Это хорошая статья. Для получения дополнительной информации нажмите здесь.
Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Синтез олигонуклеотидов - это химический синтез относительно коротких фрагментов нуклеиновых кислот с определенной химической структурой ( последовательностью ). Этот метод чрезвычайно полезен в современной лабораторной практике, поскольку он обеспечивает быстрый и недорогой доступ к изготовленным на заказ олигонуклеотидам желаемой последовательности. В то время как ферменты синтезируют ДНК и РНК только в направлении от 5 'до 3' , химический синтез олигонуклеотидов не имеет этого ограничения, хотя чаще всего он осуществляется в противоположном направлении, от 3 'до 5'. В настоящее время процесс реализован как твердофазный синтез с использованием фосфорамидита.строительные блоки метода и фосфорамидита, полученные из защищенных 2'-дезоксинуклеозидов ( dA , dC , dG и T ), рибонуклеозидов ( A , C , G и U ) или химически модифицированных нуклеозидов, например LNA или BNA .

Для получения желаемого олигонуклеотида строительные блоки последовательно связывают с растущей олигонуклеотидной цепью в порядке, требуемом для последовательности продукта (см. « Синтетический цикл» ниже). Процесс полностью автоматизирован с конца 1970-х годов. По завершении сборки цепи продукт переводится из твердой фазы в раствор, снимается защита и собирается. Возникновение побочных реакций устанавливает практические ограничения на длину синтетических олигонуклеотидов (примерно до 200 нуклеотидных остатков), поскольку количество ошибок накапливается с увеличением длины синтезируемого олигонуклеотида. [1] Продукты часто выделяют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.(ВЭЖХ) для получения желаемых олигонуклеотидов высокой чистоты. Обычно синтетические олигонуклеотиды представляют собой одноцепочечные молекулы ДНК или РНК длиной около 15-25 оснований.

Олигонуклеотиды находят множество применений в молекулярной биологии и медицине. Чаще всего они используются в качестве антисмысловых олигонуклеотидов, малых интерферирующих РНК , праймеров для секвенирования и амплификации ДНК , зондов для обнаружения комплементарной ДНК или РНК посредством молекулярной гибридизации , инструментов для целенаправленного введения мутаций и сайтов рестрикции , а также для синтеза искусственных генов .

История [ править ]

В ходе эволюции синтеза олигонуклеотидов были выявлены четыре основных метода образования межнуклеозидных связей, которые были подробно рассмотрены в литературе. [2] [3] [4]

Ранние работы и современный синтез H-фосфоната [ править ]

Схема. 1. i : N- хлорсукцинимид; Bn = -CH 2 Ph

В начале 1950 - х годов, Александр Тодд группы «ы впервые H-фосфонат и фосфатные методы триэфир синтеза олигонуклеотидов. [5] [6] Реакция соединений 1 и 2 с образованием H-фосфонатного диэфира 3 представляет собой H-фосфонатное сочетание в растворе, тогда как реакция соединений 4 и 5 с образованием 6 представляет собой фосфотриэфирное сочетание (см. Синтез фосфотриэфира ниже).

Схема 2. Синтез олигонуклеотидов H-фосфонатным методом.

Тридцать лет спустя эта работа вдохновила две независимые исследовательские группы применить химию H-фосфоната к твердофазному синтезу с использованием моноэфиров нуклеозида H-фосфоната 7 в качестве строительных блоков и пивалоилхлорида, 2,4,6-триизопропилбензолсульфонилхлорида (TPS -Cl) и другие соединения в качестве активаторов. [7] [8] Практическая реализация H-фосфонатного метода привела к очень короткому и простому синтетическому циклу, состоящему всего из двух стадий, детритилирования и связывания (Схема 2). Окисление межнуклеозидных H-фосфонатных диэфирных связей в 8 до фосфодиэфирных связей в 9 раствором йода в водном пиридинеосуществляется в конце сборки цепи, а не в качестве этапа синтетического цикла. При желании окисление можно проводить в безводных условиях. [9] Альтернативно, 8 можно превратить в фосфоротиоат 10 [10] [11] [12] [13] или фосфороселеноат 11 (X = Se), [14] или окислить CCl 4 в присутствии первичных или вторичных аминов до аналоги фосфорамидата 12 . [15] [16]Метод очень удобен тем, что различные типы фосфатных модификаций (фосфат / фосфоротиоат / фосфорамидат) могут быть введены в один и тот же олигонуклеотид для модуляции его свойств. [17] [18] [19]

Чаще всего строительные блоки H-фосфоната защищены по 5'-гидроксигруппе и по аминогруппе нуклеиновых оснований A, C и G таким же образом, как и строительные блоки из фосфорамидита (см. Ниже). Однако защита аминогруппы не является обязательной. [9] [20]

Синтез фосфодиэфира [ править ]

Схема. 3 Связывание олигонуклеотидов фосфодиэфирным методом; Tr = -CPh 3

В 1950-х годах Хар Гобинд Хорана и его сотрудники разработали фосфодиэфирный метод, в котором 3'- O- ацетилнуклеозид-5'- O- фосфат 2 (схема 3) активировали N , N' - дициклогексилкарбодиимидом (DCC) или 4-толуолсульфонилом. хлорид (Ц-Сl). Активированные частицы реагировали с 5'- O- защищенным нуклеозидом 1 с получением защищенного динуклеозидмонофосфата 3 . [21] После удаления 3'- O-ацетильная группа с использованием катализируемого основанием гидролиза, проводили дальнейшее удлинение цепи. Следуя этой методологии, были синтезированы наборы три- и тетрадезоксирибонуклеотидов, которые ферментативно преобразовались в более длинные олигонуклеотиды, что позволило выяснить генетический код . Основное ограничение фосфодиэфирного метода состояло в образовании пирофосфатных олигомеров и олигонуклеотидов, разветвленных у межнуклеозидного фосфата. Этот метод кажется шагом назад от более избирательной химии, описанной ранее; однако в то время большинство доступных сейчас фосфатзащитных групп еще не было введено. Отсутствие удобной стратегии защиты вынудило отступить к более медленным и менее избирательным химическим реакциям для достижения конечной цели исследования. [2]

Синтез фосфотриэфира [ править ]

Схема 4. Олигонуклеотидное связывание фосфотриэфирным методом. MMT = -CPh 2 (4-MeOC 6 H 4 ).

В 1960-х годах группы под руководством Р. Летсингера [22] и К. Риза [23] разработали фосфотриэфирный подход. Определяющим отличием от фосфодиэфирного подхода была защита фосфатной части в строительном блоке 1 (схема 4) и в продукте 3 с помощью 2-цианоэтильной группы. Это препятствовало образованию олигонуклеотидов, разветвленных по межнуклеозидному фосфату. Более высокая селективность метода позволила использовать более эффективные связующие агенты и катализаторы [24] [25], что резко сократило продолжительность синтеза. Метод, первоначально разработанный для фазового синтеза в растворе, был также реализован на малосшитом полистироле «попкорн»,[26], а затем и стекло с контролируемыми порами (CPG, см. «Твердый поддерживающий материал» ниже), что положило начало масштабным исследованиям твердофазного синтеза олигонуклеотидов и, в конечном итоге, привело к автоматизации сборки олигонуклеотидной цепи.

Синтез триэфира фосфита [ править ]

В 1970-х годах для образования межнуклеозидных связей были успешно использованы значительно более реактивные P (III) производные нуклеозидов, 3'- O- хлорфосфиты. [27] Это привело к открытию методологии фосфит-триэфира . Группа под руководством М. Карутерса воспользовалась менее агрессивными и более селективными 1 H -тетразолидофосфитами и реализовала метод на твердой фазе. [28] Вскоре после этого сотрудники той же группы усовершенствовали метод, используя более стабильные нуклеозидные фосфорамидиты в качестве строительных блоков. [29] Использование 2-цианоэтилфосфит-защитной группы [30] вместо менее удобной для использования метиловой группы.группа [31] [32] привела к нуклеозидным фосфорамидитам, которые в настоящее время используются в синтезе олигонуклеотидов (см. строительные блоки фосфорамидита ниже). Многие более поздние усовершенствования в производстве строительных блоков, синтезаторов олигонуклеотидов и синтетических протоколов сделали химию фосфорамидитов очень надежным и целесообразным методом выбора для получения синтетических олигонуклеотидов. [1]

Синтез фосфорамидитным методом [ править ]

Строительные блоки [ править ]

Нуклеозидные фосфорамидиты [ править ]

Основная статья: Нуклеозид фосфорамидит
Защищенные 2'-дезоксинуклеозид фосфорамидиты.

Как упоминалось выше, встречающиеся в природе нуклеотиды (нуклеозид-3'- или 5'-фосфаты) и их фосфодиэфирные аналоги недостаточно реакционноспособны, чтобы обеспечить быстрое синтетическое получение олигонуклеотидов с высокими выходами. Селективность и скорость образования межнуклеозидных связей значительно улучшаются при использовании 3'- O - ( N , N- диизопропилфосфорамидит) производных нуклеозидов (нуклеозид фосфорамидитов), которые служат строительными блоками в методологии фосфит-триэфира. Чтобы предотвратить нежелательные побочные реакции, все другие функциональные группы, присутствующие в нуклеозидах, должны быть неактивными (защищены) путем присоединения защитных групп.. По завершении сборки олигонуклеотидной цепи все защитные группы удаляются с получением желаемых олигонуклеотидов. Ниже приводится краткий обзор защитных групп, используемых в настоящее время в коммерчески доступных [33] [34] [35] [36], а также наиболее распространенных строительных блоках нуклеозид-фосфорамидита:

  • 5'-гидроксильная группа защищена кислотолабильной группой DMT (4,4'-диметокситритил).
  • Тимин и урацил , нуклеиновые основания тимидина и уридина , соответственно, не имеют экзоциклических аминогрупп и, следовательно, не требуют какой-либо защиты.
  • Хотя нуклеиновое основание гуанозина и 2'-дезоксигуанозина действительно имеет экзоциклическую аминогруппу, его основность мала до такой степени, что оно не реагирует с фосфорамидитами в условиях реакции сочетания. Однако фосфорамидит, полученный из N2-незащищенного 5'- O- DMT-2'-дезоксигуанозина, плохо растворяется в ацетонитриле , растворителе, обычно используемом в синтезе олигонуклеотидов. [37] Напротив, N2-защищенные версии того же соединения хорошо растворяются в ацетонитриле и поэтому широко используются. Нуклеиновые основания аденин и цитозиннесут экзоциклические аминогруппы, реагирующие с активированными фосфорамидитами в условиях реакции сочетания. За счет использования дополнительных стадий в синтетическом цикле [38] [39] или альтернативных связывающих агентов и систем растворителей [37] сборка олигонуклеотидной цепи может быть проведена с использованием dA и dC фосфорамидитов с незащищенными аминогруппами. Однако эти подходы в настоящее время остаются в стадии исследования. При рутинном синтезе олигонуклеотидов экзоциклические аминогруппы в нуклеозидах постоянно защищены по всей длине сборки олигонуклеотидной цепи.

Защита экзоциклических аминогрупп должна быть ортогональной защите 5'-гидроксигруппы, поскольку последняя удаляется в конце каждого цикла синтеза. Самая простая в реализации и, следовательно, наиболее широко используемая стратегия - это установка лабильной по основанию защитной группы на экзоциклических аминогруппах. Чаще всего используются две схемы защиты.

  • В первом случае стандартная и более надежная схема (рисунок), защита Bz (бензоил) используется для A, dA, C и dC, в то время как G и dG защищены изобутирильной группой. Совсем недавно Ac (ацетильная) группа использовалась для защиты C и dC, как показано на рисунке. [40]
  • Во второй, мягкой схеме защиты, A и dA защищены изобутирильными [41] или феноксиацетильными группами (PAC). [42] C и dC несут ацетильную защиту, [40] и G и dG защищены 4-изопропилфеноксиацетильными ( i Pr-PAC) [43] или диметилформамидино (dmf) [44] группами. Мягкие защитные группы удаляются легче, чем стандартные защитные группы. Однако фосфорамидиты, несущие эти группы, менее стабильны при хранении в растворе.
  • Фосфитная группа защищена лабильной по основанию 2-цианоэтильной группой. [30] После того, как фосфорамидит был связан с олигонуклеотидом, связанным с твердой подложкой, и фосфитные фрагменты были преобразованы в формы P (V), присутствие фосфатной защиты не является обязательным для успешного проведения дальнейших реакций сочетания. [45]
2'- O- защищенные рибонуклеозидные фосфорамидиты.
  • При синтезе РНК 2'-гидроксигруппа защищена группой TBDMS ( т- бутилдиметилсилил). [46] [47] [48] [49] , либо с TOM (три- изо -propylsilyloxymethyl) группу, [50] [51] оба являются съемными обработкой фторид - иона.
  • Фосфитный фрагмент также несет группу диизопропиламино ( i Pr 2 N), реактивную в кислых условиях. После активации диизопропиламиногруппа заменяется 5'-гидроксигруппой связанного с носителем олигонуклеотида (см. «Этап 2: Связывание» ниже).

Ненуклеозидные фосфорамидиты [ править ]

Ненуклеозидные фосфорамидиты для 5'-модификации синтетических олигонуклеотидов. ММТ = моно-метокситритил, (4-метоксифенил) дифенилметил.

Ненуклеозидные фосфорамидиты представляют собой фосфорамидитные реагенты, предназначенные для введения различных функциональных групп на концах синтетических олигонуклеотидов или между нуклеотидными остатками в середине последовательности. Чтобы быть введенным внутрь последовательности, ненуклеозидный модификатор должен обладать по крайней мере двумя гидроксигруппами, одна из которых часто защищена группой DMT, а другая несет реактивную фосфорамидитную составляющую.

Ненуклеозидные фосфорамидиты используются для введения желаемых групп, которые отсутствуют в природных нуклеозидах или которые могут быть введены более легко с использованием более простых химических конструкций. Очень короткий выбор коммерческих реагентов фосфорамидита показан на схеме для демонстрации доступного структурного и функционального разнообразия. Эти реагенты служат для присоединения 5'-концевых фосфатных ( 1 ), [52] NH 2 ( 2 ), [53] SH ( 3 ), [54] альдегидных ( 4 ), [55] и карбоксильных групп ( 5 ) , [56] CC тройные связи ( 6 ), [57]нерадиоактивные метки и гасители (примером является 6-FAM амидит 7 [58] для присоединения флуоресцеина и дабциламидита 8 , [59] соответственно), гидрофильные и гидрофобные модификаторы (примером являются гексаэтиленгликоль амидит 9 [60] [61] и холестерин амидит 10 , [62] соответственно) и биотин амидит 11 . [63]

Синтетический цикл [ править ]

Схема 5. Синтетический цикл получения олигонуклеотидов фосфорамидитным методом.

Синтез олигонуклеотидов осуществляется путем поэтапного добавления нуклеотидных остатков к 5'-концу растущей цепи до тех пор, пока не будет собрана желаемая последовательность. Каждое добавление называется синтетическим циклом (Схема 5) и состоит из четырех химических реакций:

Шаг 1. Деблокирование (детритилирование) [ править ]

Группа DMT удаляется раствором кислоты, такой как 2% трихлоруксусная кислота (TCA) или 3% дихлоруксусная кислота (DCA), в инертном растворителе ( дихлорметане или толуоле ). Образовавшийся катион ДМТ оранжевого цвета вымывается; Эта стадия приводит к получению связанного с твердой подложкой предшественника олигонуклеотида, несущего свободную 5'-концевую гидроксильную группу. Следует помнить, что проведение детритилирования в течение длительного времени или с более сильными, чем рекомендуемые, растворами кислот приводит к депуринизации олигонуклеотида, связанного с твердой подложкой, и, таким образом, снижает выход желаемого полноразмерного продукта.

Шаг 2: соединение [ править ]

0,02–0,2 М раствор нуклеозид фосфорамидита (или смеси нескольких фосфорамидитов) в ацетонитриле активируют 0,2–0,7 М раствором кислого азольного катализатора, 1 H- тетразола , 5-этилтио-1H-тетразола, [64] 2-benzylthiotetrazole, [65] [66] 4,5-дициано имидазола , [67] или число подобных соединений. Более подробную информацию об использовании различных связывающих агентов в синтезе олигонуклеотидов можно найти в недавнем обзоре. [68] Смешивание обычно очень короткое и происходит в жидкостных линиях синтезаторов олигонуклеотидов (см. Ниже), в то время как компоненты доставляются в реакторы, содержащие твердую подложку. Активированный фосфорамидит в 1,5-20-кратном избытке по сравнению с материалом, связанным с носителем, затем приводится в контакт с исходным твердым носителем (первое связывание) или связанным с носителем предшественником олигонуклеотида (после связывания), 5'-гидроксильная группа которого реагирует с активированный фосфорамидитный фрагмент входящего нуклеозид-фосфорамидита с образованием фосфит-триэфирной связи. Связывание 2'-дезоксинуклеозид фосфорамидитов происходит очень быстро и требует, в небольшом масштабе, около 20 с для его завершения. Напротив, стерически затрудненные 2'- O-защищенным рибонуклеозидфосфорамидитам требуется 5-15 мин для связывания с высокими выходами. [47] [69] [70] [71] Реакция также очень чувствительна к присутствию воды, особенно при использовании разбавленных растворов фосфорамидитов, и обычно ее проводят в безводном ацетонитриле. Как правило, чем больше масштаб синтеза, тем меньше избыток и тем выше концентрация фосфорамидитов. Напротив, концентрация активатора в первую очередь определяется его растворимостью в ацетонитриле и не зависит от масштаба синтеза. По завершении связывания все несвязанные реагенты и побочные продукты удаляются промывкой.

Шаг 3. Ограничение [ править ]

Стадия кэппинга выполняется путем обработки связанного с твердым носителем материала смесью уксусного ангидрида и 1-метилимидазола или, реже, DMAP в качестве катализаторов, и в фосфорамидитном методе служит двум целям.

  • После завершения реакции связывания небольшой процент связанных с твердой подложкой 5'-ОН групп (от 0,1 до 1%) остается непрореагировавшим и должен быть постоянно заблокирован от дальнейшего удлинения цепи, чтобы предотвратить образование олигонуклеотидов с внутренним основанием. делеции, обычно называемые (n-1) шортмерами. Непрореагировавшие 5'-гидроксильные группы в значительной степени ацетилируются закрывающей смесью.
  • Также сообщалось, что фосфорамидиты, активированные 1 H -тетразолом, в небольшой степени реагируют с положением O 6 гуанозина. [72] При окислении I 2 / водой этот побочный продукт, возможно, за счет миграции O 6 -N7, подвергается депуринизации . Образованные таким образом апуриновые сайты легко отщепляются в ходе окончательного снятия защиты с олигонуклеотида в основных условиях (см. Ниже) с получением двух более коротких олигонуклеотидов, что снижает выход полноразмерного продукта. Модификации O 6 быстро удаляются обработкой блокирующим реагентом до тех пор, пока стадия блокирования выполняется додо окисления I 2 / вода.
  • Синтез олигонуклеотидфосфоротиоатов (OPS, см. Ниже) не включает окисление I 2 / вода и, соответственно, не страдает от побочных реакций, описанных выше. С другой стороны, если стадия кэпинга выполняется до сульфуризации, твердая подложка может содержать остаточный уксусный ангидрид и N-метилимидазол, оставшиеся после стадии кэппинга. Блокирующая смесь препятствует реакции переноса серы, что приводит к обширному образованию межнуклеозидных связей триэфирного фосфата вместо желаемых триэфиров PS. Следовательно, для синтеза OPS рекомендуется проводить стадию сульфуризации перед стадией укупорки. [73]

Шаг 4: Окисление [ править ]

Вновь образованная трехкоординированная фосфит-триэфирная связь не является естественной и имеет ограниченную стабильность в условиях синтеза олигонуклеотидов. Обработка связанного с носителем материала йодом и водой в присутствии слабого основания (пиридина, лутидина или коллидина ) окисляет триэфир фосфита до тетракоординированного триэфира фосфата, защищенного предшественника встречающейся в природе межнуклеозидной связи сложного диэфира фосфата. Окисление можно проводить в безводных условиях с использованием трет-бутилгидропероксида [74] или, что более эффективно, (1S) - (+) - (10-камфорсульфонил) оксазиридина (CSO). [75] [76] [77]Стадия окисления может быть заменена стадией сульфуризации для получения фосфоротиоатов олигонуклеотидов (см. Фосфоротиоаты олигонуклеотидов и их синтез ниже). В последнем случае стадию сульфуризации лучше всего проводить перед укупоркой.

Твердые опоры [ править ]

При твердофазном синтезе собираемый олигонуклеотид ковалентно связывается через свою 3'-концевую гидроксигруппу с твердым материалом носителя и остается прикрепленным к нему на протяжении всего процесса сборки цепи. Твердая подложка содержится в колонках, размеры которых зависят от масштаба синтеза и могут варьироваться от 0,05  мл до нескольких литров. Подавляющее большинство олигонуклеотидов синтезируется в малых масштабах от 10 нмоль до 1 мкмоль. Совсем недавно высокопроизводительный синтез олигонуклеотидов, при котором твердая подложка содержится в лунках многолуночных планшетов (чаще всего 96 или 384 лунки на планшет), стал методом выбора для параллельного синтеза олигонуклеотидов в малых масштабах. [78] В конце сборки цепи олигонуклеотид высвобождается из твердой подложки и элюируется из колонки или лунки.

Твердый вспомогательный материал [ править ]

В отличие от органического твердофазного синтеза и синтеза пептидов , синтез олигонуклеотидов лучше всего протекает на ненабухающих или слабо набухающих твердых носителях. Два наиболее часто используемых твердофазных материала - это стекло с контролируемыми порами (CPG) и макропористый полистирол (MPPS). [79]

  • CPG обычно определяется размером пор. В химии олигонуклеотидов размеры пор 500, 1000, 1500, 2000 и 3000  Å используются для получения примерно 50, 80, 100, 150 и 200-мерных олигонуклеотидов соответственно. Чтобы сделать нативный CPG пригодным для дальнейшей обработки, поверхность материала обрабатывают (3-аминопропил) триэтоксисиланом, чтобы получить аминопропиловый CPG. Аминопропильное плечо можно дополнительно удлинить, чтобы получить длинноцепочечный аминоалкил (LCAA) CPG. Затем аминогруппу используют в качестве якорной точки для линкеров, подходящих для синтеза олигонуклеотидов (см. Ниже).
  • MPPS, подходящий для синтеза олигонуклеотидов, представляет собой полистирол с низкой набухаемостью и высокой степенью сшивки, полученный полимеризацией дивинилбензола (минимум 60%), стирола и 4- хлорметилстирола в присутствии пористого агента. Полученный макропористый хлорметил MPPS превращается в аминометил MPPS.

Линкерная химия [ править ]

Коммерческие твердые носители для синтеза олигонуклеотидов.
Схема 6. Механизм 3'-дефосфорилирования олигонуклеотидов, собранных на универсальных твердых носителях.

Чтобы сделать материал твердой подложки подходящим для синтеза олигонуклеотидов, ненуклеозидные линкеры или нуклеозидсукцинаты ковалентно присоединяют к реакционноспособным аминогруппам в аминопропиловом CPG, LCAA CPG или аминометиловом MPPS. Остающиеся непрореагировавшие аминогруппы закрыты уксусным ангидридом . Обычно используются три концептуально различных группы твердых опор.

  • Универсальные опоры . В более современном, более удобном и более широко используемом методе синтез начинается с универсального носителя, где ненуклеозидный линкер присоединяется к твердому материалу носителя (соединения 1 и 2 ). Фосфорамидит, соответствующий 3'-концевому нуклеозидному остатку, связывают с универсальной твердой подложкой в ​​первом синтетическом цикле сборки олигонуклеотидной цепи с использованием стандартных протоколов. Затем сборка цепи продолжается до завершения, после чего с олигонуклеотида, связанного с твердой подложкой, снимается защита. Характерной особенностью универсальных твердых носителей является то, что высвобождение олигонуклеотидов происходит путем гидролитического расщепления связи PO, которая присоединяет 3'- O3'-концевого нуклеотидного остатка универсального линкера, как показано на схеме 6. Критическим преимуществом этого подхода является то, что используется одна и та же твердая подложка независимо от последовательности синтезируемого олигонуклеотида. Для полного удаления линкера и 3'-концевого фосфата из собранного олигонуклеотида твердый носитель 1 и несколько подобных твердых носителей [80] требуют газообразного аммиака [81], водного гидроксида аммония, водного метиламина [82] или их смеси [83] и имеются в продаже. [84] [85] Для твердого носителя 2 [86] требуется раствор аммиака в безводномметанол, а также имеется в продаже. [87] [88]
  • Нуклеозидные твердые носители . В исторически первом и все еще популярном подходе 3'-гидроксильная группа 3'-концевого нуклеозидного остатка присоединяется к твердой подложке через, чаще всего, 3'- O- сукцинильное плечо, как в соединении 3 . Сборка олигонуклеотидной цепи начинается со связывания строительного блока фосфорамидита, соответствующего нуклеотиду.второй остаток от 3'-конца. С 3'-концевой гидроксильной группы в олигонуклеотидах, синтезированных на нуклеозидных твердых носителях, снимается защита в несколько более мягких условиях, чем те, которые применимы для универсальных твердых носителей. Однако тот факт, что нуклеозидная твердая подложка должна быть выбрана в зависимости от последовательности, снижает производительность всего процесса синтеза и увеличивает вероятность ошибки человека.
  • Специальные твердые подложки используются для присоединения желаемых функциональных или репортерных групп к 3'-концу синтетических олигонуклеотидов. Например, коммерческий [89] твердый носитель 4 [90] позволяет получать олигонуклеотиды, несущие 3'-концевой 3-аминопропиловый линкер. Подобно ненуклеозидные фосфорамидиты, многие другие специальные твердые носители , предназначенные для крепления реакционноспособных функциональных групп, нерадиоактивных репортерных групп и концевых модификаторов ( ес холестерин или другие гидрофобных привязи) и подходят для различных применений являются коммерчески доступными. Более подробную информацию о различных твердых носителях для синтеза олигонуклеотидов можно найти в недавнем обзоре. [78]

Фосфоротиоаты олигонуклеотидов и их синтез [ править ]

S p и R p -диастереомерные межнуклеозидные фосфоротиоатные связи.

Фосфоротиоаты олигонуклеотидов (OPS) представляют собой модифицированные олигонуклеотиды, в которых один из атомов кислорода в фосфатном фрагменте заменен на серу. Только фосфоротиоаты, содержащие серу в немостиковом положении, как показано на рисунке, широко используются и коммерчески доступны. Замена непостоянного кислорода на серу создает новый центр хиральности у фосфора . В простом случае динуклеотида это приводит к образованию диастереомерной пары монофосфоротиоатов S p - и R p -динуклеозида, структуры которых показаны на фиг. В n -мерном олигонуклеотиде, где все ( n - 1) межнуклеозидные связи представляют собой фосфоротиоатные связи, количество диастереомеров m рассчитывается как m = 2 ( n  - 1) . Будучи ненатуральными аналогами нуклеиновых кислот, УОП, по существу , более устойчив по отношению к гидролизу с помощью нуклеаз , класс ферментов , которые разрушают нуклеиновые кислоты, нарушая мостиковую связь PO фосфодиэфирного фрагмента. Это свойство определяет использование OPS в качестве антисмысловых олигонуклеотидов в приложениях in vitro и in vivo, где неизбежно обширное воздействие нуклеаз. Точно так же для повышения стабильности миРНК, по крайней мере, одна фосфоротиоатная связь часто вводится на 3'-конце как смысловой, так и антисмысловой цепей. В хирально чистых OPS диастереомеры all-Sp более устойчивы к ферментативной деградации, чем их аналоги all-Rp. [91] Однако получение хирально чистого ОПС остается сложной задачей. [13] [92] В лабораторной практике обычно используются смеси диастереомеров OPS.

Синтез OPS очень похож на синтез природных олигонуклеотидов. Разница в том, что стадия окисления заменяется реакцией переноса серы (сульфуризацией), а стадия укупорки выполняется после сульфуризации. Из многих зарегистрированных реагентов, способных эффективно переносить серу, коммерчески доступны только три:

Коммерческие агенты переноса серы для синтеза олигонуклеотидов.
  • 3- (Диметиламинометилиден) амино-3H-1,2,4-дитиазол-3-тион, ДДТТ ( 3 ) обеспечивает быструю кинетику сульфуризации и высокую стабильность в растворе. [73] [93] [94] Реагент доступен из нескольких источников. [95] [96]
  • 1,1-диоксид 3 H -1,2-бензодитиол-3-она ( 4 ) [97] [98], также известный как реагент Бокэджа, демонстрирует лучшую растворимость в ацетонитриле и короткое время реакции. Однако реагент имеет ограниченную стабильность в растворе и менее эффективен в сульфуризации РНК-связей. [93] [94]
  • N, N, N'N ' -тетраэтилтиурам дисульфид (TETD) растворим в ацетонитриле и коммерчески доступен. [99] Однако реакция сульфуризации межнуклеозидной связи ДНК с TETD требует 15 минут, [100] что более чем в 10 раз медленнее, чем с соединениями 3 и 4 .

Автоматизация [ править ]

Раньше синтез олигонуклеотидов проводили вручную в растворе или на твердой фазе. Твердофазный синтез осуществлялся с использованием в качестве емкостей для твердой фазы миниатюрных стеклянных колонок, по форме напоминающих хроматографические колонки низкого давления или шприцы, снабженные пористыми фильтрами. [101] В настоящее время твердофазный синтез олигонуклеотидов осуществляется автоматически с использованием инструментов, управляемых компьютером (синтезаторы олигонуклеотидов), и технически реализован в форматах колонок, многолуночных планшетов и массивов. Формат столбца лучше всего подходит для исследований и крупномасштабных приложений, где не требуется высокая пропускная способность. [102]Формат многолуночного планшета разработан специально для высокопроизводительного синтеза в малых масштабах, чтобы удовлетворить растущий спрос промышленности и научных кругов на синтетические олигонуклеотиды. [103] Ряд синтезаторов олигонуклеотидов для мелкомасштабного синтеза [104] [105] [106] [107] [108] [109] и среднего и крупного синтеза [110]] коммерчески доступны.

Первые коммерчески доступные синтезаторы олигонуклеотидов [ править ]

В марте 1982 года на кафедре биохимии Высшей технической школы Дармштадта, Германия, был организован практический курс. М. Х. Карутерс, М. Дж. Гейт, Х. Г. Гассен, Х. Костер, К. Итакура и К. Бирр присутствовали и другие. Программа включала практические занятия, лекции и семинары по твердофазному химическому синтезу олигонуклеотидов. На семинаре присутствовала избранная группа из 15 студентов, у которых была беспрецедентная возможность получить инструкции от уважаемого преподавательского состава.

Наряду с ручными упражнениями, курс посетили несколько известных компаний по автоматизации. Biosearch из Новато, Калифорния, Генетический дизайн из Уотертауна, Массачусетс, были двумя из нескольких компаний, которые продемонстрировали автоматизированные синтезаторы на курсе. Компания Biosearch представила свой новый синтезатор SAM I. Компания Genetic Design разработала свой синтезатор на основе конструкции твердофазного пептидного секвенатора своей дочерней компании (Sequemat). Генетический дизайн согласован с доктором Кристианом Бирром (Институт медицинских исследований Макса Планка) [1]за неделю до мероприятия, чтобы преобразовать свой твердофазный секвенсор в полуавтоматический синтезатор. Команда во главе с доктором Алексом Боннером и Риком Невесом переоборудовала установку и перевезла ее в Дармштадт для проведения мероприятия и установила в лаборатории биохимии Высшей технической школы. Поскольку система была полуавтоматической, пользователь вводил следующую основу для добавления к последовательности выращивания во время каждого цикла. Система работала хорошо и произвела серию пробирок, наполненных ярко-красным тритилом, что указывало на полное связывание на каждом этапе. Позже эта система была полностью автоматизирована за счет включения автоматического инжектора и получила обозначение Model 25A.

История среднего и крупного синтеза олигонуклеотидов [ править ]

Крупномасштабные синтезаторы олигонуклеотидов часто разрабатывались путем расширения возможностей уже существующей инструментальной платформы. Один из первых синтезаторов среднего размера появился в конце 1980-х годов, произведенный компанией Biosearch в Новато, Калифорния (The 8800). Эта платформа была первоначально разработана как синтезатор пептидов и использовала реактор с псевдоожиженным слоем, необходимый для обеспечения характеристик набухания полистирольных носителей, используемых в методологии Меррифилда. Синтез олигонуклеотидов включал использование CPG (стекло с контролируемыми порами), которое является жесткой опорой и больше подходит для колонных реакторов, как описано выше. Масштаб 8800 был ограничен скоростью потока, необходимой для псевдоожижения опоры.Некоторые новые конструкции реакторов, а также более высокое, чем обычно, давление позволили 8800 достичь масштабов, которые позволили бы получить 1 ммоль олигонуклеотида. В середине 1990-х годов несколько компаний разработали платформы на основе полупрепаративных и препаративных жидкостных хроматографов. Эти системы хорошо подходили для колонного реактора. В большинстве случаев все, что требовалось, - это увеличить количество жидкостей, которые можно было доставить в колонку. Для синтеза олигонуклеотидов требуется как минимум 10, а в жидкостных хроматографах их обычно достаточно. Это была простая задача проектирования, и некоторые полуавтоматические стратегии работали без каких-либо модификаций ранее существовавшего оборудования для ЖХ. PerSeptive Biosystems и Pharmacia (GE) были двумя из нескольких компаний, которые разработали синтезаторы на основе жидкостных хроматографов. Genomic Technologies, Inc.В середине 1990-х годов несколько компаний разработали платформы на основе полупрепаративных и препаративных жидкостных хроматографов. Эти системы хорошо подходили для колонного реактора. В большинстве случаев все, что требовалось, - это увеличить количество жидкостей, которые можно было доставить в колонку. Для синтеза олигонуклеотидов требуется как минимум 10, а в жидкостных хроматографах их обычно достаточно. Это была простая задача проектирования, и некоторые полуавтоматические стратегии работали без каких-либо модификаций существующего оборудования для ЖХ. PerSeptive Biosystems и Pharmacia (GE) были двумя из нескольких компаний, которые разработали синтезаторы на основе жидкостных хроматографов. Genomic Technologies, Inc.В середине 1990-х годов несколько компаний разработали платформы на основе полупрепаративных и препаративных жидкостных хроматографов. Эти системы хорошо подходили для колонного реактора. В большинстве случаев все, что требовалось, - это увеличить количество жидкостей, которые можно было доставить в колонку. Для синтеза олигонуклеотидов требуется как минимум 10, а в жидкостных хроматографах их обычно достаточно. Это была простая задача проектирования, и некоторые полуавтоматические стратегии работали без каких-либо модификаций существующего оборудования для ЖХ. PerSeptive Biosystems и Pharmacia (GE) были двумя из нескольких компаний, которые разработали синтезаторы на основе жидкостных хроматографов. Genomic Technologies, Inc.Эти системы хорошо подходили для колонного реактора. В большинстве случаев все, что требовалось, - это увеличить количество жидкостей, которые можно было доставить в колонку. Для синтеза олигонуклеотидов требуется как минимум 10, а в жидкостных хроматографах их обычно достаточно. Это была простая задача проектирования, и некоторые полуавтоматические стратегии работали без каких-либо модификаций существующего оборудования для ЖХ. PerSeptive Biosystems и Pharmacia (GE) были двумя из нескольких компаний, которые разработали синтезаторы на основе жидкостных хроматографов. Genomic Technologies, Inc.Эти системы хорошо подходили для колонного реактора. В большинстве случаев все, что требовалось, - это увеличить количество жидкостей, которые можно было доставить в колонку. Для синтеза олигонуклеотидов требуется как минимум 10, а в жидкостных хроматографах их обычно достаточно. Это была простая задача проектирования, и некоторые полуавтоматические стратегии работали без каких-либо модификаций существующего оборудования для ЖХ. PerSeptive Biosystems и Pharmacia (GE) были двумя из нескольких компаний, которые разработали синтезаторы на основе жидкостных хроматографов. Genomic Technologies, Inc.Это была простая задача проектирования, и некоторые полуавтоматические стратегии работали без каких-либо модификаций ранее существовавшего оборудования LC. PerSeptive Biosystems и Pharmacia (GE) были двумя из нескольких компаний, которые разработали синтезаторы на основе жидкостных хроматографов. Genomic Technologies, Inc.Это была простая задача проектирования, и некоторые полуавтоматические стратегии работали без каких-либо модификаций ранее существовавшего оборудования LC. PerSeptive Biosystems и Pharmacia (GE) были двумя из нескольких компаний, которые разработали синтезаторы на основе жидкостных хроматографов. Genomic Technologies, Inc.[111] была одной из немногих компаний, разработавших крупномасштабный синтезатор олигонуклеотидов, который с самого начала был синтезатором олигонуклеотидов. Первоначальная платформа, названная VLSS для очень крупномасштабного синтезатора, использовала большие колонки жидкостного хроматографа Pharmacia в качестве реакторов и могла синтезировать до 75 миллимолей материала. Многие фабрики по синтезу олигонуклеотидов спроектировали и изготовили свои собственные индивидуальные платформы, и мало что известно из-за того, что эти конструкции являются патентованными. Конструкция VLSS продолжала совершенствоваться и была продолжена в синтезаторе QMaster [112], который представляет собой уменьшенную платформу, обеспечивающую количество синтетического олигонуклеотида от миллиграммов до граммов.

Недавно был проведен обзор современной практики синтеза химически модифицированных олигонуклеотидов в крупном масштабе. [113]

Синтез олигонуклеотидных микрочипов [ править ]

Основная статья: ДНК-микрочип § Изготовление

Можно представить себе микроматрицу олигонуклеотидов как миниатюрный многолуночный планшет, в котором намеренно удалены физические разделители между лунками (пластиковые стенки). Что касается химии, синтез микромассивов олигонуклеотидов отличается от обычного синтеза олигонуклеотидов в двух отношениях:

5'- O- MeNPOC-защищенный нуклеозид фосфорамидит.
  • Олигонуклеотиды остаются постоянно прикрепленными к твердой фазе, что требует использования линкеров, стабильных в условиях последней процедуры снятия защиты.
  • Отсутствие физических разделителей между сайтами, занимаемыми отдельными олигонуклеотидами, очень ограниченное пространство на поверхности микрочипа (одна олигонуклеотидная последовательность занимает квадрат 25 × 25 мкм) [114] и требование высокой точности синтеза олигонуклеотидов диктуют использование методик сайт-селективного 5'-снятия защиты. В одном подходе удаление 5'- O- DMT группы осуществляется электрохимическим образованием кислоты в требуемом месте (ах). [115] В другом подходе используется защитная группа 5'- O - (α-метил-6-нитропиперонилоксикарбонил) (MeNPOC), которая может быть удалена облучением УФ-светом с длиной волны 365 нм. [114]

Постсинтетическая обработка [ править ]

После завершения сборки цепи связанный с твердой подложкой олигонуклеотид полностью защищен:

  • 5'-концевая 5'-гидроксильная группа защищена группой DMT;
  • Межнуклеозидные фосфатные или фосфоротиоатные фрагменты защищены 2-цианоэтильными группами;
  • Экзоциклические аминогруппы во всех нуклеиновых основаниях, кроме T и U, защищены ацильными защитными группами.

Чтобы получить функциональный олигонуклеотид, необходимо удалить все защитные группы. Защита N-ацильного основания и защита 2-цианоэтилфосфата могут быть и часто удаляются одновременно обработкой неорганическими основаниями или аминами. Однако применимость этого метода ограничена тем фактом, что расщепление защиты 2-цианоэтилфосфата приводит к образованию акрилонитрила в качестве побочного продукта. В сильных основных условиях, необходимых для снятия N-ацильной защиты, акрилонитрил способен алкилировать нуклеиновые основания, в первую очередь, в N3-положении остатков тимина и урацила, с образованием соответствующих N3- (2-цианоэтил) аддуктов по Михаэлю. реакция. Образования этих побочных продуктов можно избежать, обрабатывая олигонуклеотиды, связанные с твердой подложкой, растворами оснований в органическом растворителе, например, с 50% триэтиламином в ацетонитриле [116] или 10% диэтиламином в ацетонитриле. [117] Эта обработка настоятельно рекомендуется для средних и крупных приготовлений и необязательна для синтезов в малых масштабах, где концентрация акрилонитрила, образующегося в смеси для снятия защиты, низкая.

Независимо от того, были ли сначала удалены фосфатные защитные группы, с связанных с твердой подложкой олигонуклеотидов снимают защиту с использованием одного из двух общих подходов.

  • (1) Чаще всего 5'-DMT-группа удаляется в конце сборки олигонуклеотидной цепи. Затем олигонуклеотиды высвобождаются из твердой фазы и снимаются защитные группы (основание и фосфат) обработкой водным гидроксидом аммония , водным метиламином , их смесями, [40] газообразным аммиаком или метиламином [118] или, что реже, растворами других первичных аминов или щелочи при комнатной или повышенной температуре. Это удаляет все оставшиеся защитные группы из 2'-дезоксиолигонуклеотидов, в результате чего получается реакционная смесь, содержащая желаемый продукт. Если олигонуклеотид содержит какие-либо 2'- O- защищенные рибонуклеотидные остатки, протокол снятия защиты включает второй этап, на котором 2'- O-защитные силильные группы удаляют обработкой фторид-ионом различными методами. [119] Продукт с полностью снятой защитой используют как есть, или желаемый олигонуклеотид может быть очищен несколькими способами. Чаще всего сырой продукт обессоливают с использованием осаждения этанолом , эксклюзионной хроматографии или обращенно-фазовой ВЭЖХ . Чтобы исключить нежелательные продукты усечения, олигонуклеотиды можно очистить с помощью электрофореза в полиакриламидном геле или анионообменной ВЭЖХ с последующим обессоливанием.
  • (2) Второй подход используется только в том случае, если предполагаемый метод очистки представляет собой обращенно-фазовую ВЭЖХ . В этом случае 5'-концевая группа DMT, которая служит гидрофобной ручкой для очистки, сохраняется в конце синтеза. С олигонуклеотида снимают защиту в основных условиях, как описано выше, и после выпаривания очищают обращенно-фазовой ВЭЖХ. Собранный материал затем детрилируют в кислой водной среде. В малых масштабах (менее 0,01–0,02 ммоль) часто используют обработку 80% водной уксусной кислотой в течение 15–30 мин при комнатной температуре с последующим упариванием реакционной смеси досуха в вакууме . Наконец, продукт обессоливают, как описано выше.
  • Для некоторых применений дополнительные репортерные группы могут быть присоединены к олигонуклеотиду с использованием различных постсинтетических процедур.

Характеристика [ править ]

Деконволюция ES MS неочищенного олигонуклеотида 5'-DMT-T 20 (расчетная масса 6324,26 Да).

Как и в случае любого другого органического соединения, разумно охарактеризовать синтетические олигонуклеотиды при их получении. В более сложных случаях (исследования и крупномасштабные синтезы) олигонуклеотиды охарактеризованы после снятия защиты и после очистки. Хотя конечным подходом к характеристике является секвенирование , относительно недорогая и рутинная процедура, соображения снижения стоимости исключают ее использование в рутинном производстве олигонуклеотидов. В повседневной практике достаточно получить молекулярную массу олигонуклеотида, записав его масс-спектр . В настоящее время широко используются два метода для характеристики олигонуклеотидов: масс-спектрометрия с электрораспылением (ES MS) иматричная лазерная десорбционная / ионизационная времяпролетная масс-спектрометрия ( MALDI-TOF ). Для получения информативных спектров очень важно заменить все ионы металлов, которые могут присутствовать в образце, на ионы аммония или триалкиламмония [ ec триэтиламмоний, (C 2 H 5 ) 3 NH + ] перед отправкой образца на анализ с помощью любого методов.

  • В спектре ES MS данный олигонуклеотид генерирует набор ионов, которые соответствуют различным состояниям ионизации соединения. Таким образом, олигонуклеотид с молекулярной массой M генерирует ионы с массами (M - n H) / n, где M - молекулярная масса олигонуклеотида в форме свободной кислоты (все отрицательные заряды межнуклеозидных фосфодиэфирных групп нейтрализуются с помощью H + ) , n - состояние ионизации, H - атомная масса водорода (1 Да ). Наиболее полезными для характеристики являются ионы с n в диапазоне от 2 до 5. Программное обеспечение, поставляемое с недавно произведенными приборами, позволяет выполнятьпроцедура деконволюции , то есть обнаружение пиков ионов, принадлежащих к одному набору, и определение молекулярной массы олигонуклеотида.
  • Для получения более подробной информации о профиле примесей олигонуклеотидов используется жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (LC-MS или HPLC-MS) [120] или масс-спектрометрия с капиллярным электрофорезом (CEMS) [121] .

См. Также [ править ]

  • Нуклеиновые кислоты
  • Аналоги нуклеиновой кислоты
  • Пептидная нуклеиновая кислота
  • Мостиковые нуклеиновые кислоты

Ссылки [ править ]

  1. ^ a b Beaucage, SL; Айер, Р.П. (1992). «Достижения в синтезе олигонуклеотидов с помощью фосфорамидитного подхода» . Тетраэдр . 48 (12): 2223. DOI : 10.1016 / S0040-4020 (01) 88752-4 .
  2. ^ a b Браун, Д.М. Краткая история синтеза олигонуклеотидов. Методы молекулярной биологии (Тотова, Нью-Джерси, США) (1993), 20 (Протоколы для олигонуклеотидов и аналогов), 1–17.
  3. ^ Риз, Колин Б. (2005). «Олиго- и полинуклеотиды: 50 лет химического синтеза». Органическая и биомолекулярная химия . 3 (21): 3851–68. DOI : 10.1039 / b510458k . PMID 16312051 . 
  4. ^ Айер, RP; Beaucage, SL 7.05. Синтез олигонуклеотидов. В: Комплексная химия натуральных продуктов, Том. 7: ДНК и аспекты молекулярной биологии . Kool, Эрик Т .; Редактор. Нет. (1999), Elsevier, Amsterdam, стр. 105–152.
  5. ^ Майкельсон, AM; Тодд, AR (1955). «Нуклеотиды, часть XXXII. Синтез дитимидиндинуклеотида, содержащего 3 ': 5'-межнуклеотидную связь». J. Chem. Soc. : 2632. DOI : 10.1039 / JR9550002632 .
  6. ^ Холл, RH; Тодд, А .; Уэбб, РФ (1957). «644. Нуклеотиды. Часть XLI. Смешанные ангидриды как промежуточные продукты в синтезе динуклеозидфосфатов». J. Chem. Soc. : 3291. DOI : 10.1039 / JR9570003291 .
  7. ^ Froehler, Британская Колумбия; Ng, PG; Маттеуччи, доктор медицины (1986). «Синтез ДНК через дезоксинуклеозидные H-фосфонатные промежуточные соединения» . Nucleic Acids Res . 14 (13): 5399–5407. DOI : 10.1093 / NAR / 14.13.5399 . PMC 311548 . PMID 3737406 .  
  8. ^ Garegg, PJ; Lindh, I .; Regberg, T .; Stawinski, J .; Стрёмберг, Р. (1986). «Нуклеозидные H-фосфонаты. III. Химический синтез олигодезоксирибонуклеотидов гидрофосфонатным методом». Tetrahedron Lett . 27 (34): 4051. DOI : 10.1016 / S0040-4039 (00) 84908-4 .
  9. ^ a b Wada, T .; Sato, Y .; Honda, F .; Kawahara, S .; Секин, М. (1997). «Химический синтез олигодезоксирибонуклеотидов с использованием N-незащищенных H-фосфонатных мономеров и реагентов, конденсирующих карбоний и фосфоний: O-селективное фосфонилирование и конденсация». Варенье. Chem. Soc . 119 (52): 12710–12721. DOI : 10.1021 / JA9726015 .
  10. ^ Agrawal, S .; Goodchild, J .; Чивейра, депутат; Thornton, AH; Зарин, ПС; Замечник, PC (1988). «Олигодезоксинуклеотид фосфорамидаты и фосфоротиоаты как ингибиторы вируса иммунодефицита человека» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 85 (19): 7079–7083. Bibcode : 1988PNAS ... 85.7079A . DOI : 10.1073 / pnas.85.19.7079 . PMC 282127 . PMID 3174622 .  
  11. ^ Камер, PCJ; Ролен, HCPF; Van den Elst, H .; Ван дер Марель, Г. А. и Ван Бум, Дж. Х. (1989). «Эффективный подход к синтезу фосфоротиоатных диэфиров с помощью реакции Шенберга». Tetrahedron Lett . 30 (48): 6757–6760. DOI : 10.1016 / S0040-4039 (00) 70669-1 .
  12. ^ Agrawal, S .; Тан, JY (1990). «Эффективный синтез олигорибонуклеотида и его фосфоротиоатного аналога с использованием H-фосфонатного подхода». Tetrahedron Lett . 31 (52): 7541–7544. DOI : 10.1016 / S0040-4039 (00) 97293-9 .
  13. ^ a b Almer, H .; Stawinski, J .; Стремберг, Р. (1996). «Синтез твердого носителя all-Rp-oligo (рибонуклеозид фосфоротиоат)» . Nucleic Acids Res . 24 (19): 3811–3820. DOI : 10.1093 / NAR / 24.19.3811 . PMC 146170 . PMID 8871563 .  
  14. ^ Трамвай, К .; Ван, X .; Ян, Х. (2007). «Легкий синтез фосфороселеноатов олигонуклеотидов». Орг. Lett . 9 (24): 5103–5106. DOI : 10.1021 / ol702305v . PMID 17973486 . 
  15. ^ Froehler, Британская Колумбия (1986). «Промежуточные продукты сложного диэфира дезоксинуклеозида H-фосфоната в синтезе аналогов межнуклеотидного фосфата». Tetrahedron Lett . 27 (46): 5575–5578. DOI : 10.1016 / S0040-4039 (00) 85269-7 .
  16. ^ Froehler, Британская Колумбия; Ng, PG; Маттеуччи, доктор медицины (1988). «Фосфорамидатные аналоги ДНК: синтез и термическая стабильность гетеродуплексов» . Nucleic Acids Res . 16 (11): 4831–4839. DOI : 10.1093 / NAR / 16.11.4831 . PMC 336699 . PMID 3387210 .  
  17. ^ Дагл, JM; Андраки, Мэн; ДеВайн, Р.Дж.; Уолдер, Дж. (1991). «Физические свойства олигонуклеотидов, содержащих модифицированные фосфорамидатом межнуклеозидные связи» . Nucleic Acids Res . 19 (8): 1805–1810. DOI : 10.1093 / NAR / 19.8.1805 . PMC 328108 . PMID 2030962 .  
  18. ^ Майер, Массачусетс; Гузаев, АП; Манохаран, М. (2000). «Синтез химерных олигонуклеотидов, содержащих фосфодиэфирные, фосфоротиоатные и фосфорамидатные связи». Орг. Lett . 2 (13): 1819–1822. DOI : 10.1021 / ol005842h . PMID 10891166 . 
  19. ^ Мохэ, Нью-Йорк; Padiya, KJ; Салунхе, ММ (2003). «Эффективный окисляющий реагент для синтеза олигонуклеотидов со смешанной основной цепью с помощью H-фосфонатного подхода». Биоорг. Med. Chem . 11 (7): 1419–1431. DOI : 10.1016 / S0968-0896 (02) 00615-6 . PMID 12628668 . 
  20. Перейти ↑ Kung, PP & Jones, RA (1992). «Синтез H-фосфонатной ДНК без амино защиты». Tetrahedron Lett . 33 (40): 5869–5872. DOI : 10.1016 / S0040-4039 (00) 61075-4 .
  21. ^ Гилхэм, PT; Хорана, HG (1958). «Исследования полинуклеотидов. I. Новый и общий метод химического синтеза межнуклеотидной связи C5'-C3 '. Синтезы дезоксирибо-динуклеотидов». Варенье. Chem. Soc . 80 (23): 6212. DOI : 10.1021 / ja01556a016 .
  22. ^ Letsinger, RL; Огилви, К.К. (1969). «Химия нуклеотидов. XIII. Синтез олиготимидилатов через фосфотриэфирные промежуточные соединения». Варенье. Chem. Soc . 91 (12): 3350. DOI : 10.1021 / ja01040a042 .
  23. ^ Риз, CB (1978). «Химический синтез олиго- и полинуклеотидов фосфотриэфирным подходом». Тетраэдр . 34 (21): 3143. DOI : 10,1016 / 0040-4020 (78) 87013-6 .
  24. ^ Ефимов, В.А. Бурякова А.А.; Ревердатто, SV; Чахмахчева О.Г .; Овчинников, Ю. А. (1983). «Быстрый синтез длинноцепочечных дезоксирибоолигонуклеотидов методом фосфотриэфира N-метилимидазолида» . Nucleic Acids Res . 11 (23): 8369–8387. DOI : 10.1093 / NAR / 11.23.8369 . PMC 326588 . PMID 6324083 .  
  25. ^ Ефимов, В. А; Молчанова Н.С.; Чахмахчева, О.Г. (2007). «Подход к синтезу природных и модифицированных олигонуклеотидов фосфотриэфирным методом с использованием О-нуклеофильного внутримолекулярного катализа». Нуклеозиды, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты . 26 (8–9): 1087–93. DOI : 10.1080 / 15257770701516268 . PMID 18058542 . 
  26. ^ Letsinger, RL; Махадеван, В. (1966). «Поэтапный синтез олигодезоксирибонуклеотидов на нерастворимом полимерном носителе». Варенье. Chem. Soc . 88 (22): 5319–24. DOI : 10.1021 / ja00974a053 . PMID 5979268 . 
  27. ^ Letsinger, RL; Finnan, JL; Lunsford, NB (1975). «Химия нуклеотидов. XX. Процедура связывания фосфита для создания межнуклеотидных связей». Варенье. Chem. Soc . 97 (11): 3278–9. DOI : 10.1021 / ja00844a090 . PMID 1133350 . 
  28. ^ Маттеуччи, доктор медицины; Карутерс, MH (1981). «Синтез дезоксиолигонуклеотидов на полимерной основе». Варенье. Chem. Soc . 103 (11): 3185. DOI : 10.1021 / ja00401a041 .
  29. ^ Beaucage, SL; Карутерс MH (1981). «Дезоксинуклеозид фосфорамидиты - новый класс ключевых промежуточных продуктов для синтеза дезоксиполинуклеотидов». Tetrahedron Lett . 22 (20): 1859. DOI : 10.1016 / S0040-4039 (01) 90461-7 .
  30. ^ а б Синха, Северная Дакота; Biernat, J .; McManus, J .; Кестер, Х. (1984). «Полимерный поддерживающий синтез олигонуклеотидов. XVIII: использование β-цианоэтил-N, N-диалкиламино- / N-морфолинофосфорамидита дезоксинуклеозидов для синтеза фрагментов ДНК, упрощающих снятие защиты и выделение конечного продукта» . Nucleic Acids Res . 12 (11): 4539–4557. DOI : 10.1093 / NAR / 12.11.4539 . PMC 318857 . PMID 6547529 .  
  31. ^ Макбрайд, LJ; Карутерс, MH (1983). «Химия нуклеотидов. X. Исследование нескольких дезоксинуклеозид фосфорамидитов, полезных для синтеза дезоксиолигонуклеотидов». Tetrahedron Lett . 24 (3): 245–248. DOI : 10.1016 / S0040-4039 (00) 81376-3 .
  32. ^ Адамс, SP; Кавка, КС; Wykes, EJ; Держатель, SB; Галлуппи, GR (1983). «Затрудненные диалкиламино-нуклеозид-фосфитные реагенты в синтезе двух 51-меров ДНК». Варенье. Chem. Soc . 105 (3): 661–663. DOI : 10.1021 / ja00341a078 .
  33. ^ "Бета-цианоэтилфосфорамидиты" . Products.appliedbiosystems.com . Проверено 12 мая 2009 .
  34. ^ «Технологии биопоиска» . Biosearchtech.com . Проверено 12 мая 2009 .
  35. ^ "ChemGenes Corporation, биотехнологическая компания" . Chemgenes.com . Проверено 12 мая 2009 .
  36. ^ Пауэлл, М. (17 января 2008 г.). «Инструменты прикладных биосистем» . Glenresearch.com . Проверено 12 мая 2009 .
  37. ^ a b Секин, М. Синтез ДНК без защиты оснований. В : Текущие протоколы в химии нуклеиновых кислот. Beaucage, SL, редактор (John Wiley & Sons, Inc.) (2004), глава 3, раздел 3.10., Стр. 3.10.1–3.10.15. Идентификатор PubMed: 18428925
  38. ^ Грязнов, СМ; Летцингер, Р.Л. (1991). «Синтез олигонуклеотидов через мономеры с незащищенными основаниями». Варенье. Chem. Soc . 113 (15): 5876–5877. DOI : 10.1021 / ja00015a059 .
  39. ^ Секине, М., Ohkubo, А. и Seio, К. (2003). «Стратегия протонного блока для синтеза олигодезоксинуклеотидов без защиты оснований, реакции кэппинга и реакции расщепления связи PN». J. Org. Chem . 68 (14): 5478–5492. DOI : 10.1021 / jo034204k . PMID 12839438 . CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  40. ^ a b c Редди, депутат; Hanna, NB; Фаруки, Ф (1997). «Сверхбыстрое расщепление и снятие защиты синтеза олигонуклеотидов и использование производных C Ac ». Нуклеозиды и нуклеотиды . 16 (7): 1589–1598. DOI : 10.1080 / 07328319708006236 .
  41. ^ Макминн, DL; Гринберг, ММ (1997). «Синтез олигонуклеотидов, содержащих 3'-алкиламины, с использованием N-изобутирил-защищенного дезоксиаденозинфосфорамидита». Tetrahedron Lett . 38 (18): 3123. DOI : 10.1016 / S0040-4039 (97) 00568-6 .
  42. ^ Шульхоф, JC; Молко, Д .; Теуль, Р. (1987). «Конечная стадия снятия защиты в синтезе олигонуклеотидов сводится к легкой и быстрой обработке аммиаком с использованием лабильных групп, защищающих основание» . Nucleic Acids Res . 15 (2): 397–416. DOI : 10.1093 / NAR / 15.2.397 . PMC 340442 . PMID 3822812 .  
  43. ^ Чжу, Q .; Делани, Миссури; Гринберг, ММ (2001). «Наблюдение и устранение N-ацетилирования олигонуклеотидов, полученных с использованием фосфорамидитов быстрого снятия защиты и сверхмягкого снятия защиты». Биоорг. Med. Chem. Lett . 11 (9): 1105–7. DOI : 10.1016 / S0960-894X (01) 00161-5 . PMID 11354354 . 
  44. ^ Макбрайд, LJ; Kierzek, R .; Beaucage, SL; Карутерс, MH (1986). «Химия нуклеотидов. 16. Защитные группы амидина для синтеза олигонуклеотидов». Варенье. Chem. Soc . 108 (8): 2040–2048. DOI : 10.1021 / ja00268a052 .
  45. ^ Гузаев, А.П .; Манохаран, М. (2001). «Связывание фосфорамидита с олигонуклеотидами, несущими незащищенные межнуклеозидные фосфатные фрагменты». J. Org. Chem . 66 (5): 1798–1804. DOI : 10.1021 / jo001591e . PMID 11262130 . 
  46. ^ Огилви, KK; Theriault, N .; Садана, К.Л. (1977). «Синтез олигорибонуклеотидов». Варенье. Chem. Soc . 99 (23): 7741–7743. DOI : 10.1021 / ja00465a073 . PMID 915168 . 
  47. ^ а б Усмань, Н .; Огилви, К.К .; Цзян, MY; Седергрен, Р.Дж. (1987). «Автоматический химический синтез длинных олигорибунклеотидов с использованием 2'-O-силилированных рибонуклеозид 3'-O-фосфорамидитов на стеклянной подложке с контролируемыми порами: синтез 43-нуклеотидной последовательности, аналогичной 3'-половинной молекуле формилметионина Escherichia coli тРНК ». Варенье. Chem. Soc . 109 (25): 7845–7854. DOI : 10.1021 / ja00259a037 .
  48. ^ Усман, Н .; Пон, РТ; Огилви, К.К. (1985). «Получение рибонуклеозидных 3'-O-фосфорамидитов и их применение в автоматизированном твердофазном синтезе олигонуклеотидов». Tetrahedron Lett . 26 (38): 4567–4570. DOI : 10.1016 / S0040-4039 (00) 98753-7 .
  49. ^ Scaringe, SA; Francklyn, C .; Усман, Н. (1990). «Химический синтез биологически активных олигорибонуклеотидов с использованием β-цианоэтил-защищенных рибонуклеозид-фосфорамидитов» . Nucleic Acids Res . 18 (18): 5433–5441. DOI : 10.1093 / NAR / 18.18.5433 . PMC 332221 . PMID 2216717 .  
  50. ^ Pitsch, S .; Weiss, PA; Wu, X .; Ackermann, D .; Онеггер, Т. (1999). «Быстрый и надежный автоматизированный синтез РНК и частично 2'-O-защищенных предшественников (« закрытая РНК ») на основе двух новых ортогональных 2'-O-защитных групп». Helv. Чим. Acta . 82 (10): 1753–1761. DOI : 10.1002 / (SICI) 1522-2675 (19991006) 82:10 <1753 :: AID-HLCA1753> 3.0.CO; 2-Y .
  51. ^ Pitsch, S .; Weiss, PA; Jenny, L .; Stutz, A .; Ву, X. (2001). «Надежный химический синтез олигорибонуклеотидов (РНК) с 2'-O - [(триизопропилсилил) окси] метил (2'-O-tom) -защищенными фосфорамидитами». Helv. Чим. Acta . 84 (12): 3773–3795. DOI : 10,1002 / 1522-2675 (20011219) 84:12 <3773 :: АИД-HLCA3773> 3.0.CO; 2-Е .
  52. ^ Гузаев, А .; Сало, H .; Ажаев, А .; Леннберг, Х. (1995). «Новый подход к химическому фосфорилированию олигодезоксирибонуклеотидов на 5'-конце». Тетраэдр . 51 (34): 9375–9384. DOI : 10.1016 / 0040-4020 (95) 00544-I .
  53. ^ Синха, Северная Дакота; Кук, RM (1988). «Получение и применение функционализированных синтетических олигонуклеотидов: III. Использование H-фосфонатных производных защищенного аминогексанола и меркаптопропанола или гексанола» . Nucleic Acids Res . 16 (6): 2659–2669. DOI : 10.1093 / NAR / 16.6.2659 . PMC 336396 . PMID 3362678 .  
  54. ^ Джонс, DS; Hachmann, JP; Конрад, MJ; Coutts, S .; Livingston, DA Intermediates для обеспечения функциональных групп на 5'-конце олигонуклеотидов, (1995) Патент США 5,391,785 .
  55. ^ Подыминогин, М.А. Лухтанов Э.А.; Рид, MW (2001). «Присоединение бензальдегид-модифицированных олигодезоксинуклеотидных зондов к стеклу, покрытому семикарбазидом» . Nucleic Acids Res . 29 (24): 5090–5098. DOI : 10.1093 / NAR / 29.24.5090 . PMC 97543 . PMID 11812841 .  
  56. ^ Лебедев, А.В.; Combs, D .; Хогрефе, Р.И. (2007). «Предварительно активированный карбоксильный линкер для быстрой конъюгации алкиламинов с олигонуклеотидами на твердой подложке». Bioconjugate Chem . 18 (5): 1530–1536. DOI : 10.1021 / bc0603891 . PMID 17877414 . 
  57. ^ Альвира, М .; Эритя, Р. (2007). «Синтез олигонуклеотидов, несущих 5'-5'-связи, с использованием реакций циклоприсоединения, катализируемых медью» (PDF) . Химия и биоразнообразие . 4 (12): 2798–2809. DOI : 10.1002 / cbdv.200790229 . hdl : 10261/124969 . PMID 18081090 .  
  58. ^ Кисть, СК "Фосфорамидиты, меченные флуоресцеином". (1996) Патент США 5,583,236 .
  59. ^ Питнер, JB; Linn, CP "Синтез и использование меченых фосфорамидитных композиций". (2000) Патент США 6,114,518 .
  60. ^ Левенсон; C .; Чанг; С.-А; Дубы; ФТ «Реагенты, функционализирующие олигонуклеотиды». (1990) Патент США 4914210 .
  61. ^ Durand, M .; Chevrie, K .; Chassignol, M .; Thuong, NT; Мауризо, JC (1990). «Изучение кругового дихроизма олигодезоксирибонуклеотида, содержащего шпильку из цепи гексаэтиленгликоля: конформация и стабильность» . Nucleic Acids Res . 18 (21): 6353–6359. DOI : 10.1093 / NAR / 18.21.6353 . PMC 332506 . PMID 2243780 .  
  62. ^ Christiano, A .; McSwiggen, J. «Опосредованное РНК-интерференцией ингибирование экспрессии гена ретинобластомы (RB1) с использованием короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты» . PCT Int. Прил. (2006), WO 2006078798 A2.
  63. Перейти ↑ Pon, RT (1991). «Реагент длинноцепочечного биотинфосфорамидита для автоматического синтеза 5'-биотинилированных олигонуклеотидов». Tetrahedron Lett . 32 (14): 1715–1718. DOI : 10.1016 / S0040-4039 (00) 74311-5 .
  64. ^ Sproat, B .; Colonna, F .; Мулла, Б .; Tsou, D .; Андрус, А .; Hampel, A .; Винаяк, Р. (1995). «Эффективный метод выделения и очистки олигорибонуклеотидов». Нуклеозиды и нуклеотиды . 14 (1 и 2): 255–273. DOI : 10.1080 / 15257779508014668 .
  65. ^ Stutz, A .; Hobartner, C .; Питч, С. (2000). «Новые фторид-лабильные защитные группы азотистых оснований для синтеза 3 '(2') - O-аминоацилированных последовательностей РНК». Helv. Чим. Acta . 83 (9): 2477–2503. DOI : 10.1002 / 1522-2675 (20000906) 83: 9 <2477 :: АИД-hlca2477> 3.0.co; 2-9 .
  66. ^ Welz, R .; Мюллер, С. (2002). «5- (Бензилмеркапто) -1H-тетразол в качестве активатора для 2'-O-TBDMS фосфорамидитных строительных блоков в синтезе РНК». Tetrahedron Lett . 43 (5): 795–797. DOI : 10.1016 / S0040-4039 (01) 02274-2 .
  67. ^ Vargeese, C .; Картер, Дж .; Yegge, J .; Кривянский, С .; Settle, A .; Kropp, E .; Петерсон, К .; Пикен, В. (1998). «Эффективная активация нуклеозидфосфорамидитов 4,5-дицианоимидазолом при синтезе олигонуклеотидов» . Nucleic Acids Res . 26 (4): 1046–1050. DOI : 10.1093 / NAR / 26.4.1046 . PMC 147346 . PMID 9461466 .  
  68. ^ Вэй, Ся (2013). «Активаторы связывания для синтеза олигонуклеотидов через фосфорамидитный подход». Тетраэдр . 69 (18): 3615–3637. DOI : 10.1016 / j.tet.2013.03.001 .
  69. ^ Огилви, KK; Усман, Н .; Никогосиан, К .; Седергрен, Р.Дж. (1988). «Полный химический синтез последовательности РНК длиной 77 нуклеотидов, обладающей метионин-акцепторной активностью» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 85 (16): 5764–5768. Bibcode : 1988PNAS ... 85.5764O . DOI : 10.1073 / pnas.85.16.5764 . PMC 281845 . PMID 3413059 .  
  70. ^ Ву, Т .; Огилви, К.К .; Перро, Ж. Пьер; Седергрен, Р.Дж. (1989). «Удобная процедура приготовления специфических смешанных ДНК-РНК-полимеров». Варенье. Chem. Soc . 111 (22): 8531–8533. DOI : 10.1021 / ja00204a043 .
  71. Перейти ↑ Pon, RT (1987). «Повышенная эффективность связывания с использованием 4-диметиламинопиридина (DMAP) и тетразола, 5- (о-нитрофенил) тетразола или 5- (п-нитрофенил) тетразола в твердофазном синтезе олигорибонуклеотидов с помощью фосфорамидитной процедуры». Tetrahedron Lett . 28 (32): 3643–3646. DOI : 10.1016 / S0040-4039 (00) 96344-5 .
  72. ^ Пон, RT; Усман, Н .; Дамха, MJ; Огилви, К.К. (1986). «Предотвращение модификации гуанина и расщепления цепи во время твердофазного синтеза олигонуклеотидов с использованием производных фосфорамидита» . Nucleic Acids Res . 14 (16): 6453–6470. DOI : 10.1093 / NAR / 14.16.6453 . PMC 311657 . PMID 3748816 .  
  73. ^ а б Гузаев А.П. (2011). «Реакционная способность 3H-1,2,4-дитиазол-3-тионов и 3H-1,2-дитиол-3-тионов в качестве сульфуризующих агентов для синтеза олигонуклеотидов». Tetrahedron Lett . 52 (3): 434–437. DOI : 10.1016 / j.tetlet.2010.11.086 .
  74. ^ Алул, RH; Singman, CN; Zhang, G .; Летцингер, Р.Л. (1991). «Оксалил-CPG: лабильная опора для синтеза чувствительных производных олигонуклеотидов» . Nucleic Acids Res . 19 (7): 1527–1532. DOI : 10.1093 / NAR / 19.7.1527 . PMC 333911 . PMID 2027761 .  
  75. ^ «Новый продукт: 0,5M CSO для неводного окисления в синтезе ДНК» . Glenres.com . Проверено 28 января 2013 .
  76. ^ Manoharan, M .; Lu, Y .; Каспер, Мэриленд; Джаст, Г. (2000). «Аллильная группа как защитная группа для межнуклеотидных фосфатных и тиофосфатных связей в синтезе олигонуклеотидов: условия легкого окисления и снятия защиты». Орг. Lett . 2 (3): 243–246. DOI : 10.1021 / ol9910518 . PMID 10814292 . 
  77. ^ Пракаш, Т.П .; Джонстон, JF; Грэм, MJ; Кондон, Т.П .; Манохаран, М. (2004). «2'-O- [2 - [(N, N-диметиламино) окси] этил] -модифицированные олигонуклеотиды ингибируют экспрессию мРНК in vitro и in vivo» . Nucleic Acids Res . 32 (2): 828–833. DOI : 10.1093 / NAR / gkh220 . PMC 373344 . PMID 14762210 .  
  78. ^ а б Гузаев А.П. Твердофазные носители для синтеза олигонуклеотидов. В : Текущие протоколы в химии нуклеиновых кислот. (John Wiley & Sons, Inc.) (2013), Глава 3, Раздел 3.1., Стр. 3.1.1–3.1.60. DOI : 10.1002 / 0471142700.nc0301s53
  79. ^ Pon, RT Твердофазные носители для синтеза олигонуклеотидов. Методы в молекулярной биологии (Totowa, NJ, США) (1993), 20 (протоколы для олигонуклеотидов и аналогов), 465-496 DOI : 10,1385 / 0-89603-281-7: 465 .
  80. ^ Гузаев, А.П .; Манохаран, М. (2003). «Конформационно предварительно организованная универсальная твердая подложка для эффективного синтеза олигонуклеотидов». Варенье. Chem. Soc . 125 (9): 2380–1. DOI : 10.1021 / ja0284613 . PMID 12603111 . 
  81. ^ Дженсен, Массачусетс; Андерсон, К.М.; Дэвис, Р.В. (2010). «Газофазное расщепление и дефосфорилирование универсальных линкерных олигодезоксинуклеотидов» . Нуклеозиды, нуклеотиды и нуклеотиды. Кислоты . 29 (11): 867–878. DOI : 10.1080 / 15257770.2010.534757 . PMC 6815660 . PMID 21128173 .  
  82. ^ "Отчет об исследованиях Glen продуктов для синтеза, модификации и маркировки олигонуцелотидов РНК и ДНК" . Glenresearch.com. 2008-01-17 . Проверено 12 мая 2009 .
  83. ^ «AM Chemicals, LLC, поставщик твердых носителей и реагентов для олигонуклеотидного и органического синтеза на твердой фазе» . Amchemicals.com. Архивировано из оригинала на 2011-07-07 . Проверено 12 мая 2009 .
  84. ^ «AM Chemicals, LLC, поставщик твердых носителей и реагентов для олигонуклеотидного и органического синтеза на твердой фазе» . Amchemicals.com. Архивировано из оригинала на 2011-07-07 . Проверено 12 мая 2009 .
  85. ^ Пауэлл, М. (17 января 2008 г.). «Опоры» . Glenresearch.com . Проверено 12 мая 2009 .
  86. ^ Ажаев, А.В.; Антопольский, МЛ (2001). «Амидная группа способствовала 3'-дефосфорилированию олигонуклеотидов, синтезированных на универсальных A-носителях». Тетраэдр . 57 (23): 4977–4986. DOI : 10.1016 / S0040-4020 (01) 00409-4 .
  87. ^ "Metkinen Universal Solid Support III" . Metkinenchemistry.com . Проверено 4 апреля 2012 .
  88. ^ "Продукты Glen Research Corporation для синтеза олигонуклеотидов ДНК и РНК - Поддержка - 27-5010, Universal Support III PS" . Glenresearch.com. 2008-11-14 . Проверено 12 мая 2009 .
  89. ^ "Отчет об исследованиях Glen продуктов для синтеза, модификации и маркировки олигонуцелотидов РНК и ДНК" . Glenres.com. 2008-01-17 . Проверено 12 мая 2009 .
  90. ^ Петри, CR; Рид, МВт; Адамс, AD; Мейер-младший, РБ (1992). «Улучшенная поддержка CPG для синтеза олигонуклеотидов с 3'-аминовыми хвостами». Bioconjugate Chem . 3 (1): 85–87. DOI : 10.1021 / bc00013a014 . PMID 1616954 . 
  91. ^ Лебедев, А.В.; Викстром, Э. (1996). «Проблема хиральности в P-замещенных олигонуклеотидах». Перспективы открытия и дизайна лекарств . 4 (1): 17–40. DOI : 10.1007 / BF02172106 .
  92. ^ Wilk, A .; Grajkowski, A .; Филлипс, Л.Р .; Beaucage, SL (2000). «Циклические N-ацилфосфорамидиты дезоксирибонуклеозидов как новый класс мономеров для стереоконтролируемого синтеза олиготимидилил- и олигодезоксицитидилил-фосфотиоатов». Варенье. Chem. Soc . 122 (10): 2149–2156. DOI : 10.1021 / ja991773u .
  93. ^ a b «Отчет об исследованиях продуктов Glen для синтеза, модификации и маркировки олигонуцелотидов РНК и ДНК» . Glenresearch.com. 2008-01-17 . Проверено 12 мая 2009 .
  94. ^ a b «Серительный реагент II и его использование в синтезе олигонуклеотид-фосфоротиоатов» (PDF) . Glen Research . 18 (1). 2006 . Проверено 1 августа 2009 .
  95. ^ «AM Chemicals, LLC, поставщик твердых носителей и реагентов для олигонуклеотидного и органического синтеза на твердой фазе» . Amchemicals.com. Архивировано из оригинала на 2009-02-18 . Проверено 12 мая 2009 .
  96. ^ "Продукты Glen Research Corporation для синтеза олигонуклеотидов ДНК и РНК - Minor Base - 40-4037, Sulfurizing Reagent II" . Glenresearch.com. 2008-11-14 . Проверено 12 мая 2009 .
  97. ^ Айер, RP; Egan, W .; Regan, JB; Beaucage, SL (1990). «1,1-диоксид 3H-1,2-бензодитиол-3-он в качестве улучшенного сульфуризующего реагента в твердофазном синтезе олигодезоксирибонуклеозидфосфоротиоатов». Варенье. Chem. Soc . 112 (3): 1253–1254. DOI : 10.1021 / ja00159a059 .
  98. ^ Beaucage, SL (2001). «1,1-диоксид 3Н-1,2-бензодитиол-3-он». Энциклопедия реагентов для органического синтеза E-EROS . DOI : 10.1002 / 047084289X.rn00167 . ISBN 978-0471936237.
  99. ^ "Реагенты синтезатора ДНК 3400/394/392/391" . Products.appliedbiosystems.com . Проверено 12 мая 2009 .
  100. ^ Vu, H .; Hirschbein, BL (1991). «Межнуклеотидная фосфитная сульфуризация с помощью дисульфида тетраэтилтиурама. Синтез фосфоротиоатных олигонуклеотидов с помощью химии фосфорамидита». Tetrahedron Lett . 32 (26): 3005–3008. DOI : 10.1016 / 0040-4039 (91) 80672-S .
  101. ^ Танака, Тошики; Летцингер, Р.Л. (1982). «Шприцевой метод ступенчатого химического синтеза олигонуклеотидов» . Nucleic Acids Res . 10 (10): 3249–3259. DOI : 10.1093 / NAR / 10.10.3249 . PMC 320704 . PMID 7099961 .  
  102. ^ "OligoMaster LS2" . Azcobiotech.com. Архивировано из оригинального 10 ноября 2011 года . Проверено 18 октября 2011 .
  103. ^ "Синтезатор олигонуклеотидов ДНК / РНК: MerMade 384" . Bioautomation.com. Архивировано из оригинального 30 сентября 2011 года . Проверено 18 октября 2011 .
  104. ^ "Синтезатор Олиго РНК ДНК - Доктор Олиго" . Biolytic.com . Проверено 11 марта 2019 .
  105. ^ "Синтезатор олигонуклеотидов ДНК / РНК: MerMade" . Bioautomation.com . Проверено 18 октября 2011 .
  106. ^ "Синтезаторы ДНК / РНК Azco" . Azcobiotech.com. Архивировано из оригинального 15 сентября 2011 года . Проверено 18 октября 2011 .
  107. ^ "Инструменты" . Biosset.com. Архивировано из оригинала 3 ноября 2012 года . Проверено 4 апреля 2012 .
  108. ^ "3900 Высокопроизводительный синтезатор ДНК и аксессуары" . Products.appliedbiosystems.com. 2008-03-28 . Проверено 18 октября 2011 .
  109. ^ «Polygen GmbH - Опыт и ноу-хау в разработке и производстве синтезаторов ДНК» . Polygen.de . Проверено 18 октября 2011 .
  110. ^ «GE Healthcare Life Sciences - Продукты - Синтезаторы олигонуклеотидов» . Gelifesciences.com. Архивировано из оригинального 7 -го августа 2011 года . Проверено 18 октября 2011 .
  111. ^ "Синтезатор ДНК / РНК QMaster" . Genomictechnologies.com.
  112. ^ "Синтезатор ДНК / РНК QMaster" . www.genomictechnologies.com/QmasterII.shtml.
  113. ^ Sanghvi, YS (2011). «Обновление статуса модифицированных олигонуклеотидов для применения в химиотерапии». Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem . 46 (16): 4.1.1–4.1.22. DOI : 10.1002 / 0471142700.nc0401s46 . ISBN 978-0471142706. PMID  21901670 .
  114. ^ a b Pease AC; Solas D .; Салливан Э.Дж.; Cronin MT; Холмс С.П.; Фодор С.П. (1994). «Световые олигонуклеотидные массивы для быстрого анализа последовательности ДНК» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 91 (11): 5022–5026. Bibcode : 1994PNAS ... 91.5022P . DOI : 10.1073 / pnas.91.11.5022 . PMC 43922 . PMID 8197176 .  
  115. ^ Egeland, R. D; Южный, EM (2005). «Электрохимически направленный синтез олигонуклеотидов для изготовления ДНК-микрочипов» (Полный текст) . Nucleic Acids Res . 33 (14): e125. DOI : 10.1093 / NAR / gni117 . PMC 1183109 . PMID 16085751 .   
  116. ^ Капальди, округ Колумбия; Gaus, H .; Krotz, AH; и другие. (2003). «Синтез высококачественных антисмысловых лекарств. Добавление акрилонитрила к фосфоротиоатным олигонуклеотидам: характеристика аддукта и избегание». Исследования и разработки в области органических процессов . 7 (6): 832–838. DOI : 10.1021 / op020090n .
  117. ^ Том 5: Снятие защиты до завершения в органических растворителях . Отчет Глена 22 (2)
  118. ^ Boal, JH; Wilk, A .; Harindranath, N .; Макс, EE; Kempel, T .; Beaucage, SL (1996). «Отщепление олигодезоксирибонуклеотидов от стеклянных носителей с контролируемыми порами и их быстрое снятие защиты газообразными аминами» (PDF) . Nucleic Acids Res . 24 (15): 3115–7. DOI : 10.1093 / NAR / 24.15.3115 . PMC 146024 . PMID 8760903 .   
  119. ^ Westman, E .; Стремберг, Р. (1994). «Удаление трет-бутилдиметилсилильной защиты при синтезе РНК. Триэтиламинтригидрофторид (TEA, 3HF) - более надежная альтернатива фториду тетрабутиламмония (TBAF)» . Nucleic Acids Res . 22 (12): 2430–1. DOI : 10.1093 / NAR / 22.12.2430 . PMC 523709 . PMID 7518583 .  
  120. ^ Кротц, А. Х; Gaus, H .; Харди, GE (2005). «Образование олигонуклеотидных аддуктов в фармацевтических препаратах». Фармацевтические разработки и технологии . 10 (2): 283–90. DOI : 10.1081 / PDT-54464 . PMID 15926677 . 
  121. ^ Willems, A .; Дефорс, DL; Ван Бокслаер, Дж. (2008). «Анализ олигонуклеотидов с использованием капиллярного зонного электрофореза и масс-спектрометрии с электрораспылением в методах молекулярной биологии». Капиллярный электрофорез . Тотова, штат Нью-Джерси. 384 : 401–414. DOI : 10.1007 / 978-1-59745-376-9_14 . PMID 18392576 . 

Дальнейшее чтение [ править ]

  • Комплексная химия натуральных продуктов, Том 7: ДНК и аспекты молекулярной биологии. Кул, Эрик Т., редактор. Нет. (1999), 733 стр. Издательство: (Elsevier, Amsterdam, Neth.)
  • Beaucage, SL; Айер, Р.П. (1992). «Достижения в синтезе олигонуклеотидов с помощью фосфорамидитного подхода» . Тетраэдр . 48 (12): 2223–2311. DOI : 10.1016 / s0040-4020 (01) 88752-4 .
  • Beaucage, SL; Айер, Р.П. (1993). «Функционализация олигонуклеотидов через производные фосфорамидита» . Тетраэдр . 49 (10): 1925–1963. DOI : 10.1016 / s0040-4020 (01) 86295-5 .
  • Beaucage, SL; Айер, Р.П. (1993). «Синтез модифицированных олигонуклеотидов с помощью фосфорамидитного подхода и их применения» . Тетраэдр . 49 (28): 6123–6194. DOI : 10.1016 / s0040-4020 (01) 87958-8 .
  • Beaucage, S. L. «Синтез олигодезоксирибонуклеотидов. Фосфорамидитный подход. Методы в молекулярной биологии (Тотова, Нью-Джерси, США) (1993), 20 (Протоколы для олигонуклеотидов и аналогов), 33–61.
  • Риз, CB (2002). «Химический синтез олиго- и полинуклеотидов: личный комментарий». Тетраэдр . 58 (44): 8893–8920. DOI : 10.1016 / s0040-4020 (02) 01084-0 .
  • Глейзер, Вики (1 мая 2009 г.). Рынок олиго получает выгоду от RNAi Focus . Новости генной инженерии и биотехнологии . Биотехнология. 29 . Мэри Энн Либерт. С. 46–49. ISSN  1935-472X . OCLC  77706455 . Архивировано из оригинального 16 апреля 2010 года . Проверено 25 июля 2009 года .