Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Профилирование концевых последовательностей (ESP) (иногда «Картирование парных концов (PEM)») - это метод, основанный на коннекторах с меткой последовательностей, разработанный для облегчения секвенирования генома de novo для определения числа копий с высоким разрешением и структурных аберраций, таких как инверсии и транслокации .

Рабочий процесс профилирования конечной последовательности

Вкратце, целевая геномная ДНК выделяется и частично переваривается рестрикционными ферментами на большие фрагменты. После фракционирования по размеру фрагменты клонируют в плазмиды для конструирования искусственных хромосом, таких как бактериальные искусственные хромосомы (ВАС), которые затем секвенируют и сравнивают с эталонным геномом. Различия, включая различия в ориентации и длине между сконструированными хромосомами и эталонным геномом, позволят предположить количество копий и структурную аберрацию.

Искусственное построение хромосом [ править ]

Рабочий процесс построения искусственных хромосом бактерий

Прежде чем анализировать структурную аберрацию целевого генома и вариацию числа копий (CNV) с помощью ESP, целевой геном обычно амплифицируют и консервируют с помощью искусственного конструирования хромосом. Классическая стратегия создания искусственной хромосомы - это бактериальная искусственная хромосома (BAC). По сути, целевая хромосома случайным образом переваривается и вставляется в плазмиды, которые трансформируются и клонируются в бактериях. [1] Размер вставляемых фрагментов составляет 150–350 т.п.н. [2] Еще одна широко используемая искусственная хромосома - фосмида. Разница между ВАС и фосмидами заключается в размере встроенной ДНК. Фосмиды могут содержать только фрагменты ДНК размером 40 т.п.н. [3], что позволяет более точно определять точку разрыва .

Обнаружение структурной аберрации [ править ]

Профилирование конечных последовательностей (ESP) можно использовать для обнаружения структурных вариаций, таких как вставки, делеции и хромосомные перестройки. По сравнению с другими методами, которые исследуют хромосомные аномалии, ESP особенно полезен для выявления аномалий, нейтральных к копированию, таких как инверсии и транслокации, которые не будут очевидны при рассмотрении вариации числа копий. [4] [5] Из библиотеки ВАС оба конца вставленных фрагментов секвенируются с использованием платформы для секвенирования. Затем обнаружение вариаций достигается путем сопоставления секвенированных считываний с эталонным геномом.

Инверсия и транслокация [ править ]

Инверсии и транслокации относительно легко обнаружить по неверной паре секвенированных концов. Например, транслокация может быть обнаружена, если парные концы картированы на разные хромосомы в эталонном геноме. [4] [5] Инверсия может быть обнаружена по расходящейся ориентации считываний, когда вставка будет иметь два плюсовых или два минусовых конца.

Хромосомные перестройки, обнаруженные ESP

Вставка и удаление [ править ]

В случае вставки или делеции картирование парного конца согласуется с эталонным геномом. Но прочтение несовместимо по кажущемуся размеру. Кажущийся размер - это расстояние до концов последовательности ВАС, картированных в эталонном геноме. Если BAC имеет вставку длины (l), согласованное отображение покажет фрагмент размера (l) в эталонном геноме. Если парные концы находятся ближе, чем расстояние (l), предполагается, что в отобранной ДНК вставлена ​​вставка. Расстояние (l <μ-3σ) можно использовать в качестве отсечки для обнаружения вставки, где μ - средняя длина вставки, а σ - стандартное отклонение. [5] [6] В случае делеции парные концы отображаются дальше в эталонном геноме по сравнению с ожидаемым расстоянием (l> μ-3σ). [6]

Копировать вариант номера [ править ]

Изменения номера копий, обнаруженные ESP

В некоторых случаях несогласованные чтения также могут указывать на CNV, например, в повторениях последовательностей. Для больших CNV плотность считываний будет меняться в зависимости от количества копий. Увеличение числа копий будет отражено увеличением отображения той же области на эталонном геноме.

История ESP [ править ]

ESP был впервые разработан и опубликован в 2003 году доктором Коллинзом и его коллегами из Калифорнийского университета в Сан-Франциско. Их исследование выявило хромосомные перестройки и CNV раковых клеток человека MCF7 с разрешением 150 КБ, что намного точнее по сравнению с CGH и спектральным кариотипированием в то время. [5] В 2007 году доктор Снайдер и его группа улучшили разрешение ESP до 3 кб, секвенировав обе пары фрагментов ДНК размером 3 кб без конструкции ВАС. Их подход позволяет идентифицировать делеции, инверсии, вставки со средней разрешающей способностью 644 п.н., что близко к разрешению полимеразной цепной реакции (ПЦР). [7]

Приложения ESP [ править ]

Для анализа профилирования конечных последовательностей можно использовать различные инструменты биоинформатики. Общие включают BreakDancer, PEMer, Variation Hunter, common LAW, GASV и Spanner. [8] ESP можно использовать для картирования структурных изменений с высоким разрешением в пораженной ткани. Этот метод в основном используется на образцах опухолей из разных типов рака. Точная идентификация хромосомных аномалий с нейтральной копией особенно важна, поскольку транслокация может приводить к слитым белкам, химерным белкам или неправильно регулируемым белкам, которые можно увидеть в опухолях. Этот метод также можно использовать в исследованиях эволюции, выявляя большие структурные различия между разными популяциями. [9]Подобные методы разрабатываются для различных приложений. Например, для оценки микробного разнообразия путем секвенирования тега 16S V6 использовали метод секвенирования парных концов Illumina со штрих-кодом (BIPES). [10]

Преимущества и ограничения [ править ]

Разрешение обнаружения структурных вариаций с помощью ESP было увеличено до уровня, аналогичного ПЦР, и может быть дополнительно улучшено путем отбора фрагментов ДНК более равномерного размера. ESP может применяться как с искусственной хромосомой, так и без нее. С помощью BAC ценные образцы можно увековечить и сохранить, что особенно важно для небольшого количества небольших образцов, которые планируются для обширных анализов. Кроме того, ВАС, несущие реаранжированные фрагменты ДНК, можно напрямую трансфицировать in vitro или in vivo.проанализировать функцию этих механизмов. Однако строительство БАК по-прежнему является дорогостоящим и трудоемким. Исследователи должны быть очень осторожны при выборе стратегии, которая им нужна для конкретного проекта. Поскольку ESP рассматривает только короткие последовательности с парными концами, его преимущество заключается в предоставлении полезной информации для всего генома без необходимости крупномасштабного секвенирования. Приблизительно 100-200 опухолей могут быть секвенированы с разрешением более 150 килобайт по сравнению с секвенированием всего генома.

Ссылки [ править ]

  1. ^ О'Коннор, М; Пайфер, М; Бендер, Вт (16 июня 1989 г.). «Конструирование больших сегментов ДНК в Escherichia coli». Наука . 244 (4910): 1307–12. Bibcode : 1989Sci ... 244.1307O . DOI : 10.1126 / science.2660262 . PMID  2660262 .
  2. ^ Stone, NE; Fan, JB; Willour, V; Пеннаккио, штат Луизиана; Warrington, JA; Ху, А; де ла Шапель, А; Lehesjoki, AE; Кокс, Д.Р .; Майерс, Р.М. (март 1996 г.). «Создание контига и рестрикционной карты бактериального клона размером 750 т.п.н. в области хромосомы 21 человека, содержащей ген прогрессирующей миоклонической эпилепсии» . Геномные исследования . 6 (3): 218–25. DOI : 10.1101 / gr.6.3.218 . PMID 8963899 . 
  3. ^ Тузун, Эрай; Шарп, Эндрю Дж; Бейли, Джеффри А; Каул, Раджиндер; Моррисон, В. Энн; Pertz, Lisa M; Хауген, Эрик; Хайден, Хиллари; Альбертсон, Донна; Пинкел, Даниэль; Олсон, Мейнард V; Эйхлер, Эван Э (15 мая 2005 г.). «Мелкомасштабные структурные вариации генома человека». Генетика природы . 37 (7): 727–732. DOI : 10.1038 / ng1562 . PMID 15895083 . 
  4. ^ a b Башир, Али; Волик, Станислав; Коллинз, Колин; Бафна, Винит; Рафаэль, Бенджамин Дж .; Узунис, Христос А. (25 апреля 2008 г.). «Оценка стратегий парного секвенирования для обнаружения перестройки генома при раке» . PLOS Вычислительная биология . 4 (4): e1000051. Bibcode : 2008PLSCB ... 4E0051B . DOI : 10.1371 / journal.pcbi.1000051 . PMC 2278375 . PMID 18404202 .  
  5. ^ a b c d Волик, С .; Zhao, S .; Чин, К .; Бребнер, JH; Herndon, DR; Тао, Q .; Kowbel, D .; Хуанг, G .; Лапук, А .; Kuo, W.-L .; Magrane, G .; de Jong, P .; Грей, JW; Коллинз, К. (4 июня 2003 г.). «Профилирование концевой последовательности: анализ аберрантных геномов на основе последовательностей» . Труды Национальной академии наук . 100 (13): 7696–7701. Bibcode : 2003PNAS..100.7696V . DOI : 10.1073 / pnas.1232418100 . PMC 164650 . PMID 12788976 .  
  6. ^ a b Ян, R; Чен, L; Ньюман, S; Ганди, К; Дохо, G; Морено, CS; Вертино, ПМ; Бернал-Мизарчи, L; Lonial, S; Бойсе, LH; Росси, М; Ковальски, Дж; Цинь, З.С. (2014). «Интегрированный анализ данных секвенирования парных концов и пар спариваний всего генома для выявления структурных вариаций генома при множественной миеломе» . Онкологическая информатика . 13 (Дополнение 2): 49–53. DOI : 10,4137 / CIN.S13783 . PMC 4179644 . PMID 25288879 .  
  7. ^ Korbel, JO; Городской, AE; Affourtit, JP; Годвин, B; Grubert, F; Саймонс, Дж. Ф.; Ким, премьер-министр; Палеев, Д; Карриеро, штат Нью-Джерси; Ду, Л; Тайон, BE; Чен, З; Танзер, А; Сондерс, AC; Чи, Дж; Ян, Ф; Картер, Н. П.; Hurles, ME; Weissman, SM; Харкинс, TT; Герштейн, МБ; Эгхольм, М; Снайдер, М. (19 октября 2007 г.). «Картирование парных концов показывает обширные структурные вариации в геноме человека» . Наука . 318 (5849): 420–6. Bibcode : 2007Sci ... 318..420K . DOI : 10.1126 / science.1149504 . PMC 2674581 . PMID 17901297 .  
  8. ^ Чжао, Мин; Ван, Цинго; Ван, Цюань; Цзя, Пейлинь; Чжао, Чжунмин (2013). «Вычислительные инструменты для обнаружения вариации числа копий (CNV) с использованием данных секвенирования следующего поколения: особенности и перспективы» . BMC Bioinformatics . 14 (Дополнение 11): S1. DOI : 10.1186 / 1471-2105-14-S11-S1 . PMC 3846878 . PMID 24564169 .  
  9. ^ Korbel, JO; Городской, AE; Affourtit, JP; Годвин, В .; Grubert, F .; Саймонс, Дж. Ф.; Ким, премьер-министр; Палеев, Д .; Карриеро, штат Нью-Джерси; Du, L .; Тайон, BE; Chen, Z .; Tanzer, A .; Сондерс, ACE; Chi, J .; Ян, Ф .; Картер, Н. П.; Hurles, ME; Weissman, SM; Харкинс, TT; Герштейн, МБ; Egholm, M .; Снайдер, М. (19 октября 2007 г.). «Парное картирование концов выявляет обширные структурные вариации в геноме человека» . Наука . 318 (5849): 420–426. Bibcode : 2007Sci ... 318..420K . DOI : 10.1126 / science.1149504 . PMC 2674581 . PMID 17901297 .  
  10. ^ Чжоу, Хун-Вэй; Ли, Донг-Фанг; Там, Нора Фунг-Йи; Цзян, Сяо-Тао; Чжан, Хай; Шэн, Хуа-Фан; Цинь, Цзинь; Лю, Сяо; Цзоу, Фэй (21 октября 2010 г.). «BIPES, экономичный высокопроизводительный метод оценки микробного разнообразия» . Журнал ISME . 5 (4): 741–749. DOI : 10.1038 / ismej.2010.160 . PMC 3105743 . PMID 20962877 .  

См. Также [ править ]

  • Хромосомные аномалии
  • Хромосомная инверсия
  • Вставка (генетика)
  • Удаление (генетика)
  • Хромосомная транслокация
  • Хромосомная аномалия
  • Вариант номера копии