Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
"CDNA" перенаправляется сюда. Для использования в других целях, см CDNA (значения) .
Для общего свойства комплементарности в молекулярной биологии см. Комплементарность (молекулярная биология) . Для тестов комплементации, используемых в генетических исследованиях, см. Дополнение (генетика) .

Выход из микрочипа кДНК, используемого в тестировании

В генетике , комплементарной ДНК ( кДНК ) является ДНК , синтезированный из одноцепочечной РНК (например, матричной РНК ( мРНК ) или микроРНК (миРНК)) матрицы в реакции , катализируемой ферментом обратной транскриптазы . кДНК часто используется для клонирования эукариотических генов в прокариот . Когда ученые хотят экспрессировать определенный белок в клетке, которая обычно не экспрессирует этот белок (т. Е. Гетерологичнаяэкспрессия), они будут передавать кДНК, кодирующую белок, в клетку-реципиент. В молекулярной биологии кДНК также генерируется для анализа транскриптомных профилей в тканях, отдельных клетках или отдельных ядрах в таких анализах, как микроматрицы и RNA-seq .

кДНК также производится естественным образом ретровирусами (такими как ВИЧ-1 , ВИЧ-2 , вирус обезьяньего иммунодефицита и т. д.), а затем интегрируется в геном хозяина, где создает провирус . [1]

Термин кДНК также используется, обычно в контексте биоинформатики , для обозначения последовательности транскрипта мРНК, выраженной в виде оснований ДНК (дезокси-GCAT), а не оснований РНК (GCAU).

Синтез [ править ]

РНК служит матрицей для синтеза кДНК. [2] В клеточной жизни кДНК генерируется вирусами и ретротранспозонами для интеграции РНК в геномную ДНК- мишень . В молекулярной биологии РНК очищается из исходного материала после удаления геномной ДНК, белков и других клеточных компонентов. Затем кДНК синтезируется посредством обратной транскрипции in vitro . [3]

Очистка РНК [ править ]

РНК транскрибируется из геномной ДНК в клетках-хозяевах и экстрагируется путем сначала лизирования клеток, затем очистки РНК с использованием широко используемых методов, таких как фенол-хлороформ, колонка с диоксидом кремния и методы экстракции РНК на основе гранул. [4] Методы извлечения различаются в зависимости от исходного материала. Например, для извлечения РНК из растительной ткани требуются дополнительные реагенты, такие как поливинилпирролидон (ПВП), для удаления фенольных соединений, углеводов и других соединений, которые в противном случае сделают РНК непригодной для использования. [5] Чтобы удалить ДНК и белки, используются ферменты, такие как ДНКаза и протеиназа К, для деградации. [6]Важно отметить, что целостность РНК поддерживается путем инактивации РНКаз с помощью хаотропных агентов, таких как изотиоцианат гуанидиния, додецилсульфат натрия (SDS), фенол или хлороформ. Затем общая РНК отделяется от других клеточных компонентов и осаждается спиртом. Существуют различные коммерческие наборы для простого и быстрого выделения РНК для конкретных приложений. [7] Дополнительные методы на основе гранул могут использоваться для выделения определенных подтипов РНК (например, мРНК и микроРНК ) на основе размера или уникальных участков РНК. [8] [9]

Обратная транскрипция [ править ]

Синтез первой цепи [ править ]

С помощью фермента обратной транскриптазы и очищенных матриц РНК получают одну цепь кДНК (синтез первой цепи кДНК). Обратная транскриптаза M-MLV из вируса лейкемии мышей Молони обычно используется из-за ее пониженной активности РНКазы H, подходящей для транскрипции более длинных РНК. [10] Обратная транскриптаза AMV из вируса миелобластоза птиц также может быть использована для матриц РНК с сильными вторичными структурами (т.е. с высокой температурой плавления). [11] кДНК обычно получают из мРНК для анализа экспрессии генов, такого как RT-qPCR и RNA-seq . [12] мРНК избирательно подвергается обратной транскрипции с использованием олиго-d Tпраймеры, которые представляют собой обратный комплемент полиаденилированного хвоста на 3'-конце всей мРНК. Оптимизированная смесь праймеров oligo-dT и случайных гексамеров увеличивает шанс получения полноразмерной кДНК при одновременном снижении смещения 5 'или 3'. [13] Рибосомная РНК также может быть истощена для обогащения как мРНК, так и неполиаденилированных транскриптов, таких как некодирующая РНК . [14]

Синтез второй цепи [ править ]

Результат синтезов первой цепи, гибриды РНК-ДНК, можно обрабатывать с помощью нескольких методов синтеза второй цепи или обрабатывать непосредственно в последующих анализах. [15] [16] Ранний метод, известный как синтез с шпилькой, основывался на образовании шпильки на 3'-конце кДНК первой цепи для примирования синтеза второй цепи. Однако затравка носит случайный характер, и шпильочный гидролиз приводит к потере информации. В процедуре Габлера и Хоффмана используется РНКаза H E. Coli для разрыва мРНК, которая заменена ДНК-полимеразой I E. Coli и запечатана ДНК-лигазой E. Coli. Оптимизация этой процедуры основана на низкой активности РНКазы H в M-MLV для разрыва мРНК с последующим удалением оставшейся РНК путем добавления РНКазы H после трансляции ДНК-полимеразы кДНК второй цепи. Это предотвращает потерю информации о последовательности на 5'-конце мРНК.

Приложения [ править ]

Комплементарная ДНК часто используется при клонировании генов или как генные зонды или при создании библиотеки кДНК . Когда ученые переносят ген из одной клетки в другую, чтобы выразить новый генетический материал в виде белка в клетке-реципиенте, кДНК будет добавлена ​​к реципиенту (а не ко всему гену), потому что ДНК для всего гена может включать ДНК, которая не кодирует белок или прерывает кодирующую последовательность белка (например, интроны ). Частичные последовательности кДНК часто получают в виде меток экспрессируемой последовательности .

Поскольку амплификация последовательностей ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) стала обычным явлением, обычно на начальном этапе проводят обратную транскрипцию, за которой следует ПЦР для получения точной последовательности кДНК для внутриклеточной экспрессии. Это достигается путем конструирования специфичных для последовательности праймеров ДНК, которые гибридизуются с 5'- и 3'-концами области кДНК, кодирующей белок. После амплификации последовательность может быть разрезана с каждого конца нуклеазами и вставлена ​​в одну из множества небольших кольцевых последовательностей ДНК, известных как векторы экспрессии. Такие векторы обеспечивают саморепликацию внутри клеток и, возможно, интеграцию в ДНК хозяина. Обычно они также содержат сильный промотор для управления транскрипцией целевой кДНК в мРНК, которая затем транслируется в белок.

13 июня 2013 года Верховный суд США постановил в деле Association for Molecular Pathology v. Myriad Genetics, что, хотя природные гены человека не могут быть запатентованы , кДНК имеет право на получение патента, поскольку не встречается в природе. [17]

кДНК также используется для изучения экспрессии генов с помощью таких методов, как RNA-seq или RT-qPCR . [18] [19] [20] Для секвенирования РНК должна быть фрагментирована из-за ограничений размера платформы секвенирования. Кроме того, синтезированная кДНК второй цепи должна быть лигирована с адаптерами, которые позволяют фрагментам кДНК амплифицироваться с помощью ПЦР и связываться с секвенирующими проточными клетками. В методах анализа генов обычно используются микроматрицы и RT-qPCR для количественной оценки уровней кДНК с помощью флуорометрических и других методов.

Вирусы и ретротранспозоны [ править ]

Некоторые вирусы также используют кДНК для превращения своей вирусной РНК в мРНК (вирусная РНК → кДНК → мРНК). МРНК используется для того, чтобы вирусные белки захватили хозяйскую клетку.

Пример этого первого шага от вирусной ДНК к кДНК можно увидеть в цикле ВИЧ-инфекции. Здесь мембрана клетки-хозяина прикрепляется к липидной оболочке вируса, что позволяет вирусному капсиду с двумя копиями РНК вирусного генома проникать в хозяина. Копия кДНК затем создается посредством обратной транскрипции вирусной РНК, процессу, облегчаемому шапероном CypA и связанной с вирусным капсидом обратной транскриптазы. [21]

кДНК также генерируется ретротранспозонами в геномах эукариот. Ретротранспозоны - это мобильные генетические элементы, которые перемещаются внутри генома, а иногда и между геномами через промежуточные соединения РНК. Этот механизм характерен для вирусов за исключением образования инфекционных частиц. [22] [23]

См. Также [ править ]

  • библиотека кДНК
  • кДНК микрочип
  • РНК-Seq
  • ОТ-КПЦР

Ссылки [ править ]

  1. ^ Крой, Рон. «Молекулярная генетика II - Курс генной инженерии (дополнительные примечания)» . Даремский университет durham.ac.uk; 20 апреля 1998 . Архивировано из оригинального 24 августа 2002 года . Проверено 4 февраля 2015 года .
  2. ↑ Инь, Шао-Яо (1 июля 2004 г.). «Дополнительные библиотеки ДНК». Молекулярная биотехнология . 27 (3): 245–252. DOI : 10.1385 / MB: 27: 3: 245 . ISSN 1559-0305 . PMID 15247497 . S2CID 25600775 .   
  3. ^ «5 шагов к оптимальному синтезу кДНК - США» . www.thermofisher.com . Дата обращения 12 мая 2020 .
  4. ^ Таварес, Луселия; Alves, Paula M .; Ferreira, Ricardo B .; Сантос, Клаудия Н. (6 января 2011 г.). «Сравнение различных методов выделения РНК без ДНК из нейробластомы SK-N-MC» . BMC Research Notes . 4 (1): 3. DOI : 10,1186 / 1756-0500-4-3 . ISSN 1756-0500 . PMC 3050700 . PMID 21211020 .   
  5. ^ R, Кансал; К. Кухар; Я, Верма; Р-н, Гупта; ВК, Гупта; Кр, Кундал (декабрь 2008 г.). «Улучшенный и удобный метод выделения РНК из полифенолов и богатых полисахаридами растительных тканей». Индийский журнал экспериментальной биологии . 46 (12): 842–5. PMID 19245182 . 
  6. ^ Я, Вомелова; Z, Vanícková; А, Седо (2009). "Методы очистки РНК. Все пути (должны) вести в Рим". Folia Biologica . 55 (6): 243–51. PMID 20163774 . 
  7. ^ Селлин Джеффрис, Марло К .; Поцелуй, Андор Дж .; Смит, Остин В .; Орис, Джеймс Т. (14 ноября 2014 г.). «Сравнение имеющихся в продаже автоматических и ручных наборов для выделения общей РНК из небольших образцов тканей» . BMC Biotechnology . 14 (1): 94. DOI : 10,1186 / s12896-014-0094-8 . ISSN 1472-6750 . PMC 4239376 . PMID 25394494 .   
  8. ^ «Выделение мРНК с помощью Dynabeads за 15 минут - США» . www.thermofisher.com . Дата обращения 20 мая 2020 .
  9. ^ Гаарц, Андреа; Дебей-Пашер, Свенья; Классен, Сабина; Эггл, Даниэла; Гатхоф, Биргит; Чен, Цзин; Фань, Цзянь-Бин; Восс, Торстен; Schultze, Joachim L .; Старачек-Йокс, Андреа (май 2010 г.). «Профилирование экспрессии микроРНК в периферической крови на основе бусин и влияние различных подходов к выделению РНК» . Журнал молекулярной диагностики: JMD . 12 (3): 335–344. DOI : 10,2353 / jmoldx.2010.090116 . ISSN 1525-1578 . PMC 2860470 . PMID 20228267 .   
  10. ^ Хаддад, Фадия; Болдуин, Кеннет М. (2010), Кинг, Никола (редактор), «Обратная транскрипция рибонуклеиновой кислоты: первый шаг в анализе ОТ-ПЦР», Протоколы ОТ-ПЦР: Второе издание , Методы в молекулярной биологии, Humana Press , 630 , стр. 261–270, DOI : 10.1007 / 978-1-60761-629-0_17 , ISBN 978-1-60761-629-0, PMID  20301003
  11. ^ Мартин, Карен. «Обратная транскриптаза и обзор кДНК и приложения» . Золотая биотехнология . Дата обращения 20 мая 2020 .
  12. ^ "КПЦР, микроматрицы или секвенирование РНК - что выбрать?" . БиоСистемика . 10 августа 2017 . Дата обращения 20 мая 2020 .
  13. ^ «Синтез кДНК | Bio-Rad» . www.bio-rad.com . Проверено 28 мая 2020 .
  14. ^ Герберт, Захари Т .; Кершнер, Джейми П .; Бутти, Винсент Л .; Тиммапурам, Джьоти; Чоудхари, Сульбха; Алексеев, Юрий О .; Fan, Jun; Поднар, Джессика В .; Уилкокс, Эдвард; Гипсон, Дженни; Гилласпи, Эллисон (15 марта 2018 г.). «Межсайтовое сравнение наборов для истощения рибосом для создания библиотеки Illumina RNAseq» . BMC Genomics . 19 (1): 199. DOI : 10,1186 / s12864-018-4585-1 . ISSN 1471-2164 . PMC 6389247 . PMID 29703133 .   
  15. ^ Invitrogen. «Система синтеза кДНК» (PDF) . Thermofisher . Дата обращения 27 мая 2020 .
  16. ↑ Агарвал, Саураб; Macfarlan, Todd S .; Sartor, Maureen A .; Ивасе, Шигеки (21 января 2015 г.). «Секвенирование библиотеки кДНК первой цепи выявляет транскриптомы полной длины» . Nature Communications . 6 (1): 6002. Bibcode : 2015NatCo ... 6.6002A . DOI : 10.1038 / ncomms7002 . ISSN 2041-1723 . PMC 5054741 . PMID 25607527 .   
  17. ^ Liptak, Адам (13 июня 2013). «Верховный суд постановил, что гены человека не могут быть запатентованы» . Нью-Йорк Таймс . Проверено 14 июня 2013 года .
  18. ^ Деризи, J .; Penland, L .; Браун, ПО; Биттнер, ML; Мельцер, ПС; Ray, M .; Chen, Y .; Вс, Ю.А.; Трент, Дж. М. (декабрь 1996 г.). «Использование микроматрицы кДНК для анализа паттернов экспрессии генов при раке человека» . Генетика природы . 14 (4): 457–460. DOI : 10.1038 / ng1296-457 . ISSN 1546-1718 . PMID 8944026 . S2CID 23091561 .   
  19. ^ Белый, Адам К .; ВанИнсберге, Майкл; Петров, Олег И .; Хамиди, Мани; Сикорский, Дарек; Марра, Марко А .; Пирет, Джеймс; Апарисио, Самуэль; Хансен, Карл Л. (23 августа 2011 г.). «Высокопроизводительная микрофлюидная одноклеточная RT-qPCR» . Труды Национальной академии наук . 108 (34): 13999–14004. Bibcode : 2011PNAS..10813999W . DOI : 10.1073 / pnas.1019446108 . ISSN 0027-8424 . PMC 3161570 . PMID 21808033 .   
  20. ^ Хрдликова, Радмила; Толуэ, Масуд; Тиан, Бин (январь 2017 г.). «Методы RNA-Seq для анализа транскриптомов» . Междисциплинарные обзоры Wiley. РНК . 8 (1): e1364. DOI : 10.1002 / wrna.1364 . ISSN 1757-7004 . PMC 5717752 . PMID 27198714 .   
  21. ^ Альтфельд, Маркус; Младший, Майкл Гейл (1 июня 2015 г.). «Врожденный иммунитет против ВИЧ-1 инфекции» . Иммунология природы . 16 (6): 554–562. DOI : 10.1038 / ni.3157 . ISSN 1529-2908 . PMID 25988887 . S2CID 1577651 .   
  22. ^ Хавекер, Эрика Р .; Гао, Сян; Войтас, Даниэль Ф. (18 мая 2004 г.). «Разнообразие ретротранспозонов LTR» . Геномная биология . 5 (6): 225. DOI : 10,1186 / GB-2004-5-6-225 . ISSN 1474-760X . PMC 463057 . PMID 15186483 .   
  23. ^ Кордо, Ричард; Батцер, Марк А. (октябрь 2009 г.). «Влияние ретротранспозонов на эволюцию генома человека» . Природа Обзоры Генетики . 10 (10): 691–703. DOI : 10.1038 / nrg2640 . ISSN 1471-0064 . PMC 2884099 . PMID 19763152 .   

Внешние ссылки [ править ]

  • База данных H-Invitational
  • Функциональная аннотация базы данных мыши
  • Дополнительный инструмент ДНК