки может быть разделено на данной колонке с выделением очищенных компонентов при значительно более высоких концентрациях.

Методики по физическому состоянию подвижной фазы [ править ]

Газовая хроматография [ править ]

Газовая хроматография (ГХ), также иногда известная как газожидкостная хроматография (ГЖХ), представляет собой метод разделения, в котором подвижной фазой является газ. Газохроматографическое разделение всегда проводят в колонке, которая обычно является «насадочной» или «капиллярной». Насадочные колонки - это рутинная работа в газовой хроматографии, они дешевле и проще в использовании и часто обеспечивают адекватную производительность. Капиллярные колонки обычно дают намного лучшее разрешение, и, хотя они становятся все более дорогими, широко используются, особенно для сложных смесей. Оба типа колонок изготовлены из неадсорбирующих и химически инертных материалов. Нержавеющая сталь и стекло являются обычными материалами для насадочных колонок, а кварц или плавленый кварц - для капиллярных колонок.

Газовая хроматография основана на равновесии распределения аналита между твердой или вязкой жидкой неподвижной фазой (часто жидким материалом на основе силикона) и подвижным газом (чаще всего гелием). Неподвижная фаза приклеивается к внутренней части стеклянной трубки или трубки из плавленого кварца (капиллярная колонка) малого диаметра (обычно внутренний диаметр 0,53–0,18 мм) или твердой матрицы внутри металлической трубки большего размера (насадочная колонка). Широко используется в аналитической химии ; хотя высокие температуры, используемые в ГХ, делают его непригодным для высокомолекулярных биополимеров или белков (тепло денатурирует их), часто встречающихся в биохимии , он хорошо подходит для использования в нефтехимии , мониторинге окружающей среды ирекультивация и промышленные химические области. Он также широко используется в химических исследованиях.

Жидкостная хроматография [ править ]

Жидкостная хроматография (ЖХ) - это метод разделения, при котором подвижная фаза является жидкостью. Его можно проводить как в колонне, так и в плоскости. Современная жидкостная хроматография, в которой обычно используются очень маленькие упаковочные частицы и относительно высокое давление, называется высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ).

В ВЭЖХ образец проталкивается жидкостью под высоким давлением (подвижная фаза) через колонку, заполненную неподвижной фазой, состоящей из частиц неправильной или сферической формы, пористого монолитного слоя или пористой мембраны. ВЭЖХ исторически делится на два разных подкласса в зависимости от полярности подвижной и стационарной фаз. Способы, в которых неподвижная фаза более полярна, чем подвижная фаза (например, толуол в качестве подвижной фазы, диоксид кремния в качестве неподвижной фазы), называются жидкостной хроматографией с нормальной фазой (NPLC) и наоборот (например, смесь воды и метанола в качестве подвижной фазы). фаза и C18 ( октадецилсилил ) в качестве стационарной фазы) называется обращенно-фазовой жидкостной хроматографией (RPLC).

Конкретные методы под этим общим заголовком перечислены ниже.

Аффинная хроматография [ править ]

Аффинная хроматография ^[14] основана на селективном нековалентном взаимодействии аналита с конкретными молекулами. Это очень специфично, но не очень надежно. Он часто используется в биохимии для очистки белков, связанных с метками. Эти слитые белки помечены такими соединениями, как His-метки , биотин или антигены , которые специфически связываются с неподвижной фазой. После очистки некоторые из этих меток обычно удаляют и получают чистый белок.

Аффинная хроматография часто использует сродство биомолекулы к металлу (Zn, Cu, Fe и т. Д.). Столбцы часто подготавливаются вручную. Традиционные аффинные колонки используются в качестве подготовительного этапа для удаления нежелательных биомолекул.

Однако существуют методы ВЭЖХ, которые действительно используют свойства аффинной хроматографии. Аффинная хроматография с иммобилизованным металлом (IMAC) ^{[15] [16]} полезна для разделения вышеупомянутых молекул на основе относительного сродства к металлу (например, Dionex IMAC). Часто эти столбцы могут быть загружены разными металлами для создания столбца с заданным сродством.

Сверхкритическая жидкостная хроматография [ править ]

Сверхкритическая жидкостная хроматография - это метод разделения, при котором подвижная фаза представляет собой жидкость, находящуюся выше и относительно близкой к ее критической температуре и давлению.

Техники по механизму разделения [ править ]

Ионообменная хроматография [ править ]

Ионообменная хроматография (обычно называемая ионной хроматографией) использует механизм ионного обмена для разделения аналитов на основе их соответствующих зарядов. Обычно это выполняется в столбцах, но также может быть полезно в плоском режиме. Ионообменная хроматография использует заряженную неподвижную фазу для разделения заряженных соединений, включая анионы , катионы , аминокислоты , пептиды и белки . В традиционных методах неподвижная фаза представляет собой ионообменную смолу, которая несет заряженные функциональные группы.которые взаимодействуют с противоположно заряженными группами удерживаемого соединения. Существует два типа ионообменной хроматографии: катионообменная и анионообменная. В катионообменной хроматографии неподвижная фаза имеет отрицательный заряд, а обмениваемый ион представляет собой катион, тогда как в анионообменной хроматографии неподвижная фаза имеет положительный заряд, а обмениваемый ион представляет собой анион. ^[17] Ионообменная хроматография обычно используется для очистки белков с помощью FPLC .

Эксклюзионная хроматография [ править ]

Эксклюзионная хроматография (SEC) также известна как гель-проникающая хроматография (GPC) или гель-фильтрационная хроматография.и разделяет молекулы в соответствии с их размером (или, точнее, в соответствии с их гидродинамическим диаметром или гидродинамическим объемом). Молекулы меньшего размера могут проникать в поры среды, поэтому молекулы захватываются и удаляются из потока подвижной фазы. Среднее время пребывания в порах зависит от эффективного размера молекул аналита. Однако молекулы, размер которых превышает средний размер пор упаковки, исключаются и, таким образом, практически не задерживаются; такие виды элюируются первыми. Как правило, это метод хроматографии с низким разрешением, и поэтому он часто используется для заключительного, «полирующего» этапа очистки. Это также полезно для определения третичной структуры и четвертичной структуры.очищенных белков, тем более что его можно проводить в условиях нативного раствора .

Адсорбционное хроматографическое разделение с расширенным слоем [ править ]

Колонка для хроматографической адсорбции с расширенным слоем (EBA) для процесса биохимического разделения включает распределитель жидкости для выравнивания давления, имеющий функцию самоочистки, под пористой блокирующей ситовой пластиной в нижней части расширенного слоя, узел сопла в верхней части, имеющий функцию очистки с обратной промывкой. в верхней части расширенного слоя лучшее распределение исходной жидкости, добавляемой в расширенный слой, гарантирует, что жидкость, прошедшая через слой расширенного слоя, отображает состояние поршневого потока. Слой расширенного слоя отображает состояние потока поршня. Хроматографическая разделительная колонка с расширенным слоем имеет преимущества увеличения эффективности разделения в расширенном слое.

Адсорбционная хроматография с расширенным слоем (EBA) - удобный и эффективный метод для улавливания белков непосредственно из неосветленной неочищенной пробы. В хроматографии EBA осевший слой сначала расширяют восходящим потоком уравновешивающего буфера. Неочищенное сырье, смесь растворимых белков, загрязняющих веществ, клеток и клеточного мусора, затем проходит вверх через расширенный слой. Целевые белки захватываются адсорбентом, а твердые частицы и загрязнения проходят через него. Замена буфера для элюирования при сохранении восходящего потока приводит к десорбции целевого белка в режиме расширенного слоя. В качестве альтернативы, если поток обратный, адсорбированные частицы будут быстро оседать, и белки могут быть десорбированы буфером для элюирования. Режим, используемый для элюирования (расширенный слой или оседлый слой), зависит от характеристик сырья. После элюированияадсорбент очищается с помощью предварительно определенного раствора для очистки на месте (CIP) с последующей очисткой либо регенерацией колонки (для дальнейшего использования), либо хранением.

Специальные техники [ править ]

Обращенно-фазовая хроматография [ править ]

Хроматография с обращенной фазой (RPC) - это любая процедура жидкостной хроматографии, в которой подвижная фаза значительно более полярна, чем неподвижная фаза. Он назван так потому, что в жидкостной хроматографии с нормальной фазой подвижная фаза значительно менее полярна, чем неподвижная фаза. Гидрофобные молекулы в подвижной фазе имеют тенденцию адсорбироваться на относительно гидрофобной неподвижной фазе. Гидрофильные молекулы в подвижной фазе будут стремиться элюироваться первыми. Разделительные колонки обычно содержат углеродную цепь C8 или C18, связанную с подложкой из частиц диоксида кремния.

Хроматография гидрофобного взаимодействия [ править ]

Гидрофобные взаимодействия между белками и хроматографической матрицей можно использовать для очистки белков. В хроматографии гидрофобного взаимодействия матричный материал слегка замещен гидрофобными группами. Эти группы могут варьироваться от метильной, этильной, пропильной, октильной или фенильной групп. ^[18] При высоких концентрациях соли неполярные боковые цепи на поверхности белков «взаимодействуют» с гидрофобными группами; то есть оба типа групп исключаются полярным растворителем (гидрофобные эффекты усиливаются повышенной ионной силой). Таким образом, образец наносится на колонку в буфере с высокой полярностью. Элюент обычно представляет собой водный буфер с уменьшающейся концентрацией соли, увеличивающейся концентрацией детергента (который нарушает гидрофобные взаимодействия) или изменением pH.

В общем, хроматография с гидрофобным взаимодействием (HIC) является предпочтительной, если образец чувствителен к изменению pH или агрессивным растворителям, обычно используемым в других типах хроматографии, но не к высоким концентрациям солей. Обычно варьируется количество соли в буфере. В 2012 году Мюллер и Францреб описали влияние температуры на HIC, используя альбумин бычьей сыворотки (BSA) с четырьмя различными типами гидрофобных смол. В исследовании изменилась температура, чтобы повлиять на аффинность связывания БСА с матрицей. Был сделан вывод, что циклическое изменение температуры от 50 до 10 градусов не было бы достаточным для эффективного отмывания всего BSA от матрицы, но могло бы быть очень эффективным, если бы колонку использовали только несколько раз. ^[19] Использование температуры для изменения температуры позволяет лабораториям сократить расходы на покупку соли и сэкономить деньги.

Если вы хотите избежать высоких концентраций соли вместе с колебаниями температуры, вы можете использовать более гидрофобный раствор, чтобы конкурировать с вашим образцом за его элюирование. [источник] Этот так называемый солонезависимый метод HIC показал прямое выделение человеческого иммуноглобулина G (IgG) из сыворотки с удовлетворительным выходом и использовал бета-циклодекстрин в качестве конкурента для вытеснения IgG из матрицы. ^[20] Это в значительной степени открывает возможность использования HIC с образцами, чувствительными к соли, поскольку мы знаем, что высокие концентрации соли осаждают белки.

Гидродинамическая хроматография [ править ]

Гидродинамическая хроматография (HDC) основана на наблюдаемом явлении, что большие капли движутся быстрее, чем маленькие. ^[21] В колонне это происходит потому, что центр масс более крупных капель не может находиться так же близко к сторонам колонны, как и более мелкие капли, из-за их большего общего размера. ^[22] Более крупные капли будут элюироваться первыми из середины колонки, в то время как более мелкие капли прилипают к краям колонки и вымываются последними. Эта форма хроматографии полезна для разделения аналитов по молярной массе , размеру, форме и структуре при использовании вместе с детекторами светорассеяния , вискозиметрами и рефрактометрами .^[23] Два основных типа HDC - это открытая трубка и насадочная колонка . Открытая пробирка обеспечивает быстрое разделение мелких частиц, тогда как насадочная колонка HDC может повысить разрешение и лучше подходит для частиц со средней молекулярной массой больше, чем дальтон . ^[24] HDC отличается от других типов хроматографии, поскольку разделение происходит только во внутреннем объеме, который представляет собой объем, окружающий и между частицами в насадочной колонке. ^[25]${\displaystyle 10^{5}}$

HDC использует тот же порядок элюирования, что и эксклюзионная хроматография (SEC), но эти два процесса по-прежнему во многом различаются. ^[24] В исследовании, сравнивающем два типа разделения, Изенберг, Брюэр, Коте и Стригель использовали оба метода для определения характеристик полисахаридов и пришли к выводу, что HDC в сочетании с многоугловым рассеянием света (MALS) обеспечивает более точное распределение молярной массы по сравнению с off- line MALS, чем SEC, за значительно меньшее время. ^[26] Это во многом связано с тем, что SEC является более деструктивным методом из-за того, что поры в колонке разрушают аналит во время разделения, что имеет тенденцию влиять на распределение массы. ^[26]Однако основным недостатком HDC является низкое разрешение пиков аналитов, что делает SEC более жизнеспособным вариантом при использовании с химическими веществами, которые нелегко разлагаются и где быстрое элюирование не важно. ^[27]

HDC играет особенно важную роль в области микрофлюидики . Первое успешное устройство для системы HDC-on-a-chip было предложено Chmela и др. в 2002 году. ^[28] Их конструкция позволила достичь разделения с использованием канала длиной 80 мм в масштабе времени 3 минуты для частиц диаметром от 26 до 110 нм, но авторы выразили потребность в улучшении параметров удерживания и диспергирования . ^[28] В публикации Jellema, Markesteijn, Westerweel и Verpoorte, опубликованной в 2010 году, реализация HDC с рециркуляционным двунаправленным потоком привела к высокому разрешению, разделению на основе размера с длиной канала всего 3 мм. ^[29]Такой короткий канал и высокое разрешение считались особенно впечатляющими, учитывая, что в предыдущих исследованиях использовались каналы длиной 80 мм. ^[28] Для биологического применения в 2007 г. Huh, et al. предложили микрожидкостное сортировочное устройство, основанное на HDC и гравитации, которое было полезно для предотвращения попадания потенциально опасных частиц диаметром более 6 микрон в кровоток при введении контрастных веществ в ультразвуковых исследованиях . ^[30] Это исследование также сделало успехи в обеспечении экологической устойчивости микрофлюидики из-за отсутствия внешней электроники, управляющей потоком, что стало преимуществом использования устройства на основе силы тяжести.

Двумерная хроматография [ править ]

В некоторых случаях селективность, обеспечиваемая использованием одной колонки, может быть недостаточной для обеспечения разделения аналитов в сложных образцах. Двумерная хроматография направлена ​​на увеличение разрешения этих пиков за счет использования второй колонки с другими физико-химическими ( химическая классификация ) свойствами. ^{[31] [32]} Поскольку механизм удерживания на этой новой твердой подложке отличается от разделения в первом измерении, можно разделить соединения с помощью двумерной хроматографии , которые неотличимы от одномерной хроматографии. Более того, разделение по второму измерению происходит быстрее, чем по первому. ^[31]Примером двумерного разделения методом ТСХ является то, что образец наносится на один угол квадратной пластины, проявляется, сушится на воздухе, затем поворачивается на 90 ° и обычно повторно проявляется во второй системе растворителей. Двумерная хроматография может применяться для разделения методом ГХ или ЖХ. ^{[31] [32]} Этот метод разделения также может быть использован в методе «разрезания сердца» ^[33], когда конкретные интересующие области по первому измерению выбираются для разделения по второму измерению, или в комплексном подходе, ^{[31] [32],} где все аналиты из первого измерения подвергаются разделению во втором измерении.

Хроматография с имитацией движущегося слоя [ править ]

Метод имитации движущегося слоя (SMB) представляет собой вариант высокоэффективной жидкостной хроматографии; он используется для разделения частиц и / или химических соединений, которые иначе было бы трудно или невозможно разделить. Это повышенное разделение достигается за счет расположения клапана и колонны, которое используется для неограниченного удлинения неподвижной фазы. В методике препаративной хроматографии с подвижным слоем ввод сырья и извлечение анализируемого вещества являются одновременными и непрерывными, но из-за практических трудностей с непрерывно движущимся слоем была предложена технология имитации подвижного слоя. В методе имитации движущегося слоя вместо его перемещения позиции входа для образца и выхода анализируемого вещества непрерывно перемещаются, создавая впечатление движущегося слоя. Хроматография с истинным движущимся слоем (TMBC) - это только теоретическая концепция. Его моделирование,SMBC достигается за счет использования множества последовательно соединенных колонок и сложной конструкции клапанов, которая обеспечивает подачу пробы и растворителя, а также отвод аналита и отходов в соответствующих местах любой колонки, что позволяет через равные промежутки времени переключать ввод пробы. в одном направлении, вход растворителя в противоположном направлении, при этом также соответствующим образом изменяются положения отвода анализируемого вещества и отходов.

Пиролизная газовая хроматография [ править ]

Пиролиз – газовая хроматография – масс-спектрометрия - это метод химического анализа, при котором образец нагревается до разложения с образованием более мелких молекул, которые разделяются с помощью газовой хроматографии и обнаруживаются с помощью масс-спектрометрии.

Пиролиз - это термическое разложение материалов в инертной атмосфере или вакууме. Образец вводят в прямой контакт с платиновой проволокой или помещают в кварцевую трубку для образца и быстро нагревают до 600–1000 ° C. В зависимости от области применения используются даже более высокие температуры. В настоящих пиролизерах используются три различных метода нагрева: изотермическая печь, индукционный нагрев (нить накала точки Кюри) и резистивный нагрев с использованием платиновых нитей. Большие молекулы расщепляются в самых слабых местах и ​​образуют более мелкие и более летучие фрагменты. Эти фрагменты можно разделить с помощью газовой хроматографии. ГХ-хроматограммы пиролиза обычно сложны, поскольку образуется широкий спектр различных продуктов разложения.Данные можно использовать как отпечаток пальца для подтверждения идентичности материала, либо данные ГХ / МС используются для идентификации отдельных фрагментов с целью получения структурной информации. Для увеличения летучести полярных фрагментов в образец перед пиролизом могут быть добавлены различные метилирующие реагенты.

Помимо использования специальных пиролизеров, пиролизную газовую хроматографию твердых и жидких образцов можно проводить непосредственно внутри инжекторов испарителя с программируемой температурой (PTV), которые обеспечивают быстрый нагрев (до 30 ° C / с) и высокие максимальные температуры 600–650 ° C. Этого достаточно для некоторых приложений пиролиза. Основное преимущество состоит в том, что не нужно покупать специальный прибор, а пиролиз можно проводить как часть рутинного ГХ-анализа. В этом случае необходимо использовать кварцевые вкладыши на входе ГХ. Могут быть получены количественные данные, а также опубликованы хорошие результаты дериватизации внутри инжектора PTV.

Быстрая жидкостная хроматография белков [ править ]

Быстрая жидкостная хроматография белков (FPLC) - это форма жидкостной хроматографии, которая часто используется для анализа или очистки смесей белков. Как и в других формах хроматографии, разделение возможно, потому что разные компоненты смеси имеют разное сродство к двум материалам: движущейся жидкости («подвижная фаза») и пористому твердому телу (неподвижная фаза). В FPLC подвижная фаза представляет собой водный раствор или «буфер». Расход буфера регулируется нагнетательным насосом и обычно поддерживается постоянным, в то время как состав буфера можно изменять, забирая жидкости в разных пропорциях из двух или более внешних резервуаров. Стационарная фаза представляет собой смолу, состоящую из шариков, обычно из сшитой агарозы, упакованных в цилиндрическую стеклянную или пластиковую колонку.Смолы FPLC доступны в широком диапазоне размеров гранул и поверхностных лигандов в зависимости от области применения.

Противоточная хроматография [ править ]

Противоточная хроматография (CCC) - это тип жидкостно-жидкостной хроматографии, в которой как неподвижная, так и подвижная фазы являются жидкостями, а жидкая неподвижная фаза удерживается в неподвижном состоянии за счет сильной центробежной силы.

Гидродинамическая противоточная хроматография (CCC) [ править ]

Принцип работы прибора CCC требует наличия колонны, состоящей из открытой трубки, намотанной на катушку. Катушка вращается в двухосном круговом движении (кардиоида), что заставляет поле переменной силы тяжести (G) воздействовать на колонну во время каждого вращения. Это движение заставляет колонку видеть одну ступень разделения на оборот, и компоненты образца разделяются в колонке из-за их коэффициента разделения между двумя используемыми несмешивающимися жидкими фазами. Сегодня доступно множество типов CCC. К ним относятся HSCCC (High Speed ​​CCC) и HPCCC (High Performance CCC). HPCCC - это последняя и наиболее эффективная версия инструментария, доступная в настоящее время.

Гидростатическая противоточная хроматография или центробежная распределительная хроматография (CPC) [ править ]

В приборе CPC колонка состоит из ряда ячеек, соединенных между собой каналами, прикрепленными к ротору. Этот ротор вращается вокруг своей центральной оси, создавая центробежное поле, необходимое для удержания неподвижной фазы на месте. Процесс разделения в CPC регулируется исключительно разделением растворенных веществ между стационарной и подвижной фазами, механизм которого можно легко описать с помощью коэффициентов разделения ( K _D ) растворенных веществ. Приборы CPC коммерчески доступны для лабораторных, экспериментальных и промышленных разделений с различными размерами колонок в диапазоне от примерно 10 миллилитров до 10 литров объема.

Периодическая противоточная хроматография [ править ]

В отличие от противоточной хроматографии (см. Выше), периодическая противоточная хроматография (PCC) использует твердую неподвижную фазу и только жидкую подвижную фазу. Таким образом, он намного больше похож на обычную аффинную хроматографию.чем противоточная хроматография. PCC использует несколько столбцов, которые на этапе загрузки соединяются в линию. Этот режим позволяет перегрузить первую колонку в этой серии без потери продукта, который уже прорывается через колонку до того, как смола полностью насыщается. Продукт прорыва фиксируется в следующих столбцах. На следующем этапе столбцы отсоединяются друг от друга. Первая колонка промывается и элюируется, в то время как другая колонка (и) все еще загружается. После повторного уравновешивания (первоначального) первого столбца его повторно вводят в поток загрузки, но в качестве последнего столбца. Затем процесс продолжается циклически.

Хиральная хроматография [ править ]

Хиральная хроматография включает разделение стереоизомеров. В случае энантиомеров они не имеют никаких химических или физических различий, кроме как трехмерные зеркальные изображения. Обычная хроматография или другие способы разделения не могут их разделить. Чтобы обеспечить возможность хирального разделения, либо подвижная фаза, либо стационарная фаза должны сами быть хиральными, что дает различное сродство между аналитами. Колонки для хиральной хроматографии ВЭЖХ (с хиральной неподвижной фазой) как с нормальной, так и с обращенной фазой коммерчески доступны.

Водная нормально-фазовая хроматография [ править ]

Водная хроматография с нормальной фазой (ANP) характеризуется элюирующим поведением в классическом режиме нормальной фазы (т.е. когда подвижная фаза значительно менее полярна, чем неподвижная фаза), в котором вода является одним из компонентов системы растворителей подвижной фазы. Он отличается от жидкостной хроматографии с гидрофильным взаимодействием (HILIC) тем, что механизм удерживания обусловлен адсорбцией, а не распределением. ^[34]

См. Также [ править ]

Ссылки [ править ]

Внешние ссылки [ править ]

Викискладе есть медиафайлы по теме хроматографии .

В Викиучебнике есть книга на тему: Школьная наука / Бумажная хроматография аминокислот.

• Номенклатура ИЮПАК для хроматографии
• Программа перекрытия пиков - обучение с помощью моделирования
• Видео по хроматографии - MIT OCW - Руководство по методам цифровой лаборатории
• Калькуляторы хроматографических уравнений - MicroSolv Technology Corporation