Олигонуклеотид

Олигонуклеотиды - это короткие молекулы ДНК или РНК , олигомеры , которые имеют широкий спектр применения в генетическом тестировании , исследованиях и судебной медицине . Обычно сделано в лаборатории путем твердофазного химического синтеза , ^[1] эти небольшие фрагменты нуклеиновых кислот могут быть изготовлены в виде одноцепочечных молекул с любой заданной пользователем последовательности, и так жизненно важны для искусственного синтеза гена , полимеразной цепной реакции (ПЦР ), Секвенирование ДНК , молекулярное клонирование и в качестве молекулярных зондов. В природе олигонуклеотиды обычно находятся в виде небольших молекул РНК, которые функционируют в регуляции экспрессии генов (например, микроРНК ), или представляют собой промежуточные продукты разложения, полученные в результате разрушения более крупных молекул нуклеиновых кислот.

Олигонуклеотиды характеризуются последовательностью из нуклеотидных остатков , которые составляют всю молекулу. Длина олигонуклеотида обычно обозначается как « -мер » (от греческого meros , «часть»). Например, олигонуклеотид из шести нуклеотидов (нуклеотидов) является гексамером, а один из 25 нуклеотидов обычно называют «25-мерным». Олигонуклеотиды легко связываются специфическим для последовательности образом со своими соответствующими комплементарными олигонуклеотидами, ДНК или РНК с образованием дуплексов или, реже, гибридов более высокого порядка. Это основное свойство служит основой для использования олигонуклеотидов в качестве зондов.для обнаружения специфических последовательностей ДНК или РНК. Примеры процедур, в которых используются олигонуклеотиды, включают микроматрицы ДНК , саузерн-блоттинг , анализ ASO , флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH), ПЦР и синтез искусственных генов.

Олигонуклеотиды состоят из 2'-дезоксирибонуклеотидов (олигодезоксирибонуклеотидов), которые можно модифицировать в основной цепи или в положении 2 'сахара для достижения различных фармакологических эффектов. Эти модификации придают олигонуклеотидам новые свойства и делают их ключевым элементом антисмысловой терапии . ^[2]^[3]

Синтез [ править ]

Олигонуклеотиды химически синтезируются с использованием строительных блоков, защищенных фосфорамидитов природных или химически модифицированных нуклеозидов или, в меньшей степени, ненуклеозидных соединений. Сборка олигонуклеотидной цепи происходит в направлении от 3 'до 5', следуя стандартной процедуре, называемой «синтетическим циклом». Завершение единственного цикла синтеза приводит к добавлению одного нуклеотидного остатка к растущей цепи. Выход менее 100% на каждой стадии синтеза и наличие побочных реакций устанавливают практические пределы эффективности процесса. Как правило, олигонуклеотидные последовательности обычно короткие (13-25 нуклеотидов). ^[4] Максимальная длина синтетических олигонуклеотидов едва превышает 200 нуклеотидных остатков.Для выделения продуктов с желаемой последовательностью можно использовать ВЭЖХ и другие методы.

Химические модификации [ править ]

Создание химически стабильных коротких олигонуклеотидов было самой ранней проблемой при разработке методов лечения ASO. Встречающиеся в природе олигонуклеотиды легко разрушаются нуклеазами, ферментом, который расщепляет нуклеотиды и присутствует в клетках любого типа. ^[5] Короткие олигонуклеотидные последовательности также обладают слабой внутренней аффинностью связывания, что способствует их деградации in vivo. ^[6]

Модификации магистрали [ править ]

Нуклеозидные тиофосфатные (PS) аналоги нуклеотидов придают олигонуклеотидам некоторые полезные свойства. Ключевые полезные свойства, которые скелеты PS придают нуклеотидам, - это диастереомерная идентификация каждого нуклеотида и способность легко отслеживать реакции с участием фосфоротиоатных нуклеотидов, что полезно в синтезе олигонуклеотидов. ^[7] Модификации основной цепи PS олигонуклеотидов защищают их от нежелательной деградации ферментами. ^[8] Модификация нуклеотидного остова широко используется, потому что это может быть достигнуто с относительной легкостью и точностью для большинства нуклеотидов. ^[7]

Модификации сахарного кольца [ править ]

Другая модификация, которая полезна для медицинских применений олигонуклеотидов, - это 2'-модификации сахара . Модификация сахара в положении 2 'увеличивает эффективность олигонуклеотидов за счет усиления способности олигонуклеотидов к целевому связыванию, особенно в терапии антисмысловыми олигонуклеотидами . ^[6] Они также уменьшают неспецифическое связывание белков, повышая точность нацеливания на определенные белки. ^[6] Двумя наиболее часто используемыми модификациями являются 2'-O-метил и 2'-O-метоксиэтил. ^[6]

Антисмысловые олигонуклеотиды [ править ]

Антисмысловые олигонуклеотиды представляют собой одиночные цепи ДНК или РНК, комплементарные выбранной последовательности. ^[4] В случае антисмысловой РНК они предотвращают трансляцию белков определенных цепей информационной РНК , связываясь с ними в процессе, называемом гибридизацией . ^[9] Антисмысловые олигонуклеотиды можно использовать для нацеливания на конкретную комплементарную (кодирующую или некодирующую ) РНК. Если связывание происходит этот гибрид может разлагаться под действием фермента РНКазы Н . ^[9] РНКаза H представляет собой фермент, который гидролизует РНК, и при использовании в антисмысловых олигонуклеотидах приводит к снижению экспрессии мРНК на 80-95%. ^[4]

Использование морфолино антисмысловых олигонуклеотидов для гена нокдаун в позвоночных , который в настоящее время является стандартным методом в биологии развития и используется для изучения измененную экспрессии генов и генов функции, была впервые разработана Джанет Heasman использованием Xenopus . ^[10] FDA утвержденных препаратов морфолино включают eteplirsen и golodirsen . Антисмысловые олигонуклеотиды также использовались для ингибирования репликации вируса гриппа в клеточных линиях. ^[11]^[12]

Нейродегенеративные заболевания, возникающие в результате действия одного мутантного белка, являются хорошими мишенями для лечения антисмысловыми олигонуклеотидами из-за их способности воздействовать на очень специфические последовательности РНК и изменять их с высокой селективностью. Многие генетические заболевания , включая болезнь Хантингтона , болезнь Альцгеймера , болезнь Паркинсона и боковой амиотрофический склероз (БАС), были связаны с изменениями ДНК , которые в результате неправильных последовательностей РНК и в результате неправильно переводил белков , которые оказывают токсическое физиологический эффект. ^[13]

Аналитические методы [ править ]

Хроматография [ править ]

Алкиламиды можно использовать в качестве стационарных хроматографических фаз. ^[14] Эти фазы были исследованы на предмет разделения олигонуклеотидов. ^[15]

Масс-спектрометрия [ править ]

Смесь 5-метоксисалициловой кислоты и спермина можно использовать в качестве матрицы для анализа олигонуклеотидов в масс-спектрометрии MALDI . ^[16]

ДНК-микрочип [ править ]

ДНК-микрочипы - полезное аналитическое применение олигонуклеотидов. По сравнению со стандартными микрочипами кДНК микроматрицы на основе олигонуклеотидов обладают большей контролируемой специфичностью по сравнению с гибридизацией и способностью измерять присутствие и распространенность альтернативно сплайсированных или полиаденилированных последовательностей. ^[17] Один подтип ДНК-микрочипов можно описать как субстраты (нейлон, стекло и т. Д.), С которыми олигонуклеотиды были связаны с высокой плотностью. ^[18] В науках о жизни существует ряд применений микрочипов ДНК .

См. Также [ править ]

Аптамеры , олигонуклеотиды с важными биологическими приложениями
Морфолино , олигонуклеотиды с неприродным остовом, которые не активируют РНКазу-H, но могут снижать экспрессию генов или изменять сплайсинг РНК.
Полиморфизм , появление в популяции одного и того же гена в нескольких формах из-за мутаций; часто можно тестировать с помощью зондов ASO
CpG Олигодезоксинуклеотид , ODN с иммуностимулирующими свойствами
Полипуриновые шпильки с обратной связью Хугстина , PPRH, олигонуклеотиды, которые могут связывать ДНК или РНК и снижать экспрессию генов.

Ссылки [ править ]

^ Ян Дж., Столи Дж. А., Цзян Х., Сяо Л., Кисман В. Ф., Антиа Ф. Д. и др. (Октябрь 2018 г.). «Твердофазный синтез фосфоротиоатных олигонуклеотидов с использованием побочных продуктов серы для укупорки in situ». Журнал органической химии . 83 (19): 11577–11585. DOI : 10.1021 / acs.joc.8b01553 . PMID 30179468 .
^ Вайс, Б., изд. (1997). Антисмысловые олигодезоксинуклеотиды и антисмысловые РНК: новые фармакологические и терапевтические агенты. Бока-Ратон, Флорида: CRC Press
Перейти ↑ Weiss B, Davidkova G, Zhou LW (1999). «Генная терапия антисмысловой РНК для изучения и модуляции биологических процессов». Клеточные и молекулярные науки о жизни . 55 (3): 334–58. DOI : 10.1007 / s000180050296 . PMID 10228554 .
^ a b c Dias N, Stein CA (март 2002 г.). «Антисмысловые олигонуклеотиды: основные понятия и механизмы» . Молекулярная терапия рака . 1 (5): 347–55. PMID 12489851 .
↑ Frazier KS (январь 2015 г.). «Антисмысловые олигонуклеотидные терапии: перспективы и проблемы с точки зрения токсикологического патолога». Токсикологическая патология . 43 (1): 78–89. DOI : 10.1177 / 0192623314551840 . PMID 25385330 .
^ а б в г DeVos SL, Miller TM (июль 2013 г.). «Антисмысловые олигонуклеотиды: лечение нейродегенерации на уровне РНК» . Нейротерапия . 10 (3): 486–97. DOI : 10.1007 / s13311-013-0194-5 . PMC 3701770 . PMID 23686823 .
^ a b Eckstein F (апрель 2000 г.). «Фосфоротиоатные олигодезоксинуклеотиды: каково их происхождение и в чем их уникальность?». Разработка антисмысловых и нуклеиновых кислот . 10 (2): 117–21. DOI : 10.1089 / oli.1.2000.10.117 . PMID 10805163 .
^ Stein CA, Субасингх C, Shinozuka K, Cohen JS (апрель 1988). «Физико-химические свойства фосфоротиоатных олигодезоксинуклеотидов» . Исследования нуклеиновых кислот . 16 (8): 3209–21. DOI : 10.1093 / NAR / 16.8.3209 . PMC 336489 . PMID 2836790 .
^ a b Crooke ST (апрель 2017 г.). «Молекулярные механизмы антисмысловых олигонуклеотидов» . Нуклеиновые кислоты . 27 (2): 70–77. DOI : 10.1089 / nat.2016.0656 . PMC 5372764 . PMID 28080221 .
^ Heasman Дж, Kofron М, Уайли С (июнь 2000 г.). «Активность передачи сигналов бета-катенина в раннем эмбрионе Xenopus: новый антисмысловой подход». Биология развития . 222 (1): 124–34. DOI : 10.1006 / dbio.2000.9720 . PMID 10885751 .
^ Кумар Р, Кумар В, раджпутская R, Саксен л, Banerjea переменный ток, Кханы М (ноябрь 2013 г. ). «Перекрестный защитный эффект антисмыслового олигонуклеотида, разработанный против обычного 3 'NCR генома вируса гриппа A». Молекулярная биотехнология . 55 (3): 203–11. DOI : 10.1007 / s12033-013-9670-8 . PMID 23729285 .
^ Кумар В, Кханна М, Кумар Р, Sood В, Виас R, Banerjea переменного тока (май 2012). «Опосредованное нуклеиновой кислотой расщепление гена M1 вируса гриппа A значительно усиливается антисмысловыми молекулами, нацеленными на гибридизацию вблизи сайта расщепления». Молекулярная биотехнология . 51 (1): 27–36. DOI : 10.1007 / s12033-011-9437-Z . PMID 21744034 .
^ Смит Р.А., Миллер TM, Яманака К., Мония Б.П., Кондон Т.П., Хунг Г. (Август 2006 г.). «Антисмысловая олигонуклеотидная терапия нейродегенеративного заболевания» . Журнал клинических исследований . 116 (8): 2290–6. DOI : 10.1172 / JCI25424 . PMC 1518790 . PMID 16878173 .
^ Buszewski B, Кастури P, Гилпин РК, Gangoda ME, Jaroniec M (август 1994). «Хроматографические и родственные исследования алкиламидных фаз». Хроматография . 39 (3–4): 155–61. DOI : 10.1007 / BF02274494 .
^ Buszewski В, Safaei Z, Studzińska S (январь 2015). «Анализ олигонуклеотидов методом жидкостной хроматографии с неподвижной фазой алкиламида» . Открытая химия . 13 (1). DOI : 10,1515 / Хим-2015-0141 .
^ Distler AM, Allison J (апрель 2001). «5-Метоксисалициловая кислота и спермин: новая матрица для матричного масс-спектрометрического анализа олигонуклеотидов с лазерной десорбцией / ионизацией». Журнал Американского общества масс-спектрометрии . 12 (4): 456–62. DOI : 10.1016 / S1044-0305 (01) 00212-4 . PMID 11322192 .
^ Relógio А, Швагер С, Рихтер А, Ansorge Вт, Валькарсель J (июнь 2002 г.). «Оптимизация микрочипов ДНК на основе олигонуклеотидов» . Исследования нуклеиновых кислот . 30 (11): e51. DOI : 10.1093 / NAR / 30.11.e51 . PMC 117213 . PMID 12034852 .
^ Gong P, Харберс GM, Грейнджер DW (апрель 2006). «Сравнение нескольких методов поверхностной плотности иммобилизованных и гибридизированных олигонуклеотидов на предметных стеклах коммерческих амино-реактивных микрочипов». Аналитическая химия . 78 (7): 2342–51. DOI : 10.1021 / ac051812m . PMID 16579618 .

Дальнейшее чтение [ править ]

Спинглер Б (январь 2012 г.). «Глава 3. Конформационные изменения олигонуклеотидов, стимулированные ионами металлов». В Sigel A, Sigel H, Sigel RK (ред.). Взаимодействие между ионами металлов и нуклеиновыми кислотами . 10 . Springer Science & Business Media. С. 103–118. DOI : 10.1007 / 978-94-007-2172-2_3 .

Внешние ссылки [ править ]

Атлас РНКи : база данных библиотек РНКи и результатов их целевого анализа
Physorg.com | Генетический источник мышечной дистрофии нейтрализован

[1] Ян Дж., Столи Дж. А., Цзян Х., Сяо Л., Кисман В. Ф., Антиа Ф. Д. и др. (Октябрь 2018 г.). «Твердофазный синтез фосфоротиоатных олигонуклеотидов с использованием побочных продуктов серы для укупорки in situ». Журнал органической химии . 83 (19): 11577–11585. DOI : 10.1021 / acs.joc.8b01553 . PMID 30179468 .

[2] Вайс, Б., изд. (1997). Антисмысловые олигодезоксинуклеотиды и антисмысловые РНК: новые фармакологические и терапевтические агенты. Бока-Ратон, Флорида: CRC Press

[3] Перейти ↑ Weiss B, Davidkova G, Zhou LW (1999). «Генная терапия антисмысловой РНК для изучения и модуляции биологических процессов». Клеточные и молекулярные науки о жизни . 55 (3): 334–58. DOI : 10.1007 / s000180050296 . PMID 10228554 .

[:0-4] Dias N, Stein CA (март 2002 г.). «Антисмысловые олигонуклеотиды: основные понятия и механизмы» . Молекулярная терапия рака . 1 (5): 347–55. PMID 12489851 .

[5] Frazier KS (январь 2015 г.). «Антисмысловые олигонуклеотидные терапии: перспективы и проблемы с точки зрения токсикологического патолога». Токсикологическая патология . 43 (1): 78–89. DOI : 10.1177 / 0192623314551840 . PMID 25385330 .

[:1-6] а б в г DeVos SL, Miller TM (июль 2013 г.). «Антисмысловые олигонуклеотиды: лечение нейродегенерации на уровне РНК» . Нейротерапия . 10 (3): 486–97. DOI : 10.1007 / s13311-013-0194-5 . PMC 3701770 . PMID 23686823 .

[:2-7] Eckstein F (апрель 2000 г.). «Фосфоротиоатные олигодезоксинуклеотиды: каково их происхождение и в чем их уникальность?». Разработка антисмысловых и нуклеиновых кислот . 10 (2): 117–21. DOI : 10.1089 / oli.1.2000.10.117 . PMID 10805163 .

[8] Stein CA, Субасингх C, Shinozuka K, Cohen JS (апрель 1988). «Физико-химические свойства фосфоротиоатных олигодезоксинуклеотидов» . Исследования нуклеиновых кислот . 16 (8): 3209–21. DOI : 10.1093 / NAR / 16.8.3209 . PMC 336489 . PMID 2836790 .

[:3-9] Crooke ST (апрель 2017 г.). «Молекулярные механизмы антисмысловых олигонуклеотидов» . Нуклеиновые кислоты . 27 (2): 70–77. DOI : 10.1089 / nat.2016.0656 . PMC 5372764 . PMID 28080221 .

[pmid10885751-10] Heasman Дж, Kofron М, Уайли С (июнь 2000 г.). «Активность передачи сигналов бета-катенина в раннем эмбрионе Xenopus: новый антисмысловой подход». Биология развития . 222 (1): 124–34. DOI : 10.1006 / dbio.2000.9720 . PMID 10885751 .

[11] Кумар Р, Кумар В, раджпутская R, Саксен л, Banerjea переменный ток, Кханы М (ноябрь 2013 г. ). «Перекрестный защитный эффект антисмыслового олигонуклеотида, разработанный против обычного 3 'NCR генома вируса гриппа A». Молекулярная биотехнология . 55 (3): 203–11. DOI : 10.1007 / s12033-013-9670-8 . PMID 23729285 .

[12] Кумар В, Кханна М, Кумар Р, Sood В, Виас R, Banerjea переменного тока (май 2012). «Опосредованное нуклеиновой кислотой расщепление гена M1 вируса гриппа A значительно усиливается антисмысловыми молекулами, нацеленными на гибридизацию вблизи сайта расщепления». Молекулярная биотехнология . 51 (1): 27–36. DOI : 10.1007 / s12033-011-9437-Z . PMID 21744034 .

[13] Смит Р.А., Миллер TM, Яманака К., Мония Б.П., Кондон Т.П., Хунг Г. (Август 2006 г.). «Антисмысловая олигонуклеотидная терапия нейродегенеративного заболевания» . Журнал клинических исследований . 116 (8): 2290–6. DOI : 10.1172 / JCI25424 . PMC 1518790 . PMID 16878173 .

[14] Buszewski B, Кастури P, Гилпин РК, Gangoda ME, Jaroniec M (август 1994). «Хроматографические и родственные исследования алкиламидных фаз». Хроматография . 39 (3–4): 155–61. DOI : 10.1007 / BF02274494 .

[15] Buszewski В, Safaei Z, Studzińska S (январь 2015). «Анализ олигонуклеотидов методом жидкостной хроматографии с неподвижной фазой алкиламида» . Открытая химия . 13 (1). DOI : 10,1515 / Хим-2015-0141 .

[16] Distler AM, Allison J (апрель 2001). «5-Метоксисалициловая кислота и спермин: новая матрица для матричного масс-спектрометрического анализа олигонуклеотидов с лазерной десорбцией / ионизацией». Журнал Американского общества масс-спектрометрии . 12 (4): 456–62. DOI : 10.1016 / S1044-0305 (01) 00212-4 . PMID 11322192 .

[17] Relógio А, Швагер С, Рихтер А, Ansorge Вт, Валькарсель J (июнь 2002 г.). «Оптимизация микрочипов ДНК на основе олигонуклеотидов» . Исследования нуклеиновых кислот . 30 (11): e51. DOI : 10.1093 / NAR / 30.11.e51 . PMC 117213 . PMID 12034852 .

[18] Gong P, Харберс GM, Грейнджер DW (апрель 2006). «Сравнение нескольких методов поверхностной плотности иммобилизованных и гибридизированных олигонуклеотидов на предметных стеклах коммерческих амино-реактивных микрочипов». Аналитическая химия . 78 (7): 2342–51. DOI : 10.1021 / ac051812m . PMID 16579618 .

[1]