Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
"PCR" перенаправляется сюда. Для использования в других целях, см ПЦР (значения) .

Полоска из восьми пробирок для ПЦР, каждая из которых содержит 100 мкл реакционной смеси.

Полимеразная цепная реакция ( ПЦР ) - это метод, широко используемый для быстрого создания от миллионов до миллиардов копий определенного образца ДНК , позволяющий ученым брать очень маленький образец ДНК и усиливать его до достаточно большого количества для детального изучения. ПЦР была изобретена в 1983 году американским биохимиком Кэри Маллис из Cetus Corporation . Это основа многих генетических тестов, включая анализ древних образцов ДНК и идентификацию инфекционных агентов. С помощью ПЦР копии очень небольшого количества последовательностей ДНК экспоненциально амплифицируются в серии циклов изменения температуры. ПЦР в настоящее время является обычным и часто незаменимым методом, используемым вмедицинские лабораторные исследования для широкого круга приложений, включая биомедицинские исследования и криминалистику . [1] [2]

Большинство методов ПЦР основаны на термоциклировании . При термоциклировании реагенты подвергаются повторяющимся циклам нагревания и охлаждения, что позволяет проводить различные температурно-зависимые реакции - в частности, плавление ДНК и репликацию ДНК под действием ферментов . ПЦР использует два основных реагента - праймеры (которые представляют собой короткие одноцепочечные фрагменты ДНК, известные как олигонуклеотиды, которые являются комплементарной последовательностью к целевой области ДНК) и ДНК-полимеразу . На первом этапе ПЦР две цепи двойной спирали ДНК физически разделяются при высокой температуре в процессе, называемом денатурацией нуклеиновой кислоты.. На втором этапе температура понижается, и праймеры связываются с комплементарными последовательностями ДНК. Две цепи ДНК затем становятся матрицами для ДНК-полимеразы, которая ферментативно собирает новую цепь ДНК из свободных нуклеотидов , строительных блоков ДНК. По мере продвижения ПЦР сгенерированная ДНК сама используется в качестве матрицы для репликации, приводя в движение цепную реакцию, в которой исходная матрица ДНК экспоненциально амплифицируется.

Почти во всех приложениях ПЦР используется термостойкая ДНК-полимераза, такая как полимераза Taq , фермент, первоначально выделенный из термофильной бактерии Thermus aquaticus . Если используемая полимераза была термочувствительной, она денатурировала бы при высоких температурах стадии денатурации. До использования Taq- полимеразы ДНК-полимеразу приходилось добавлять вручную каждый цикл, что было утомительным и дорогостоящим процессом. [3]

Применения метода включают клонирование ДНК для секвенирования , клонирование генов и манипуляции, мутагенез генов; построение филогении на основе ДНК или функциональный анализ генов ; Диагностика и мониторинг из наследственных заболеваний ; амплификация древней ДНК; [4] анализ генетических отпечатков пальцев для определения профиля ДНК (например, в судебной медицине и проверке отцовства ); и обнаружение патогенов в тестах на нуклеиновую кислоту для диагностики инфекционных заболеваний .

Размещение полоски из восьми пробирок для ПЦР в термоциклере

Принципы [ править ]

Термоциклер для ПЦР
Старый трехтемпературный термоциклер для ПЦР

ПЦР амплифицирует определенный участок цепи ДНК (ДНК-мишень). Большинство методов ПЦР амплифицируют фрагменты ДНК длиной от 0,1 до 10 килопар оснований (кб), хотя некоторые методы позволяют амплифицировать фрагменты до 40 кб. [5] Количество амплифицированного продукта определяется доступными субстратами в реакции, что становится ограничивающим по мере развития реакции. [6]

Базовая установка ПЦР требует нескольких компонентов и реагентов [7], включая:

  • матричной ДНК , который содержит ДНК - мишени для амплификации область
  • ДНК - полимеразы ; фермент, который полимеризует новые цепи ДНК; особенно распространена термостойкая полимераза Taq [8], поскольку она с большей вероятностью останется неповрежденной в процессе высокотемпературной денатурации ДНК.
  • две ДНК - праймеры , которые являются комплементарными к 3 '(три простых) концам каждому из смысловых и антисмысловых нитей ДНК - мишени (ДНК - полимераза может только связываться и удлиненной из двухцепочечной области ДНК, без праймеров, отсутствует двухцепочечный сайт инициации, с которым полимераза может связываться); [9] специфические праймеры, комплементарные целевой области ДНК, выбираются заранее и часто изготавливаются на заказ в лаборатории или приобретаются у коммерческих поставщиков биохимических продуктов.
  • дезоксинуклеозидтрифосфаты или дНТФ (иногда называемые «дезоксинуклеотидтрифосфаты»; нуклеотиды, содержащие трифосфатные группы), строительные блоки, из которых ДНК-полимераза синтезирует новую цепь ДНК
  • буферный раствор обеспечивает подходящую химическую среду для оптимальной активности и стабильности ДНК - полимеразы
  • двухвалентные катионы , обычноионы магния (Mg) или марганца (Mn); Mg 2+ является наиболее распространенным, но Mn 2+ можно использовать для PCR-опосредованного мутагенеза ДНК , поскольку более высокаяконцентрацияMn 2+ увеличивает частоту ошибок во время синтеза ДНК; [10] и одновалентные катионы , обычноионы калия (K) [ необходим лучший источник ]

Реакцию обычно проводят в объеме 10–200  мкл в небольших реакционных пробирках (объемом 0,2–0,5 мл) в термоциклере . Термоциклер нагревает и охлаждает реакционные трубки для достижения температур, необходимых на каждой стадии реакции (см. Ниже). Многие современные термоциклеры используют эффект Пельтье , который позволяет как нагревать, так и охлаждать блок, удерживающий трубки ПЦР, просто за счет изменения направления электрического тока. Тонкостенные реакционные трубки обеспечивают благоприятную теплопроводность для быстрого теплового равновесия. У большинства термоциклеров есть подогреваемые крышки для предотвращения конденсации.в верхней части реакционной трубки. Старые термоциклеры без подогреваемой крышки требуют слоя масла поверх реакционной смеси или шарика воска внутри трубки.

Процедура [ править ]

Как правило, ПЦР состоит из серии из 20–40 повторяющихся изменений температуры, называемых термическими циклами, причем каждый цикл обычно состоит из двух или трех дискретных температурных шагов (см. Рисунок ниже). Циклу часто предшествует один температурный шаг при очень высокой температуре (> 90 ° C (194 ° F)), за которым следует одно удержание в конце для увеличения объема продукта или кратковременного хранения. Используемые температуры и продолжительность их применения в каждом цикле зависят от множества параметров, включая фермент, используемый для синтеза ДНК, концентрацию двухвалентных ионов и dNTP в реакции и температуру плавления ( T m ) грунтовки. [11] Отдельные шаги, общие для большинства методов ПЦР, следующие:

  • Инициализация : этот шаг требуется только для ДНК-полимераз, требующих тепловой активации с помощью ПЦР с горячим стартом . [12] Он заключается в нагревании реакционной камеры до температуры 94–96 ° C (201–205 ° F) или 98 ° C (208 ° F), если используются чрезвычайно термостабильные полимеразы, после чего температура выдерживается в течение 1– 10 минут.
  • Денатурация : этот шаг является первым регулярным циклом цикла и заключается в нагревании реакционной камеры до 94–98 ° C (201–208 ° F) в течение 20–30 секунд. Это вызывает плавление ДНК или денатурацию матрицы двухцепочечной ДНК за счет разрыва водородных связей между комплементарными основаниями, в результате чего образуются две молекулы одноцепочечной ДНК.
  • Отжиг : на следующем этапе температура реакции снижается до 50–65 ° C (122–149 ° F) на 20–40 секунд, что позволяет отжиг праймеров для каждой из одноцепочечных ДНК-матриц. В реакционную смесь обычно включают два разных праймера: по одному для каждого из двух одноцепочечных комплементов, содержащих целевой участок. Праймеры сами по себе представляют собой одноцепочечные последовательности, но они намного короче, чем длина целевой области, и дополняют только очень короткие последовательности на 3'-конце каждой цепи.
Очень важно определить правильную температуру для этапа отжига, потому что на эффективность и специфичность сильно влияет температура отжига. Эта температура должна быть достаточно низкой, чтобы позволить гибридизацию праймера с цепью, но достаточно высокой, чтобы гибридизация была специфичной, т. Е. Праймер должен связываться только с полностью комплементарной частью цепи и нигде больше. Если температура будет слишком низкой, грунтовка может плохо закрепиться. Если он будет слишком высоким, праймер может вообще не схватиться. Типичная температура отжига примерно на 3–5 ° C ниже T m.использованных праймеров. Стабильные водородные связи между комплементарными основаниями образуются только тогда, когда последовательность праймера очень близко совпадает с последовательностью матрицы. На этом этапе полимераза связывается с гибридом праймер-матрица и начинает образование ДНК.
  • Удлинение / удлинение : температура на этом этапе зависит от используемой ДНК-полимеразы; Оптимальная температура активности для термостабильной ДНК-полимеразы Taq- полимеразы составляет примерно 75–80 ° C (167–176 ° F), [13] [14], хотя обычно при этом используется температура 72 ° C (162 ° F). фермент. На этом этапе ДНК-полимераза синтезирует новую цепь ДНК, комплементарную цепи ДНК-матрицы, путем добавления свободных dNTP из реакционной смеси, которые комплементарны матрице в направлении от 5'-к-3 ' , конденсируя 5'- фосфатную группу. дНТФ с 3'- гидроксильной группойна конце зарождающейся (удлиняющейся) цепи ДНК. Точное время, необходимое для удлинения, зависит как от используемой ДНК-полимеразы, так и от длины целевой области ДНК для амплификации. Как показывает опыт, при оптимальной температуре большинство ДНК-полимераз полимеризуют тысячу оснований в минуту. В оптимальных условиях (т. Е. Если нет ограничений из-за ограничивающих субстратов или реагентов) на каждой стадии удлинения / удлинения количество целевых последовательностей ДНК удваивается. В каждом последующем цикле исходные цепочки-матрицы плюс все вновь сгенерированные цепочки становятся цепями-матрицами для следующего раунда элонгации, что приводит к экспоненциальной (геометрической) амплификации конкретной целевой области ДНК.
Процессы денатурации, отжига и удлинения составляют единый цикл. Чтобы амплифицировать ДНК-мишень до миллионов копий, требуется несколько циклов. Формула, используемая для расчета количества копий ДНК, образованных после заданного количества циклов, - 2 n , где n - количество циклов. Таким образом, набор реакций для 30 циклов дает 2 30 , или 1 073 741 824 копий исходной целевой области двухцепочечной ДНК.
  • Окончательная элонгация : этот единственный этап не является обязательным, но выполняется при температуре 70–74 ° C (158–165 ° F) (температурный диапазон, необходимый для оптимальной активности большинства полимераз, используемых в ПЦР) в течение 5–15 минут после последний цикл ПЦР, чтобы убедиться, что любая оставшаяся одноцепочечная ДНК полностью удлинена.
  • Окончательная выдержка : на заключительном этапе реакционная камера охлаждается до 4–15 ° C (39–59 ° F) на неопределенное время и может использоваться для кратковременного хранения продуктов ПЦР.
Продукты ПЦР, окрашенные бромистым этидием, после гель-электрофореза . Два набора праймеров использовали для амплификации целевой последовательности из трех различных образцов ткани. В образце № 1 амплификации нет; Полосы ДНК в образцах №2 и №3 указывают на успешную амплификацию целевой последовательности. Гель также показывает положительный контроль и лестницу ДНК, содержащую фрагменты ДНК определенной длины для определения размера полос в экспериментальных ПЦР.

Чтобы проверить, успешно ли сгенерирована ПЦР ожидаемая область-мишень ДНК (также иногда называемая амплимером или ампликоном ), можно использовать электрофорез в агарозном геле для разделения по размеру продуктов ПЦР. Размер продуктов ПЦР определяется путем сравнения с « лестницей» ДНК , маркером молекулярной массы, который содержит фрагменты ДНК известного размера, который наносится на гель вместе с продуктами ПЦР.

Этапы [ править ]

Как и в случае с другими химическими реакциями, на скорость реакции и эффективность ПЦР влияют ограничивающие факторы. Таким образом, весь процесс ПЦР можно разделить на три этапа в зависимости от хода реакции:

  • Экспоненциальное усиление : в каждом цикле количество продукта удваивается (при 100% эффективности реакции). После 30 циклов единичная копия ДНК может быть увеличена до 1 000 000 000 (одного миллиарда) копий. Таким образом, в некотором смысле репликация дискретной цепи ДНК манипулируется в пробирке в контролируемых условиях. [15] Реакция очень чувствительна: должны присутствовать только незначительные количества ДНК.
  • Стадия выравнивания : реакция замедляется по мере того, как ДНК-полимераза теряет активность и потребление реагентов, таких как dNTP и праймеры, становится более ограниченным.
  • Плато : продукт больше не накапливается из-за исчерпания реагентов и ферментов.

Оптимизация [ править ]

Основная статья: Оптимизация ПЦР

На практике ПЦР может потерпеть неудачу по разным причинам, отчасти из-за ее чувствительности к контаминации, вызывающей амплификацию ложных продуктов ДНК. Из-за этого был разработан ряд методов и процедур для оптимизации условий ПЦР. [16] [17] Загрязнение посторонней ДНК решается с помощью лабораторных протоколов и процедур, которые отделяют пре-ПЦР-смеси от потенциальных загрязняющих ДНК. [7]Обычно это включает пространственное разделение областей установки ПЦР от областей для анализа или очистки продуктов ПЦР, использование одноразовой пластмассовой посуды и тщательную очистку рабочей поверхности между установками реакции. Методы конструирования праймеров важны для повышения выхода продуктов ПЦР и предотвращения образования ложных продуктов, а использование альтернативных компонентов буфера или ферментов полимеразы может помочь при амплификации длинных или других проблемных участков ДНК. Добавление реагентов, таких как формамид , в буферные системы может повысить специфичность и выход ПЦР. [18] Компьютерное моделирование теоретических результатов ПЦР ( электронная ПЦР ) может быть выполнено для помощи в разработке праймера. [19]

Приложения [ править ]

Селективное выделение ДНК [ править ]

ПЦР позволяет изолировать фрагменты ДНК из геномной ДНК путем селективной амплификации определенной области ДНК. Такое использование ПЦР дополняет многие способы, такие как создание зондов для гибридизации для Саузерн- или Нозерн- гибридизации и клонирования ДНК , которые требуют больших количеств ДНК, представляющих конкретную область ДНК. ПЦР обеспечивает эти методы с большим количеством чистой ДНК, что позволяет анализировать образцы ДНК даже из очень небольшого количества исходного материала.

Другие применения ПЦР включают секвенирование ДНК для определения неизвестных последовательностей, амплифицированных ПЦР, в которых один из праймеров для амплификации может быть использован в секвенировании по Сэнгеру , выделение последовательности ДНК для ускорения технологий рекомбинантной ДНК, включающих вставку последовательности ДНК в плазмиду , фаг , или космида (в зависимости от размера), или генетический материал другого организма. Бактериальные колонии (такие как E. coli ) можно быстро проверить с помощью ПЦР на предмет правильных векторных конструкций ДНК . [20] ПЦР также может использоваться для генетического снятия отпечатков пальцев.; судебно-медицинский метод, используемый для идентификации человека или организма путем сравнения экспериментальных ДНК с помощью различных методов на основе ПЦР.

Электрофорез ПЦР-амплифицированных фрагментов ДНК:
  1. Отец
  2. Ребенок
  3. Мать

Ребенок унаследовал некоторые, но не все отпечатки пальцев каждого из своих родителей, что дает ему новый уникальный отпечаток.

Некоторые методы отпечатков пальцев ПЦР обладают высокой различающей способностью и могут использоваться для выявления генетических родств между людьми, такими как родитель-ребенок или между братьями и сестрами, а также при проверке отцовства (рис. 4). Этот метод также может быть использован для определения эволюционных взаимоотношений между организмами, когда используются определенные молекулярные часы (например, гены 16S рРНК и recA микроорганизмов). [21]

Амплификация и количественная оценка ДНК [ править ]

Смотрите также: Использование ДНК в судебной энтомологии

Поскольку ПЦР амплифицирует участки ДНК, на которые она нацелена, ПЦР можно использовать для анализа очень малых объемов образца. Это часто имеет решающее значение для судебно-медицинской экспертизы , когда в качестве доказательства доступно только следовое количество ДНК. ПЦР также может использоваться для анализа древней ДНК , возраст которой насчитывает десятки тысяч лет. Эти основанные на ПЦР методы были успешно использованы на животных, таких как мамонт , которому сорок тысяч лет , а также на ДНК человека, в самых разных областях, от анализа египетских мумий до идентификации русского царя и тела Английский король Ричард III . [22]

Методы количественной ПЦР или ПЦР в реальном времени (qPCR, [23] не путать с RT-PCR ) позволяют оценить количество данной последовательности, присутствующей в образце - метод, часто применяемый для количественного определения уровней экспрессии генов . Количественная ПЦР - это признанный инструмент количественной оценки ДНК, который измеряет накопление продукта ДНК после каждого раунда амплификации ПЦР.

КПЦР позволяет количественно определять и обнаруживать конкретную последовательность ДНК в режиме реального времени, поскольку она измеряет концентрацию во время процесса синтеза. Есть два метода одновременного обнаружения и количественной оценки. Первый метод заключается в использовании люминесцентных ламп.красители, которые неспецифически удерживаются между двойными нитями. Второй метод включает зонды, которые кодируют определенные последовательности и флуоресцентно помечены. Обнаружение ДНК с помощью этих методов можно увидеть только после гибридизации зондов с их комплементарной ДНК. Интересной комбинацией методов является ПЦР в реальном времени и обратная транскрипция. Этот сложный метод, называемый RT-qPCR, позволяет количественно определять небольшое количество РНК. С помощью этого комбинированного метода мРНК преобразуется в кДНК, которая в дальнейшем количественно определяется с помощью кПЦР. Этот метод снижает вероятность ошибки в конечной точке ПЦР [24], увеличивая шансы обнаружения генов, связанных с генетическими заболеваниями, такими как рак. [4]Лаборатории используют ОТ-КПЦР для точного измерения регуляции генов. Математические основы для надежной количественной оценки ПЦР [25] и RT-qPCR [26] облегчают реализацию процедур точного подбора экспериментальных данных в приложениях для исследований, медицины, диагностики и инфекционных заболеваний. [27] [28] [29] [30]

Медицинские и диагностические приложения [ править ]

Потенциальные родители могут быть проверены на генетические носители , или их дети могут быть проверены на предмет наличия какого-либо заболевания . [1] Образцы ДНК для пренатального тестирования могут быть получены путем амниоцентеза , взятия проб ворсинок хориона или даже путем анализа редких фетальных клеток, циркулирующих в кровотоке матери. ПЦР-анализ также важен для преимплантационной генетической диагностики , когда отдельные клетки развивающегося эмбриона проверяются на наличие мутаций.

  • ПЦР также может использоваться как часть чувствительного теста для типирования тканей , жизненно важного для трансплантации органов . С 2008 года даже есть предложение заменить традиционные тесты на антитела для определения группы крови тестами на основе ПЦР. [31]
  • Многие формы рака связаны с изменениями онкогенов . Используя тесты на основе ПЦР для изучения этих мутаций, иногда можно индивидуально адаптировать режимы терапии к пациенту. ПЦР позволяет раннюю диагностику злокачественных заболеваний, таких как лейкемия и лимфомы , которые в настоящее время являются наиболее развитыми в исследованиях рака и уже используются в повседневной практике. ПЦР-анализы можно проводить непосредственно на образцах геномной ДНК для обнаружения злокачественных клеток, специфичных для транслокаций, с чувствительностью, которая по крайней мере в 10 000 раз выше, чем у других методов. [32]ПЦР очень полезна в области медицины, поскольку она позволяет изолировать и усилить опухолевые супрессоры. Например, количественная ПЦР может использоваться для количественного определения и анализа отдельных клеток, а также для распознавания ДНК, мРНК и подтверждений и комбинаций белков. [24]

Заявления об инфекционных заболеваниях [ править ]

ПЦР позволяет проводить быструю и высокоспецифичную диагностику инфекционных заболеваний, в том числе вызванных бактериями или вирусами. [33] ПЦР также позволяет идентифицировать не-cultivatable или медленно растущие микроорганизмы , такие как микобактерии , анаэробные бактерии или вирусы из культуры ткани анализов и животных моделей . Основой для диагностических приложений ПЦР в микробиологии является обнаружение инфекционных агентов и различение непатогенных штаммов от патогенных на основании специфических генов. [33] [34]

Характеристика и обнаружение возбудителей инфекционных заболеваний произвела революцию с помощью ПЦР следующим образом:

  • Вирус иммунодефицита человека (или ВИЧ ), является трудной целью найти и искоренить. Самые ранние тесты на инфекцию основывались на наличии антител к вирусу, циркулирующих в кровотоке. Однако антитела появляются только через несколько недель после заражения, материнские антитела маскируют инфекцию новорожденного, а терапевтические средства для борьбы с инфекцией не влияют на антитела. Были разработаны тесты ПЦР , которые могут обнаружить всего один вирусный геном среди ДНК более чем 50 000 клеток-хозяев. [35] Инфекции могут быть обнаружены раньше, донорская кровь может быть проверена непосредственно на вирус, новорожденные могут быть немедленно проверены на наличие инфекции, а эффективность противовирусного лечения может быть определена количественно..
  • Некоторые болезнетворные микроорганизмы, например туберкулезные , трудно получить от пациентов, и их медленно выращивать в лаборатории. Тесты на основе ПЦР позволили обнаружить небольшое количество болезнетворных организмов (как живых, так и мертвых) в удобных образцах . Подробный генетический анализ также может быть использован для выявления устойчивости к антибиотикам, что позволяет немедленно и эффективно лечить. Эффекты терапии также можно сразу оценить.
  • Распространение болезнетворного организма через популяции домашних или диких животных можно контролировать с помощью ПЦР. Во многих случаях появление новых вирулентных подтипов можно обнаружить и контролировать. Подтипы организма, которые были ответственны за более ранние эпидемии, также можно определить с помощью ПЦР-анализа.
  • Вирусную ДНК можно обнаружить с помощью ПЦР. Используемые праймеры должны быть специфичными для целевых последовательностей в ДНК вируса, и ПЦР может использоваться для диагностических анализов или секвенирования ДНК вирусного генома. Высокая чувствительность ПЦР позволяет обнаруживать вирус вскоре после заражения и даже до начала заболевания. [33] Такое раннее выявление может дать врачам значительное время для начала лечения. Количество вируса (« вирусная нагрузка ») у пациента также может быть определено количественно с помощью методов количественного определения ДНК на основе ПЦР (см. Ниже). Вариант ПЦР ( RT-PCR) используется для обнаружения вирусной РНК, а не ДНК: в этом тесте фермент обратная транскриптаза используется для создания последовательности ДНК, которая соответствует вирусной РНК; эта ДНК затем амплифицируется обычным методом ПЦР. ОТ-ПЦР широко используется для обнаружения вирусного генома SARS-CoV-2. [36]
  • Такие заболевания, как коклюш (или коклюш ) вызываются бактериями Bordetella pertussis . Эта бактерия характеризуется серьезной острой респираторной инфекцией, поражающей различных животных и людей и приводящей к гибели многих маленьких детей. Токсин коклюша представляет собой экзотоксин белка, который связывается с клеточными рецепторами двумя димерами и вступает в реакцию с различными типами клеток, такими как Т-лимфоциты, которые играют роль в клеточном иммунитете. [37] ПЦР - важный инструмент тестирования, с помощью которого можно обнаружить последовательности в гене токсина коклюша. Поскольку ПЦР имеет высокую чувствительность к токсину и быстрое время обработки, она очень эффективна для диагностики коклюша по сравнению с посевом. [38]

Криминалистические приложения [ править ]

Разработка протоколов генетической (или ДНК ) дактилоскопии на основе ПЦР нашла широкое применение в судебной медицине :

  • В своей наиболее разборчивой форме генетическая дактилоскопия может однозначно отличить любого человека от всего населения мира . Мельчайшие образцы ДНК можно выделить с места преступления и сравнить с образцами ДНК подозреваемых или из базы данных ДНК более ранних свидетельств или осужденных. Более простые версии этих тестов часто используются для быстрого исключения подозреваемых в ходе уголовного расследования. Доказательства преступлений давней давности могут быть проверены, подтвердив или оправдав первоначально осужденных.
  • Криминалистическое типирование ДНК стало эффективным способом выявления или оправдания подозреваемых в совершении преступлений благодаря анализу улик, обнаруженных на месте преступления. Геном человека имеет множество повторяющихся областей, которые можно найти в последовательностях генов или в некодирующих областях генома. В частности, до 40% ДНК человека повторяется. [4]Есть две различные категории этих повторяющихся некодирующих областей в геноме. Первая категория называется тандемными повторами с переменным числом (VNTR), длина которых составляет 10–100 пар оснований, а вторая категория называется короткими тандемными повторами (STR) и состоит из повторяющихся участков из 2–10 пар оснований. ПЦР используется для амплификации нескольких хорошо известных VNTR и STR с использованием праймеров, фланкирующих каждую из повторяющихся областей. Размеры фрагментов, полученных от любого человека для каждой из STR, будут указывать, какие аллели присутствуют. Путем анализа нескольких STR для отдельного человека будет обнаружен набор аллелей для каждого человека, который статистически может быть уникальным. [4] Исследователи определили полную последовательность генома человека. Эта последовательность может быть легко доступна через веб-сайт NCBI и используется во многих реальных приложениях. Например, ФБР составило набор сайтов ДНК-маркеров, используемых для идентификации, и они называются базой данных ДНК комбинированной системы индекса ДНК (CODIS). [4]Использование этой базы данных позволяет использовать статистический анализ для определения вероятности совпадения образца ДНК. ПЦР - очень мощный и важный аналитический инструмент, который можно использовать для криминалистического типирования ДНК, потому что исследователям нужно лишь очень небольшое количество целевой ДНК для анализа. Например, один человеческий волос с прикрепленным волосяным фолликулом содержит достаточно ДНК для проведения анализа. Точно так же несколько образцов спермы, образцов кожи из-под ногтей или небольшое количество крови могут предоставить достаточно ДНК для окончательного анализа. [4]
  • Менее разборчивые формы дактилоскопии ДНК могут помочь в проверке отцовства по ДНК , когда человека сравнивают со своими близкими родственниками. Можно протестировать ДНК неопознанных человеческих останков и сравнить с ДНК возможных родителей, братьев, сестер или детей. Аналогичное тестирование можно использовать для подтверждения биологических родителей усыновленного (или похищенного) ребенка. Фактический биологический отец новорожденного также может быть подтвержден (или исключен).
  • Было показано, что конструкция ПЦР AMGX / AMGY не только [ необходимо пояснение ] облегчает амплификацию последовательностей ДНК из очень небольшого количества генома. Однако его также можно использовать для определения пола в реальном времени по образцам костей. Это обеспечивает мощный и эффективный способ определения пола в судебных делах и древних образцах. [39]

Приложения для исследований [ править ]

ПЦР применялась во многих областях молекулярной генетики:

  • ПЦР позволяет быстро получить короткие фрагменты ДНК, даже если известна не более чем последовательность двух праймеров. Эта способность ПЦР дополняет многие методы, такие как создание зондов гибридизации для гибридизации по Саузерну или Нозерн-блоттингу . ПЦР обеспечивает эти методы с большим количеством чистой ДНК, иногда в виде одной нити, что позволяет проводить анализ даже из очень небольших количеств исходного материала.
  • Задача секвенирования ДНК также может быть облегчена с помощью ПЦР. Известные сегменты ДНК могут быть легко получены от пациента с генетической мутацией заболевания. Модификации метода амплификации могут извлекать сегменты из совершенно неизвестного генома или генерировать только одну цепочку интересующей области.
  • ПЦР имеет множество применений в более традиционном процессе клонирования ДНК . Он может извлекать сегменты для вставки в вектор из более крупного генома, который может быть доступен только в небольших количествах. Используя единый набор «векторных праймеров», он также может анализировать или извлекать фрагменты, которые уже были вставлены в векторы. Некоторые изменения в протоколе ПЦР могут вызвать мутации (общие или сайт-ориентированные) вставленного фрагмента.
  • Сайты с тегами последовательностей - это процесс, в котором ПЦР используется в качестве индикатора того, что определенный сегмент генома присутствует в конкретном клоне. Проект « Геном человека» нашел это приложение жизненно важным для картирования клонов космид, которые они секвенировали, и для координации результатов из разных лабораторий.
  • Применение ПЦР - филогенетический анализ ДНК из древних источников , таких как ДНК , найденная в восстановленных костях неандертальцев , из замороженных тканей мамонтов или из мозга египетских мумий. [15] В некоторых случаях сильно деградировавшая ДНК из этих источников может быть повторно собрана на ранних стадиях амплификации.
  • Распространенным применением ПЦР является изучение паттернов экспрессии генов . Ткани (или даже отдельные клетки) можно анализировать на разных этапах, чтобы увидеть, какие гены стали активными, а какие выключены. Это приложение также может использовать количественную ПЦР для количественного определения фактических уровней экспрессии.
  • Способность ПЦР одновременно амплифицировать несколько локусов от отдельных сперматозоидов [40] значительно расширила более традиционную задачу генетического картирования путем изучения хромосомных кроссоверов после мейоза . Редкие случаи кроссовера между очень близкими локусами наблюдались непосредственно при анализе тысяч отдельных сперматозоидов. Точно так же можно анализировать необычные делеции, вставки, транслокации или инверсии, и все это без необходимости ждать (или платить) за долгие и трудоемкие процессы оплодотворения, эмбриогенеза и т. Д.
  • Сайт-направленный мутагенез : ПЦР можно использовать для создания мутантных генов с мутациями, выбранными учеными по желанию. Эти мутации можно выбрать, чтобы понять, как белки выполняют свои функции, а также изменить или улучшить функцию белков.

Преимущества [ править ]

ПЦР имеет ряд преимуществ. Его довольно просто понять и использовать, и он быстро дает результаты. Этот метод очень чувствителен и позволяет производить от миллионов до миллиардов копий конкретного продукта для секвенирования, клонирования и анализа. qRT-PCR имеет те же преимущества, что и PCR, с дополнительным преимуществом количественной оценки синтезированного продукта. Поэтому его можно использовать для анализа изменений уровней экспрессии генов при опухолях, микробах или других болезненных состояниях. [24]

ПЦР - очень мощный и практичный инструмент исследования. ПЦР выясняет последовательность многих заболеваний неизвестной этиологии. Этот метод может помочь идентифицировать последовательность ранее неизвестных вирусов, связанных с уже известными, и таким образом дать нам лучшее понимание самого заболевания. Если можно будет еще больше упростить процедуру и разработать чувствительные нерадиометрические системы обнаружения, ПЦР займет видное место в клинической лаборатории на долгие годы. [15]

Ограничения [ править ]

Одним из основных ограничений ПЦР является то, что предварительная информация о целевой последовательности необходима для создания праймеров, которые позволят ее селективную амплификацию. [24] Это означает, что, как правило, пользователи ПЦР должны знать точную последовательность (последовательности) перед целевой областью на каждой из двух одноцепочечных матриц, чтобы гарантировать, что ДНК-полимераза должным образом связывается с гибридами праймер-матрица и впоследствии генерирует всю целевую область во время синтеза ДНК.

Как и все ферменты, ДНК-полимеразы также подвержены ошибкам, что, в свою очередь, вызывает мутации в генерируемых фрагментах ПЦР. [41]

Еще одно ограничение ПЦР состоит в том, что можно амплифицировать даже самое небольшое количество загрязняющей ДНК, что приводит к неверным или неоднозначным результатам. Чтобы свести к минимуму вероятность заражения, исследователи должны зарезервировать отдельные комнаты для подготовки реагентов, ПЦР и анализа продукта. Реагенты следует распределять по одноразовым аликвотам . Следует регулярно использовать дозаторы со сменными поршнями и удлиненными наконечниками для дозаторов. [15]

Образцы окружающей среды, содержащие гуминовые кислоты, могут препятствовать амплификации ПЦР и приводить к неточным результатам.

Варианты [ править ]

Основная статья: Варианты ПЦР
  • Аллель-специфическая ПЦР : метод диагностики или клонирования, основанный на однонуклеотидных вариациях (SNV не следует путать с SNP ) (различия в одном основании у пациента). Это требует предварительного знания последовательности ДНК, включая различия между аллелями , и использует праймеры, 3'-концы которых охватывают SNV (обычно включаемый буфер пары оснований вокруг SNV). ПЦР-амплификация в строгих условиях намного менее эффективна при наличии несоответствия между матрицей и праймером, поэтому успешная амплификация с помощью SNP-специфичного праймера сигнализирует о наличии специфического SNP в последовательности. [42] См. SNP-генотипирование для получения дополнительной информации.
  • Сборочная ПЦР или полимеразная циклическая сборка (PCA) : искусственный синтез длинных последовательностей ДНК путем выполнения ПЦР на пуле длинных олигонуклеотидов с короткими перекрывающимися сегментами. Олигонуклеотиды чередуются между смысловым и антисмысловым направлениями, и перекрывающиеся сегменты определяют порядок фрагментов ПЦР, тем самым избирательно продуцируя конечный продукт длинной ДНК. [43]
  • Асимметричная ПЦР : предпочтительно амплифицирует одну цепь ДНК в матрице двухцепочечной ДНК. Он используется при секвенировании и гибридизационном зондировании, когда требуется амплификация только одной из двух комплементарных цепей. ПЦР проводится как обычно, но с большим избытком праймера для цепи, предназначенной для амплификации. Из-за медленной ( арифметической ) амплификации на более поздних стадиях реакции после того, как ограничивающий праймер израсходован, требуются дополнительные циклы ПЦР. [44] В недавней модификации этого процесса, известной как L inear- A fter- T he- E xponential-PCR (LATE-PCR), используется ограничивающий праймер с более высокой температурой плавления ( Tm ), чем избыток праймера для поддержания эффективности реакции, так как предельная концентрация праймера уменьшается в середине реакции. [45]
  • Конвективная ПЦР : псевдоизотермический способ проведения ПЦР. Вместо многократного нагрева и охлаждения смеси для ПЦР раствор подвергается температурному градиенту. Возникающий в результате конвективный поток, вызванный термической нестабильностью, автоматически перетасовывает реагенты ПЦР из горячих и холодных областей, многократно обеспечивая ПЦР. [46] Такие параметры, как тепловые граничные условия и геометрия корпуса ПЦР, могут быть оптимизированы для получения надежной и быстрой ПЦР за счет использования появления хаотических полей потока. [47] Такая установка ПЦР с конвективным потоком значительно снижает потребляемую мощность устройства и время работы.
  • Dial-out PCR : высокопараллельный метод получения точных молекул ДНК для синтеза генов. Сложная библиотека молекул ДНК модифицируется уникальными фланкирующими тегами перед массовым параллельным секвенированием. Затем праймеры, ориентированные на метки, позволяют получать молекулы с желаемыми последовательностями с помощью ПЦР. [48]
  • Цифровая ПЦР (dPCR) : используется для измерения количества целевой последовательности ДНК в образце ДНК. Образец ДНК сильно разбавлен, поэтому после нескольких параллельных ПЦР некоторые из них не получают ни одной молекулы целевой ДНК. Концентрация целевой ДНК рассчитывается с использованием доли отрицательных результатов. Отсюда и название «цифровая ПЦР».
  • Зависимая от геликазы амплификация : похожа на традиционную ПЦР, но использует постоянную температуру, а не циклическую денатурацию и циклы отжига / удлинения. ДНК-геликаза , фермент, раскручивающий ДНК, используется вместо тепловой денатурации. [49]
  • ПЦР с горячим стартом : метод, который снижает неспецифическую амплификацию на начальных этапах настройки ПЦР. Это может быть выполнено вручную путем нагревания компонентов реакции до температуры денатурации (например, 95 ° C) перед добавлением полимеразы. [50] Были разработаны специализированные ферментные системы, которые ингибируют активность полимеразы при температуре окружающей среды либо за счет связывания антитела [12] [51], либо за счет присутствия ковалентно связанных ингибиторов, которые диссоциируют только после стадии высокотемпературной активации. ПЦР с горячим стартом / холодным окончанием достигается с помощью новых гибридных полимераз, которые неактивны при температуре окружающей среды и мгновенно активируются при температуре элонгации.
  • In silico PCR (цифровая ПЦР, виртуальная ПЦР, электронная ПЦР, e-PCR) относится к вычислительным инструментам, используемым для вычисления теоретических результатов полимеразной цепной реакции с использованием заданного набора праймеров ( зондов ) для амплификациипоследовательностей ДНК из секвенированного генома или транскриптома . In silico ПЦР ​​была предложена в качестве образовательного инструмента для молекулярной биологии. [52]
  • Intersequence-specific PCR (ISSR): метод ПЦР для снятия отпечатков пальцев ДНК, при котором амплифицируются области между простыми повторами последовательностей для получения уникального отпечатка длины амплифицированных фрагментов. [53]
  • Обратная ПЦР : обычно используется для идентификации фланкирующих последовательностей вокруг геномных вставок. Он включает в себя серию перевариваний ДНК и самолигирование , в результате чего на любом конце неизвестной последовательностиполучаютизвестные последовательности. [54]
  • ПЦР, опосредованная лигированием: использует небольшие линкеры ДНК, лигированные с интересующей ДНК, и отжиг нескольких праймеров с линкерами ДНК; его использовали для секвенирования ДНК , прогулок по геному и снятия следов ДНК . [55]
  • ПЦР, специфичная для метилирования (MSP): разработана Стивеном Бейлином и Джеймсом Г. Херманом из Медицинской школы Джонса Хопкинса [56] и используется для обнаружения метилирования CpG-островков в геномной ДНК. Сначала ДНК обрабатывают бисульфитом натрия, который превращает неметилированные цитозиновые основания в урацил, который распознается праймерами ПЦР как тимин. Затем проводят две ПЦР на модифицированной ДНК с использованием идентичных наборов праймеров, за исключением любых островков CpG в последовательностях праймеров. В этих точках один набор праймеров распознает ДНК с цитозинами для амплификации метилированной ДНК, а один набор распознает ДНК с урацилом или тимином для амплификации неметилированной ДНК. MSP с использованием qPCR также может быть выполнено для получения количественной, а не качественной информации о метилировании.
  • Минипраймерная ПЦР : использует термостабильную полимеразу (S-Tbr), которая может происходить от коротких праймеров (smalligos) длиной от 9 до 10 нуклеотидов. Этот метод позволяет нацеливать ПЦР на меньшие участки связывания праймеров и используется для амплификации консервативных последовательностей ДНК, таких как ген 16S (или эукариотического 18S) рРНК. [57]
  • Мультиплексная амплификация зонда, зависящая от лигирования ( MLPA ): позволяет амплифицировать несколько мишеней с помощью одной пары праймеров, что позволяет избежать ограничений разрешения мультиплексной ПЦР (см. Ниже).
  • Мультиплексная ПЦР : состоит из нескольких наборов праймеров в одной смеси ПЦР для получения ампликонов различного размера, специфичных для разных последовательностей ДНК. Путем нацеливания на несколько генов одновременно можно получить дополнительную информацию из одного теста, для которого в противном случае потребовалось бы в несколько раз больше реагентов и больше времени для выполнения. Температуры отжига для каждого из наборов праймеров должны быть оптимизированы для правильной работы в рамках одной реакции, а также размеры ампликонов. То есть их длина пары оснований должна быть достаточно различной, чтобы образовывать отдельные полосы при визуализации с помощью гель-электрофореза .
  • ПЦР с использованием наночастиц (наноПЦР) : некоторые наночастицы (НЧ) могут повысить эффективность ПЦР (таким образом, называемые наноПЦР), а некоторые могут даже превзойти оригинальные усилители ПЦР. Сообщалось, что квантовые точки (КТ) могут улучшить специфичность и эффективность ПЦР. Однослойные углеродные нанотрубки (ОСУНТ) и многостенные углеродные нанотрубки (МУНТ) эффективны для увеличения амплификации длинной ПЦР. Углеродный нанопорошок (CNP) может повысить эффективность повторной ПЦР и длинной ПЦР, в то время как оксид цинка , диоксид титанаи было обнаружено, что НЧ Ag увеличивают выход ПЦР. Предыдущие данные показали, что неметаллические НЧ сохраняют приемлемую точность амплификации. Учитывая, что многие НЧ способны повысить эффективность ПЦР, очевидно, что существует большой потенциал для усовершенствования технологии наноПЦР и разработки продуктов. [58] [59]
  • Вложенная ПЦР : увеличивает специфичность амплификации ДНК за счет снижения фона из-за неспецифической амплификации ДНК. Два набора праймеров используют в двух последовательных ПЦР. В первой реакции одна пара праймеров используется для создания продуктов ДНК, которые, помимо намеченной мишени, могут еще состоять из неспецифически амплифицированных фрагментов ДНК. Затем продукт (-ы) используют во второй ПЦР с набором праймеров, сайты связывания которых полностью или частично отличаются от каждого из праймеров, использованных в первой реакции, и расположены на 3 '. Вложенная ПЦР часто более успешна для специфической амплификации длинных фрагментов ДНК, чем обычная ПЦР, но требует более детального знания целевых последовательностей.
  • ПЦР с удлинением с перекрытием или сплайсинг путем удлинения с перекрытием (SOEing) :метод генной инженерии , который используется для сращивания вместе двух или более фрагментов ДНК, содержащих комплементарные последовательности. Он используется для соединения частей ДНК, содержащих гены, регуляторные последовательности или мутации; методика позволяет создавать специфические и длинные конструкции ДНК. Он также может вносить делеции, вставки или точечные мутации в последовательность ДНК. [60] [61]
  • PAN-AC : использует изотермические условия для амплификации и может использоваться в живых клетках. [62] [63]
  • количественная ПЦР (кПЦР): используется для измерения количества целевой последовательности (обычно в режиме реального времени). Он количественно измеряет начальные количества ДНК, кДНК или РНК. Количественная ПЦР обычно используется для определения наличия последовательности ДНК в образце и количества ее копий в образце. Количественная ПЦР имеет очень высокую степень точности. В количественных методах ПЦР используются флуоресцентные красители, такие как Sybr Green, EvaGreen, илиДНК-зонды, содержащие флуорофор , такие как TaqMan , для измерения количества амплифицированного продукта в реальном времени. Его также иногда сокращают до ОТ-ПЦР ( ПЦР в реальном времени ), но это сокращение следует использовать только дляПЦР с обратной транскрипцией . КПЦР - это подходящие сокращения для количественной ПЦР ( ПЦР в реальном времени).
  • ПЦР с обратной транскрипцией ( ОТ-ПЦР ) : для амплификации ДНК из РНК. Обратная транскриптаза осуществляет обратную транскрипцию РНК в кДНК , которая затем амплифицируется с помощью ПЦР. ОТ-ПЦР широко используется при профилировании экспрессии для определения экспрессии гена или для идентификации последовательности транскрипта РНК, включая сайты начала и окончания транскрипции. Если последовательность геномной ДНК гена известна, ОТ-ПЦР может быть использована для картирования расположения экзонов и интронов в гене. 5'-конец гена (соответствующий сайту начала транскрипции) обычно идентифицируется с помощью RACE-PCR ( Rapid Amplification of cDNA Ends).).
  • РНКаза H-зависимая ПЦР (rhPCR): модификация ПЦР, в которой используются праймеры с 3'-блоком удлинения, который может быть удален термостабильным ферментом РНКазой HII. Эта система уменьшает количество димеров праймеров и позволяет проводить мультиплексные реакции с большим количеством праймеров. [64]
  • ПЦР с одним специфическим праймером (SSP-PCR): позволяет амплифицировать двухцепочечную ДНК, даже если информация о последовательности доступна только на одном конце. Этот метод допускает амплификацию генов, для которых доступна только частичная информация о последовательности, и позволяет однонаправленно перемещаться по геному из известных в неизвестные области хромосомы. [65]
  • Твердофазная ПЦР : охватывает несколько значений, включая амплификацию полонии (где колонии ПЦР образуются, например, в гелевой матрице), мостиковая ПЦР [66] (праймеры ковалентно связаны с поверхностью твердой подложки), обычная твердофазная ПЦР (где Асимметричная ПЦР применяется в присутствии праймера, несущего твердую подложку, с последовательностью, соответствующей одному из водных праймеров) и расширенной твердофазной ПЦР [67] (где обычная твердофазная ПЦР может быть улучшена путем использования праймера с высокой Tm и вложенной твердой подложки с необязательным нанесением. термической «ступеньки» для облегчения грунтования твердой основы).
  • Самоубийственная ПЦР : обычно используется в палеогенетике или других исследованиях, где предотвращение ложноположительных результатов и обеспечение специфичности амплифицированного фрагмента является наивысшим приоритетом. Первоначально он был описан в исследовании для проверки наличия микроба Yersinia pestis в образцах зубов, взятых из могил 14-го века людей, предположительно убитых чумой во время средневековой эпидемии черной смерти . [68]Этот метод предписывает использование любой комбинации праймеров только один раз в ПЦР (отсюда и термин «самоубийство»), который никогда не должен использоваться в какой-либо положительной контрольной реакции ПЦР, и праймеры всегда должны быть нацелены на область генома, никогда ранее не амплифицированную в lab с использованием этого или любого другого набора праймеров. Это гарантирует, что в лаборатории не будет загрязняющей ДНК из предыдущих реакций ПЦР, которая в противном случае могла бы привести к ложноположительным результатам.
  • Термическая асимметричная ПЦР с чересстрочной разверткой (TAIL-PCR) : для выделения неизвестной последовательности, фланкирующей известную последовательность. В пределах известной последовательности TAIL-PCR использует вложенную пару праймеров с разными температурами отжига; вырожденный праймер используется для амплификации в направлении, противоположном неизвестной последовательности. [69]
  • Touchdown PCR ( Step-down PCR ): вариант ПЦР, который направлен на снижение неспецифического фона путем постепенного снижения температуры отжига по мере продвижения цикла ПЦР. Температура отжига в начальных циклах обычно на несколько градусов (3–5 ° C) выше T m используемых праймеров, в то время как на более поздних циклах она на несколько градусов (3–5 ° C) ниже T праймера. м . Более высокие температуры обеспечивают большую специфичность связывания праймеров, а более низкие температуры позволяют более эффективно амплифицировать специфические продукты, образованные во время начальных циклов. [70]
  • Универсальная быстрая ходьба : для прогулок по геному и генетического дактилоскопирования с использованием более специфической «двусторонней» ПЦР, чем традиционные «односторонние» подходы (с использованием только одного специфичного для генов праймера и одного общего праймера, что может привести к искусственному «шуму») [71] в силу механизма формирования лариатной структуры. Оптимизированными производными UFW являются LaNe RAGE (лариат-зависимая вложенная ПЦР для быстрой амплификации концов геномной ДНК), [72] 5'RACE LaNe [73] и 3'RACE LaNe. [74]

История [ править ]

Схематическое изображение примера пары праймеров. Использование праймеров в анализе in vitro, позволяющее синтез ДНК, было важным нововведением, позволившим разработать ПЦР.
Основная статья: История полимеразной цепной реакции

Термостойкие ферменты, которые являются ключевым компонентом полимеразной цепной реакции, были обнаружены в 1960-х годах как продукт микробной формы жизни, обитавшей в перегретых водах Грибного источника Йеллоустоуна . [75]

1971 г. , в статье журнала молекулярной биологии по Kjell Клеппе и сотрудниками в лаборатории H. Gobind Khorana впервые описан способ использования ферментативного анализа , чтобы повторить короткую ДНК - матрицы с использованием праймеров в пробирке . [76] Однако это раннее проявление основного принципа ПЦР не получило особого внимания в то время, и изобретение полимеразной цепной реакции в 1983 году обычно приписывают Кэри Муллис . [77]

"Baby Blue", прототип машины 1986 года для проведения ПЦР.

Когда Маллис разработал ПЦР в 1983 году, он работал в Эмеривилле , штат Калифорния, в Cetus Corporation , одной из первых биотехнологических компаний, где он отвечал за синтез коротких цепочек ДНК. Муллис написал, что он задумал идею PCR, путешествуя по шоссе Тихоокеанского побережья однажды ночью на своей машине. [78] Он мысленно обыгрывал новый способ анализа изменений (мутаций) в ДНК, когда понял, что вместо этого изобрел метод амплификации любой области ДНК посредством повторяющихся циклов дупликации под действием ДНК-полимеразы. В журнале Scientific AmericanМуллис резюмировал процедуру: «Начиная с одной молекулы ДНК генетического материала, ПЦР может генерировать 100 миллиардов подобных молекул за полдень. Реакцию легко выполнить. Для этого требуется не более чем пробирка, несколько простых реагентов. , и источник тепла ". [79] ДНК-отпечатки пальцев были впервые использованы для установления отцовства в 1988 году. [80]

Муллис был удостоен Нобелевской премии по химии в 1993 году за свое изобретение, через семь лет после того, как он и его коллеги из Cetus впервые реализовали свое предложение на практике. [81] Работа Маллиса 1985 года с Р.К. Сайки и Х.А. Эрлихом «Ферментативная амплификация геномных последовательностей β-глобина и анализ сайтов рестрикции для диагностики серповидноклеточной анемии» - изобретение полимеразной цепной реакции (ПЦР) - была отмечена премией Citation for Chemical Премия за прорыв от Отдела истории химии Американского химического общества в 2017 году. [82] [1]

В основе метода ПЦР лежит использование подходящей ДНК-полимеразы, способной выдерживать высокие температуры> 90 ° C (194 ° F), необходимые для разделения двух цепей ДНК в двойной спирали ДНК после каждого цикла репликации . ДНК-полимеразы, первоначально использованные для экспериментов in vitro перед ПЦР, не выдерживали таких высоких температур. [1] Таким образом, ранние процедуры репликации ДНК были очень неэффективными и трудоемкими, требовали большого количества ДНК-полимеразы и непрерывной обработки на протяжении всего процесса.

Открытие в 1976 году Taq полимеразы -a ДНК - полимеразы очищали из термофильных бактерий , Thermus адиайсиза , что , естественно , живет в жарких ( от 50 до 80 ° C (122 до 176 ° F)) среды [13] , таких как горячие источники-проложил способ кардинального улучшения метода ПЦР. ДНК-полимераза, выделенная из T. aquaticus , стабильна при высоких температурах, оставаясь активной даже после денатурации ДНК [14], что устраняет необходимость добавления новой ДНК-полимеразы после каждого цикла. [2] Это позволило автоматизировать процесс амплификации ДНК на основе термоциклера.

Патентные споры [ править ]

Метод ПЦР был запатентован Кэри Муллис и передан Cetus Corporation , где Маллис работал, когда изобрел метод в 1983 году. Фермент полимераза Taq также был защищен патентами. Было несколько громких судебных исков, связанных с этой техникой, в том числе безуспешный судебный процесс, поданный DuPont . Швейцарская фармацевтическая компания Hoffmann-La Roche приобрела права на патенты в 1992 году и в настоящее время [ когда? ] содержит те, которые все еще защищены.

Связанная с этим патентная битва за фермент полимеразу Taq все еще продолжается в нескольких юрисдикциях по всему миру между компаниями Roche и Promega . Юридические аргументы вышли за рамки срока действия оригинальных патентов на ПЦР и Taq- полимеразу, срок действия которых истек 28 марта 2005 г. [83]

См. Также [ править ]

  • COVID-19 тестирование
  • Всплеск ДНК
  • Петлевая изотермическая амплификация
  • Селектор-техника

Ссылки [ править ]

  1. ^ a b c d Сайки Р.К., Шарф С., Фалуна Ф., Маллис КБ, Хорн Г.Т., Эрлих HA, Арнхейм Н. (декабрь 1985 г.). «Ферментативная амплификация геномных последовательностей бета-глобина и анализ сайтов рестрикции для диагностики серповидноклеточной анемии». Наука . 230 (4732): 1350–4. Bibcode : 1985Sci ... 230.1350S . DOI : 10.1126 / science.2999980 . PMID  2999980 .
  2. ^ а б Сайки Р.К., Гельфанд Д.Х., Стоффель С., Шарф С.Дж., Хигучи Р., Хорн Г.Т. и др. (Январь 1988 г.). «Праймер-направленная ферментативная амплификация ДНК с термостабильной ДНК-полимеразой». Наука . 239 (4839): 487–91. Bibcode : 1988Sci ... 239..487S . DOI : 10.1126 / science.239.4839.487 . PMID 2448875 . 
  3. ^ Эннерс, Эдвард; Порта, Анджела Р. (2012). «Определение температуры отжига для полимеразной цепной реакции». Американский учитель биологии . 74 (4): 256–260. DOI : 10,1525 / abt.2012.74.4.9 . S2CID 86708426 . 
  4. ^ a b c d e f Нинфа, Александр; Баллоу, Дэвид; Бенор, Марили (2009). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии . США: Wiley. С. 408–10. ISBN 978-0-47008766-4.
  5. ^ Ченг S, Fockler С, Barnes WM, Хигути R (июнь 1994). «Эффективная амплификация длинных мишеней из клонированных вставок и геномной ДНК человека» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 91 (12): 5695–9. Bibcode : 1994PNAS ... 91.5695C . DOI : 10.1073 / pnas.91.12.5695 . PMC 44063 . PMID 8202550 .  
  6. Перейти ↑ Carr AC, Moore SD (2012). Люсия А. (ред.). «Надежная количественная оценка полимеразных цепных реакций с использованием глобального подбора» . PLOS ONE . 7 (5): e37640. Bibcode : 2012PLoSO ... 737640C . DOI : 10.1371 / journal.pone.0037640 . PMC 3365123 . PMID 22701526 .  
  7. ^ а б Джозеф Сэмбрук и Дэвид В. Рассел (2001). Молекулярное клонирование: лабораторное руководство (3-е изд.). Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк: Лаборатория Колд-Спринг-Харбор. ISBN 978-0-879-69576-7. Глава 8: Амплификация ДНК in vitro с помощью полимеразной цепной реакции
  8. ^ «Полимеразная цепная реакция (ПЦР)» . Национальный центр биотехнологической информации, Национальная медицинская библиотека США.
  9. ^ «ПЦР» . Учебный центр генетических наук Университета Юты .
  10. ^ Павлов А.Р., Павлова Н.В., Козявкин С.А., Слесарев А.И. (май 2004 г.). «Последние разработки в области оптимизации термостабильных ДНК-полимераз для эффективного применения». Тенденции в биотехнологии . 22 (5): 253–60. DOI : 10.1016 / j.tibtech.2004.02.011 . PMID 15109812 . 
  11. ^ Rychlik W, Спенсер WJ, Роудс RE (ноябрь 1990). «Оптимизация температуры отжига для амплификации ДНК in vitro» . Исследования нуклеиновых кислот . 18 (21): 6409–12. DOI : 10.1093 / NAR / 18.21.6409 . PMC 332522 . PMID 2243783 .  
  12. ^ a b Sharkey DJ, Scalice ER, Christy KG, Atwood SM, Daiss JL (май 1994). «Антитела как термолабильные переключатели: высокотемпературный запуск полимеразной цепной реакции». Био / Технологии . 12 (5): 506–9. DOI : 10.1038 / nbt0594-506 . PMID 7764710 . S2CID 2885453 .  
  13. ↑ a b Chien A, Edgar DB, Trela ​​JM (сентябрь 1976 г.). «Полимераза дезоксирибонуклеиновой кислоты из крайнего термофила Thermus aquaticus» . Журнал бактериологии . 127 (3): 1550–7. DOI : 10.1128 / jb.127.3.1550-1557.1976 . PMC 232952 . PMID 8432 .  
  14. ^ a b Адвокат FC, Stoffel S, Saiki RK, Chang SY, Landre PA, Abramson RD, Gelfand DH (май 1993 г.). «Высокий уровень экспрессии, очистки и ферментативной характеристики полноразмерной ДНК-полимеразы Thermus aquaticus и укороченной формы с дефицитом экзонуклеазной активности от 5 'до 3'» . Методы и приложения ПЦР . 2 (4): 275–87. DOI : 10.1101 / gr.2.4.275 . PMID 8324500 . 
  15. ^ a b c d Schochetman G, Ou CY, Jones WK (декабрь 1988 г.). "Полимеразной цепной реакции". Журнал инфекционных болезней . 158 (6): 1154–7. DOI : 10.1093 / infdis / 158.6.1154 . JSTOR 30137034 . PMID 2461996 .  
  16. ^ Борман, Джон; Шустер, Дэвид; Ли, Ву-бо; Джесси, Джоэл; Рашчян, Аюб (2000). «ПЦР из проблемных шаблонов» (PDF) . Сосредоточьтесь . 22 (1): 10. Архивировано из оригинального (PDF) 7 марта 2017 года.
  17. ^ Богетто, Прачи; Вайдн, Лиза; Андерсон, Холли (2000). «Полезные советы по ПЦР» (PDF) . Сосредоточьтесь . 22 (1): 12. Архивировано из оригинального (PDF) 7 марта 2017 года.
  18. ^ Саркаром G, Kapelner S, Sommer SS (декабрь 1990). «Формамид может значительно улучшить специфичность ПЦР» . Исследования нуклеиновых кислот . 18 (24): 7465. DOI : 10,1093 / NAR / 18.24.7465 . PMC 332902 . PMID 2259646 .  
  19. ^ «Электронная ПЦР» . NCBI - Национальный центр биотехнологической информации . Проверено 13 марта 2012 года .
  20. ^ Павлов А.Р., Павлова Н.В., Козявкин С.А., Слесарев А.И. (2006). «Термостабильные ДНК-полимеразы для широкого спектра применений: сравнение надежного гибридного TopoTaq с другими ферментами». В Kieleczawa J (ред.). Секвенирование ДНК II: Оптимизация подготовки и очистки . Джонс и Бартлетт. С. 241–57. ISBN 978-0-7637-3383-4.
  21. ^ Pombert JF, СисТек V, Boissinot M, Frenette M (октябрь 2009). «Эволюционные отношения между стрептококками salivarius, выведенные из мультилокусных филогений на основе кодирующих 16S рРНК последовательностей генов recA, secA и secY» . BMC Microbiology . 9 : 232. DOI : 10,1186 / 1471-2180-9-232 . PMC 2777182 . PMID 19878555 .  
  22. ^ «Химический синтез, секвенирование и амплификация ДНК (классные заметки по MBB / BIO 343)» . Государственный университет Аризоны. Архивировано из оригинала 9 октября 1997 года . Проверено 29 октября 2007 года .
  23. ^ Бастин С.А., Бенес В., Гарсон Дж. А., Хеллеманс Дж., Хаггетт Дж., Кубиста М. и др. (Апрель 2009 г.). «Рекомендации MIQE: минимум информации для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени» (PDF) . Клиническая химия . 55 (4): 611–22. DOI : 10,1373 / clinchem.2008.112797 . PMID 19246619 .  
  24. ^ a b c d Гарибян Л., Авашия Н. (март 2013 г.). «Полимеразная цепная реакция» . Журнал следственной дерматологии . 133 (3): 1–4. DOI : 10.1038 / jid.2013.1 . PMC 4102308 . PMID 23399825 .  
  25. ^ Schnell, S .; Мендоса, К. (октябрь 1997 г.). «Теоретическое описание полимеразной цепной реакции» . Журнал теоретической биологии . 188 (3): 313–318. DOI : 10,1006 / jtbi.1997.0473 . PMID 9344735 . 
  26. ^ Schnell, S .; Мендоса, К. (21 февраля 1997 г.). «Энзимологические соображения для теоретического описания количественной конкурентной полимеразной цепной реакции (QC-PCR)» . Журнал теоретической биологии . 184 (4): 433–440. DOI : 10,1006 / jtbi.1996.0283 . ISSN 0022-5193 . PMID 9082073 .  
  27. ^ Беккер, Свен; Бегер, Питер; Oehlmann, Ralfh; Эрнст, Аннелиз (1 ноября 2000 г.). «Смещение ПЦР в экологическом анализе: пример количественного анализа нуклеазы Taq в анализе микробных сообществ» . Прикладная и экологическая микробиология . 66 (11): 4945–4953. DOI : 10,1128 / AEM.66.11.4945-4953.2000 . ISSN 1098-5336 . PMC 92404 . PMID 11055948 .   
  28. ^ Соломон, Энтони У .; Пилинг, Rosanna W .; Фостер, Аллен; Мабей, Дэвид CW (1 октября 2004 г.). «Диагностика и оценка трахомы» . Обзоры клинической микробиологии . 17 (4): 982–1011. DOI : 10.1128 / CMR.17.4.982-1011.2004 . ISSN 0893-8512 . PMC 523557 . PMID 15489358 .   
  29. ^ Рамзи, Реда MR (апрель 2002). «Последние достижения в области молекулярных методов диагностики лимфатического филяриатоза человека и их использование в эпидемиологических исследованиях» . Труды Королевского общества тропической медицины и гигиены . 96 : S225 – S229. DOI : 10.1016 / S0035-9203 (02) 90080-5 . PMID 12055843 . 
  30. ^ Sachse, Конрад (2003). Сакс, Конрад; Фрей, Иоахим (ред.). «Специфичность и эффективность диагностических ПЦР-тестов». ПЦР-детекция микробных патогенов . Методы молекулярной биологии. Тотова, Нью-Джерси: Humana Press. 216 : 3–29. DOI : 10.1385 / 1-59259-344-5: 03 . ISBN 978-1-59259-344-6. PMID  12512353 .
  31. ↑ Quill E (март 2008 г.). «Медицина. Сопоставление крови идет генетически». Наука . 319 (5869): 1478–9. DOI : 10.1126 / science.319.5869.1478 . PMID 18339916 . S2CID 36945291 .  
  32. ^ Томар, Rukam (2010). Молекулярные маркеры и биотехнология растений . Питман Пура, Нью-Дели: Издательское агентство Новой Индии. п. 188. ISBN 978-93-80235-25-7.
  33. ^ a b c Cai HY, Caswell JL, Prescott JF (март 2014 г.). «Некультуральные молекулярные методы диагностики бактериальных заболеваний у животных: перспективы диагностической лаборатории» . Ветеринарная патология . 51 (2): 341–50. DOI : 10.1177 / 0300985813511132 . PMID 24569613 . 
  34. Перейти ↑ Salis AD (2009). «Приложения в клинической микробиологии». ПЦР в реальном времени: современные технологии и приложения . Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-39-4.
  35. ^ Kwok S, Mack DH, Mullis KB, Poiesz B, Ehrlich G, Blair D и др. (Май 1987 г.). «Идентификация последовательностей вируса иммунодефицита человека с использованием ферментативной амплификации in vitro и обнаружения расщепления олигомеров» . Журнал вирусологии . 61 (5): 1690–4. DOI : 10.1128 / jvi.61.5.1690-1694.1987 . PMC 254157 . PMID 2437321 .  
  36. ^ «Коронавирус: тест il viaggio dei» . Istituto Superiore di Sanità .
  37. ↑ Палец, Хорст; фон Кениг, Карл Хайнц Вирсинг (1996). Барон, Самуил (ред.). Медицинская микробиология (4-е изд.). Галвестон, Техас: Медицинский филиал Техасского университета в Галвестоне. ISBN 978-0-96311721-2. PMID  21413270 .
  38. ^ Да, Сильвия Х .; Норка, КрисАнна М. (2012). «Bordetella pertussis и коклюш (коклюш)». Инфекционные болезни Неттера . Инфекционные болезни Неттера . С. 11–14. DOI : 10.1016 / B978-1-4377-0126-5.00003-3 . ISBN 978-1-43770126-5.
  39. ^ Алонсо А., Мартин П., Альбарран С., Гарсия П., Гарсия О., де Симон Л. Ф. и др. (Январь 2004 г.). «Проекты ПЦР в реальном времени для оценки количества копий ядерной и митохондриальной ДНК в судебно-медицинских исследованиях и исследованиях древней ДНК». Международная криминалистическая экспертиза . 139 (2–3): 141–9. DOI : 10.1016 / j.forsciint.2003.10.008 . PMID 15040907 . 
  40. ^ Boehnke M, N Арнгейм, Ли H, Collins FS (июль 1989). «Тонкая структура генетического картирования хромосом человека с использованием полимеразной цепной реакции на одном сперматозоиде: соображения экспериментального дизайна» . Американский журнал генетики человека . 45 (1): 21–32. PMC 1683385 . PMID 2568090 .  
  41. ↑ Zhou YH, Zhang XP, Ebright RH (ноябрь 1991 г.). «Случайный мутагенез молекул ДНК размером с ген с помощью ПЦР с ДНК-полимеразой Taq» . Исследования нуклеиновых кислот . 19 (21): 6052. DOI : 10,1093 / NAR / 19.21.6052 . PMC 329070 . PMID 1658751 .  
  42. ^ Newton CR, Graham A, Heptinstall LE, Powell SJ, Summers C, Kalsheker N и др. (Апрель 1989 г.). «Анализ любой точечной мутации в ДНК. Система устойчивых к амплификации мутаций (ARMS)» . Исследования нуклеиновых кислот . 17 (7): 2503–16. DOI : 10.1093 / NAR / 17.7.2503 . PMC 317639 . PMID 2785681 .  
  43. ^ Штеммер WP, Crameri A, Ha KD, Бреннан TM, Heyneker HL (октябрь 1995). «Одностадийная сборка гена и всей плазмиды из большого количества олигодезоксирибонуклеотидов». Джин . 164 (1): 49–53. DOI : 10.1016 / 0378-1119 (95) 00511-4 . PMID 7590320 . 
  44. ^ Иннис М.А., Myambo KB, Гельфанд DH, Brow MA (декабрь 1988). «Секвенирование ДНК с помощью ДНК-полимеразы Thermus aquaticus и прямое секвенирование ДНК, амплифицированной с помощью полимеразной цепной реакции» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 85 (24): 9436–40. Bibcode : 1988PNAS ... 85.9436I . DOI : 10.1073 / pnas.85.24.9436 . PMC 282767 . PMID 3200828 .  
  45. ^ Pierce KE, Wangh LJ (2007). Линейная после экспоненциальной полимеразной цепной реакции и родственные технологии Стратегии обнаружения в реальном времени для быстрой и надежной диагностики отдельных клеток . Методы молекулярной медицины. 132 . С. 65–85. DOI : 10.1007 / 978-1-59745-298-4_7 . ISBN 978-1-58829-578-1. PMID  17876077 .
  46. ^ Кришнан М , Угаз В.М., Бернс М.А. (октябрь 2002 г.). «ПЦР в конвекционной ячейке Рэлея-Бенара». Наука . 298 (5594): 793. DOI : 10.1126 / science.298.5594.793 . PMID 12399582 . 
  47. ^ Priye A, Hassan Ю.А., Угас VM (ноябрь 2013). «Хаотическая адвекция на микромасштабах обеспечивает надежную конвективную репликацию ДНК». Аналитическая химия . 85 (21): 10536–41. DOI : 10.1021 / ac402611s . PMID 24083802 . 
  48. ^ Schwartz JJ, Ли C, Shendure J (сентябрь 2012). «Точный синтез генов с направленным на метку извлечением молекул ДНК с подтвержденной последовательностью» . Природные методы . 9 (9): 913–5. DOI : 10.1038 / nmeth.2137 . PMC 3433648 . PMID 22886093 .  
  49. Перейти ↑ Vincent M, Xu Y, Kong H (август 2004 г.). «Геликазозависимая изотермическая амплификация ДНК» . EMBO Reports . 5 (8): 795–800. DOI : 10.1038 / sj.embor.7400200 . PMC 1249482 . PMID 15247927 .  
  50. Перейти ↑ Chou Q, Russell M, Birch DE, Raymond J, Bloch W (апрель 1992 г.). «Предотвращение неправильного прайминга перед ПЦР и димеризации праймеров улучшает амплификации с низким числом копий» . Исследования нуклеиновых кислот . 20 (7): 1717–23. DOI : 10.1093 / NAR / 20.7.1717 . PMC 312262 . PMID 1579465 .  
  51. ↑ Kellogg DE, Rybalkin I, Chen S, Mukhamedova N, Vlasik T, Siebert PD, Chenchik A (июнь 1994). «Антитело TaqStart:« горячий старт »ПЦР с нейтрализующим моноклональным антителом, направленным против ДНК-полимеразы Taq». Биотехнологии . 16 (6): 1134–7. PMID 8074881 . 
  52. ^ Сан - Миллан RM, Мартинез-Бальестерос I, Rementeria A, Garaizar J, Bikandi J (декабрь 2013 года). «Онлайн-упражнения по разработке и моделированию экспериментов ПЦР и ПЦР-ПДРФ» . BMC Research Notes . 6 : 513. DOI : 10,1186 / 1756-0500-6-513 . PMC 4029544 . PMID 24314313 .  
  53. ^ Zietkiewicz Е, Rafalski А, лабуду D (март 1994). «Фингерпринт генома путем амплификации полимеразной цепной реакции, закрепленной простым повторением последовательности (SSR)». Геномика . 20 (2): 176–83. DOI : 10.1006 / geno.1994.1151 . PMID 8020964 . 
  54. ^ Ochman Н, Гербер А.С., Hartl DL (ноябрь 1988). «Генетические приложения обратной полимеразной цепной реакции» . Генетика . 120 (3): 621–3. PMC 1203539 . PMID 2852134 .  
  55. ↑ Mueller PR, Wold B (ноябрь 1989 г.). «Поступление in vivo мышечного специфического усилителя с помощью лигирования опосредованной ПЦР». Наука . 246 (4931): 780–6. Bibcode : 1989Sci ... 246..780M . DOI : 10.1126 / science.2814500 . PMID 2814500 . 
  56. ^ Herman JG , Graff JR, Myöhänen S, Нелькин BD, Baylin SB (сентябрь 1996). «Метилирование-специфическая ПЦР: новый ПЦР-анализ статуса метилирования CpG-островков» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 93 (18): 9821–6. Bibcode : 1996PNAS ... 93.9821H . DOI : 10.1073 / pnas.93.18.9821 . PMC 38513 . PMID 8790415 .  
  57. ^ Isenbarger Т.А., Финни М, Риос-Веласкес С, Handelsman Дж, Ruvkun G (февраль 2008 г.). «Минипраймер ПЦР, новая линза для наблюдения за миром микробов» . Прикладная и экологическая микробиология . 74 (3): 840–9. DOI : 10,1128 / AEM.01933-07 . PMC 2227730 . PMID 18083877 .  
  58. Перейти ↑ Shen C, Yang W, Ji Q, Maki H, Dong A, Zhang Z (ноябрь 2009 г.). «Наблюдение NanoPCR: различные уровни верности репликации ДНК в полимеразных цепных реакциях, усиленных наночастицами». Нанотехнологии . 20 (45): 455103. Bibcode : 2009Nanot..20S5103S . DOI : 10.1088 / 0957-4484 / 20/45/455103 . PMID 19822925 . S2CID 3393115 .  
  59. ^ Шен, Ченчао (2013). «Обзор технологии полимеразной цепной реакции с помощью наночастиц». Обзор технологии полимеразной цепной реакции с использованием наночастиц . США: Wiley-Blackwell Publishing Ltd., стр. 97–106. DOI : 10.1002 / 9781118451915.ch5 . ISBN 9781118451915.
  60. Перейти ↑ Horton RM, Hunt HD, Ho SN, Pullen JK, Pease LR (апрель 1989 г.). «Разработка гибридных генов без использования рестрикционных ферментов: сплайсинг генов путем перекрывания». Джин . 77 (1): 61–8. DOI : 10.1016 / 0378-1119 (89) 90359-4 . PMID 2744488 . 
  61. ^ Моллер, Саймон (2006). PCR: основы . США: Taylor & Francis Group. п. 144. ISBN 9780415355476.
  62. ^ David F, Turlotte E (ноябрь 1998). «[Метод изотермической амплификации гена]» [Метод изотермической амплификации]. Comptes Rendus de l'Académie des Sciences. Серия III, Науки де ла Ви . 321 (11): 909–14. Bibcode : 1998CRASG.321..909D . DOI : 10.1016 / S0764-4469 (99) 80005-5 . PMID 9879470 . 
  63. ↑ Фабрис Дэвид (сентябрь – октябрь 2002 г.). "Utiliser les propriétés topologiques de l'ADN: une nouvelle arme contre les agent pathogènes" (PDF) . Слияние. Архивировано из оригинального (PDF) 28 ноября 2007 года. (На французском)
  64. ^ Dobosy JR, Rose SD, Beltz KR, Рапп SM, Пауэрс К.М., Behlke М.А., Walder JA (август 2011). «РНКаза H-зависимая ПЦР (rhPCR): улучшенная специфичность и обнаружение однонуклеотидного полиморфизма с использованием блокированных расщепляемых праймеров» . BMC Biotechnology . 11 : 80. DOI : 10,1186 / 1472-6750-11-80 . PMC 3224242 . PMID 21831278 .  
  65. ^ Шьямала, V .; Ферро-Луцци, Эймс Г. (1993). Односпецифическая полимеразная цепная реакция с праймером (SSP-PCR) и ход по геному . Методы молекулярной биологии. 15 . С. 339–48. DOI : 10.1385 / 0-89603-244-2: 339 . ISBN 978-0-89603-244-6. PMID  21400290 .
  66. ^ Bing DH, Болес С, Рехманом FN, Audeh М, Белмарш М, Келли В, Адамс СР (1996). «Мостиковая амплификация: система твердофазной ПЦР для амплификации и обнаружения аллельных различий в генах с одной копией» . Материалы конференции по генетической идентификации, Седьмой международный симпозиум по идентификации человека . Архивировано из оригинала 7 мая 2001 года.
  67. ^ Хан Z, Poetter K, Парк DJ (апрель 2008). «Усиленная твердофазная ПЦР: механизмы увеличения праймирования с помощью праймеров на твердой основе». Аналитическая биохимия . 375 (2): 391–3. DOI : 10.1016 / j.ab.2008.01.021 . PMID 18267099 . 
  68. ^ Raoult D, G Aboudharam, Crubézy Е, G Larrouy, Ludes В, Drancourt М (ноябрь 2000 года). «Молекулярная идентификация с помощью« самоубийственной ПЦР »Yersinia pestis как агента средневековой черной смерти» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 97 (23): 12800–3. Bibcode : 2000PNAS ... 9712800R . DOI : 10.1073 / pnas.220225197 . PMC 18844 . PMID 11058154 .  
  69. ^ Лю YG, Whittier РФ (февраль 1995). «Термическая асимметричная чересстрочная ПЦР: автоматическая амплификация и секвенирование концевых фрагментов вставки из клонов P1 и YAC для ходьбы по хромосомам». Геномика . 25 (3): 674–81. DOI : 10.1016 / 0888-7543 (95) 80010-J . PMID 7759102 . 
  70. ^ Дон RH, Cox PT, Wainwright BJ, Baker K, Mattick JS (июль 1991). « ПЦР « Touchdown »для предотвращения ложного праймирования во время амплификации гена» . Исследования нуклеиновых кислот . 19 (14): 4008. DOI : 10,1093 / NAR / 19.14.4008 . PMC 328507 . PMID 1861999 .  
  71. ^ Myrick К.В., Gelbart WM (февраль 2002). «Универсальная быстрая ходьба для прямого и универсального определения последовательности обхода». Джин . 284 (1–2): 125–31. DOI : 10.1016 / S0378-1119 (02) 00384-0 . PMID 11891053 . 
  72. ^ «Полный текст - LaNe RAGE: новый инструмент для определения фланкирующей последовательности геномной ДНК» .
  73. ↑ Park DJ (январь 2005 г.). «Новый 5'-концевой экзон GAPDH мыши, идентифицированный с помощью 5'RACE LaNe». Молекулярная биотехнология . 29 (1): 39–46. DOI : 10.1385 / MB: 29: 1: 39 . PMID 15668518 . S2CID 45702164 .  
  74. ↑ Park DJ (апрель 2004 г.). «3 'RACE LaNe: простой и быстрый метод полностью вложенной ПЦР для определения 3'-концевой последовательности кДНК» . Биотехнологии . 36 (4): 586-8, 590. DOI : 10,2144 / 04364BM04 . PMID 15088375 . 
  75. ^ «Ключевой ингредиент в тестах на коронавирус поступает из озер Йеллоустоун» . Наука . 31 марта 2020 . Дата обращения 13 мая 2020 .
  76. ^ Kleppe K, Оцука E, Kleppe R, Molineux I, Khorana HG (март 1971). «Исследования полинуклеотидов. XCVI. Ремонт репликаций коротких синтетических ДНК, катализируемых ДНК-полимеразами». Журнал молекулярной биологии . 56 (2): 341–61. DOI : 10.1016 / 0022-2836 (71) 90469-4 . PMID 4927950 . 
  77. ^ Рабинов, Пол (1996). Изготовление ПЦР: история биотехнологии . Чикаго: Издательство Чикагского университета. ISBN 978-0-226-70146-2.
  78. ^ Маллис, Карого (1998). Танцы обнаженными в поле разума . Нью-Йорк: Книги Пантеона. ISBN 978-0-679-44255-4.
  79. ^ Маллис KB (апрель 1990). «Необычное происхождение полимеразной цепной реакции». Scientific American . 262 (4): 56–61, 64–5. Bibcode : 1990SciAm.262d..56M . DOI : 10.1038 / Scientificamerican0490-56 . PMID 2315679 . 
  80. ^ Patidar М, Агроэл S, Парвин Р, Р Кхаре (2015). «Молекулярное понимание слюны в решении спора об отцовстве» . Журнал судебной стоматологии . 7 (1): 76–9. DOI : 10.4103 / 0975-1475.150325 . PMC 4330625 . PMID 25709326 .  
  81. ^ "Кэри Б. Муллис - Нобелевская лекция: Полимеразная цепная реакция" .
  82. ^ "Цитаты для лауреатов премии за химический прорыв 2017" . Отдел истории химии . Проверено 12 марта 2018 .
  83. ^ «Советы о том, как выжить в тактических войнах» . GEN Genetic Engineering News - канал биобизнеса . 26 (9). 1 мая 2006 г.

Внешние ссылки [ править ]

Библиотечные ресурсы по
полимеразной цепной реакции
  • Ресурсы в вашей библиотеке
  • Ресурсы в других библиотеках
  • ПЦР Анимация maxanim.com
  • Полная форма ПЦР
  • OpenPCR с открытым исходным кодом проекта thermalcycler ПЦР
  • Патент США на ПЦР
  • OpenWetWare
  • Что такое эффект плато ПЦР? Обучающее видео на YouTube
  • Инструмент для создания праймеров GeneWarrior Online PCR Primer
  • История полимеразной цепной реакции из архивов Смитсоновского института
  • Компьютерное упражнение. Дизайн экспериментов ПЦР и ПЦР-ПДРФ