Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Двойная спираль ДНК

Синтез искусственных генов или синтез генов относится к группе методов, которые используются в синтетической биологии для конструирования и сборки генов из нуклеотидов de novo . В отличие от синтеза ДНК в живых клетках, для искусственного синтеза генов не требуется матричная ДНК, что позволяет синтезировать практически любую последовательность ДНК в лаборатории. Он состоит из двух основных этапов, первый из которых - это твердофазный синтез ДНК , иногда известный как печать ДНК . [1]Это дает фрагменты олигонуклеотидов, которые обычно составляют менее 200 пар оснований. Затем второй этап включает соединение этих олигонуклеотидных фрагментов с использованием различных методов сборки ДНК. Поскольку для искусственного синтеза генов не требуется матричная ДНК, теоретически возможно создать полностью синтетические молекулы ДНК без ограничений по нуклеотидной последовательности или размеру.

Синтез первого полного гена, дрожжевой тРНК , был продемонстрирован Хар Гобинд Хораной и его коллегами в 1972 году. [2] Синтез первых пептидных и белок- кодирующих генов был выполнен в лабораториях Герберта Бойера и Александра Маркхама , соответственно. [3] [4] Совсем недавно были разработаны методы искусственного синтеза генов, которые позволят собирать целые хромосомы и геномы. Первая синтетическая хромосома дрожжей была синтезирована в 2014 году, а также были синтезированы целые функциональные бактериальные хромосомы. [5]Кроме того, в будущем в искусственном синтезе генов могут использоваться новые пары азотистых оснований (неестественные пары оснований). [6] [7] [8]

Стандартные методы синтеза ДНК [ править ]

Синтез олигонуклеотидов [ править ]

Основная статья: Синтез олигонуклеотидов

Олигонуклеотиды химически синтезируются с использованием строительных блоков, называемых нуклеозид- фосфорамидитами . Это могут быть нормальные или модифицированные нуклеозиды, которые имеют защитные группы для предотвращения неправильного взаимодействия их аминов, гидроксильных групп и фосфатных групп. За один раз добавляют один фосфорамидит, снимают защиту с 5'-гидроксильной группы, добавляют новое основание и так далее. Цепь растет в направлении от 3 'к 5', что является обратным по отношению к биосинтезу. В конце все защитные группы удаляются. Тем не менее, поскольку это химический процесс, происходит несколько неправильных взаимодействий, приводящих к появлению некоторых дефектных продуктов. Чем длиннее синтезируемая олигонуклеотидная последовательность, тем больше дефектов, поэтому этот процесс применим только для получения коротких последовательностейнуклеотиды . Текущий практический предел составляет около 200 п.н. ( пар оснований ) для олигонуклеотида с достаточным качеством для непосредственного использования в биологических целях. ВЭЖХ может использоваться для выделения продуктов с правильной последовательностью. Между тем, большое количество олигонуклеотидов можно синтезировать параллельно на генных чипах . Для оптимального выполнения последующих процедур синтеза генов их следует готовить индивидуально и в больших масштабах.

Отжиг на основе соединения олигонуклеотидов [ править ]

Обычно набор индивидуально разработанных олигонуклеотидов изготавливается на автоматических твердофазных синтезаторах, очищается и затем соединяется с помощью специального отжига и стандартных реакций лигирования или полимеразы . Для повышения специфичности отжига олигонуклеотидов на стадии синтеза используется набор термостабильных ферментов ДНК- лигазы и полимеразы . На сегодняшний день описано несколько методов синтеза генов, таких как лигирование фосфорилированных перекрывающихся олигонуклеотидов [2] [3], метод Fok I [4] и модифицированная форма лигазной цепной реакции для синтеза генов. Дополнительно несколько ПЦРБыли описаны подходы к сборке. [9] Обычно они используют олигонуклеотиды длиной 40-50 нуклеотидов, которые перекрывают друг друга. Эти олигонуклеотиды предназначены для покрытия большей части последовательности обеих цепей, и полноразмерная молекула постепенно генерируется с помощью ПЦР с удлинением с перекрыванием (OE) [9], термодинамически сбалансированной ПЦР наизнанку (TBIO) [10] или комбинированных подходов. [11] Наиболее часто синтезируемые гены имеют размер от 600 до 1200 п.н., хотя гораздо более длинные гены были получены путем соединения ранее собранных фрагментов размером менее 1000 п.н. В этом диапазоне размеров необходимо протестировать несколько клонов-кандидатов, подтверждающих последовательность клонированного синтетического гена с помощью методов автоматического секвенирования.

Ограничения [ править ]

Более того, поскольку сборка полноразмерного генного продукта зависит от эффективного и специфического выравнивания длинных одноцепочечных олигонуклеотидов, критические параметры для успеха синтеза включают участки с расширенной последовательностью, содержащие вторичные структуры, вызванные инвертированными повторами, чрезвычайно высоким или низким содержанием GC, или повторяющиеся структуры. Обычно эти сегменты конкретного гена могут быть синтезированы только путем разделения процедуры на несколько последовательных шагов и окончательной сборки более коротких подпоследовательностей, что, в свою очередь, приводит к значительному увеличению времени и трудозатрат, необходимых для его получения. Результат эксперимента по синтезу генов сильно зависит от качества используемых олигонуклеотидов. Для этих протоколов синтеза генов на основе отжигакачество продукта прямо и экспоненциально зависит от правильности используемых олигонуклеотидов. В качестве альтернативы, после выполнения синтеза гена с олигонуклеотидами более низкого качества необходимо приложить больше усилий для последующего контроля качества во время анализа клонов, который обычно выполняется с помощью длительных стандартных процедур клонирования и секвенирования. Другая проблема, связанная со всеми современными методами синтеза генов, - высокая частота ошибок последовательности из-за использования химически синтезированных олигонуклеотидов. Частота ошибок увеличивается с увеличением длины олигонуклеотидов, и, как следствие, процент правильного продукта резко снижается по мере использования большего количества олигонуклеотидов. Проблема мутации может быть решена с помощью более коротких олигонуклеотидов, используемых для сборки гена. Тем не мение,все методы сборки, основанные на отжиге, требуют смешивания праймеров в одной пробирке. В этом случае более короткие перекрытия не всегда позволяют точный и специфический отжиг комплементарных праймеров, что приводит к ингибированию образования полноразмерных продуктов. Ручной дизайн олигонуклеотидов - трудоемкая процедура и не гарантирует успешного синтеза желаемого гена. Для оптимального выполнения почти всех методов, основанных на отжиге, температуры плавления перекрывающихся областей должны быть одинаковыми для всех олигонуклеотидов. Необходимая оптимизация праймеров должна выполняться с использованием специализированных программ конструирования олигонуклеотидов. К настоящему времени представлено несколько решений для автоматизированного конструирования праймеров для синтеза генов.более короткие перекрытия не всегда позволяют точно и специфично отжигать комплементарные праймеры, что приводит к ингибированию образования полноразмерных продуктов. Ручной дизайн олигонуклеотидов - трудоемкая процедура и не гарантирует успешного синтеза желаемого гена. Для оптимального выполнения почти всех методов, основанных на отжиге, температуры плавления перекрывающихся областей должны быть одинаковыми для всех олигонуклеотидов. Необходимая оптимизация праймеров должна выполняться с использованием специализированных программ конструирования олигонуклеотидов. К настоящему времени представлено несколько решений для автоматизированного конструирования праймеров для синтеза генов.более короткие перекрытия не всегда позволяют точно и специфично отжигать комплементарные праймеры, что приводит к ингибированию образования полноразмерных продуктов. Ручной дизайн олигонуклеотидов - трудоемкая процедура и не гарантирует успешного синтеза желаемого гена. Для оптимального выполнения почти всех методов, основанных на отжиге, температуры плавления перекрывающихся областей должны быть одинаковыми для всех олигонуклеотидов. Необходимая оптимизация праймеров должна выполняться с использованием специализированных программ конструирования олигонуклеотидов. К настоящему времени представлено несколько решений для автоматизированного конструирования праймеров для синтеза генов.Ручной дизайн олигонуклеотидов - трудоемкая процедура и не гарантирует успешного синтеза желаемого гена. Для оптимального выполнения почти всех методов, основанных на отжиге, температуры плавления перекрывающихся областей должны быть одинаковыми для всех олигонуклеотидов. Необходимая оптимизация праймеров должна выполняться с использованием специализированных программ конструирования олигонуклеотидов. К настоящему времени представлено несколько решений для автоматизированного конструирования праймеров для синтеза генов.Ручной дизайн олигонуклеотидов - трудоемкая процедура и не гарантирует успешного синтеза желаемого гена. Для оптимального выполнения почти всех методов, основанных на отжиге, температуры плавления перекрывающихся областей должны быть одинаковыми для всех олигонуклеотидов. Необходимая оптимизация праймеров должна выполняться с использованием специализированных программ конструирования олигонуклеотидов. К настоящему времени представлено несколько решений для автоматизированного конструирования праймеров для синтеза генов.К настоящему времени представлено несколько решений для автоматизированного конструирования праймеров для синтеза генов.К настоящему времени представлено несколько решений для автоматизированного конструирования праймеров для синтеза генов.[12] [13] [14]

Процедуры исправления ошибок [ править ]

Чтобы преодолеть проблемы, связанные с качеством олигонуклеотидов, было разработано несколько тщательно продуманных стратегий, использующих либо отдельно приготовленные фишинговые олигонуклеотиды [15], либо ферменты связывания несоответствия из семейства mutS [16], либо специфические эндонуклеазы из бактерий или фагов. [17] Тем не менее, все эти стратегии увеличивают время и затраты на синтез генов, основанный на отжиге химически синтезированных олигонуклеотидов.

Массивно параллельное секвенирование также использовалось в качестве инструмента для скрининга сложных библиотек олигонуклеотидов и обеспечения возможности получения точных молекул. В одном подходе олигонуклеотиды секвенируют на платформе пиросеквенирования 454, и роботизированная система создает изображения и выбирает отдельные шарики, соответствующие точной последовательности. [18] В другом подходе сложная библиотека олигонуклеотидов модифицируется уникальными фланкирующими тегами перед массовым параллельным секвенированием. Затем праймеры, ориентированные на метки, позволяют извлекать молекулы с желаемыми последовательностями с помощью исходящей ПЦР. [19]

Все чаще гены упорядочиваются в наборах, включая функционально связанные гены или несколько вариантов последовательностей одного гена. Практически все разрабатываемые терапевтические белки, такие как моноклональные антитела, оптимизированы путем тестирования многих вариантов генов на улучшенную функцию или экспрессию.

Неестественные пары оснований [ править ]

Основная статья: Неестественная пара оснований

В то время как традиционный синтез нуклеиновых кислот использует только 4 пары оснований - аденин, тимин, гуанин и цитозин, синтез олигонуклеотидов в будущем может включать использование неестественных пар оснований, которые являются искусственно созданными и синтезированными азотистыми основаниями, которые не встречаются в природе.

В 2012 году группа американских ученых во главе с Флойдом Ромесбергом, химическим биологом из Исследовательского института Скриппса в Сан-Диего, Калифорния, опубликовала, что его команда разработала неестественную пару оснований (UBP). Два новых искусственных нуклеотида или пара неестественных оснований (UBP) были названы d5SICS и dNaM . С технической точки зрения , эти искусственные нуклеотиды, несущие гидрофобные азотистые основания , содержат два слитых ароматических кольца, которые образуют комплекс (d5SICS – dNaM) или пару оснований в ДНК. В 2014 году та же команда из Исследовательского института Скриппса сообщила, что они синтезировали отрезок кольцевой ДНК, известный как плазмида.содержащие естественные пары оснований TA и CG вместе с наиболее эффективным UBP, разработанным лабораторией Ромесберга, и вставили его в клетки обычной бактерии E. coli, которая успешно реплицировала неестественные пары оснований в нескольких поколениях. Это первый известный пример передачи живым организмом расширенного генетического кода последующим поколениям. Это было частично достигнуто путем добавления поддерживающего гена водорослей, который экспрессирует переносчик нуклеотидтрифосфата, который эффективно импортирует трифосфаты как d5SICSTP, так и dNaMTP в бактерии E. coli . Затем естественные пути репликации бактерий используют их для точной репликации плазмиды, содержащей d5SICS-dNaM.

Успешное включение третьей пары оснований является значительным прорывом в достижении цели значительного увеличения числа аминокислот, которые могут кодироваться ДНК, с существующих 20 аминокислот до теоретически возможных 172, тем самым расширяя потенциал живых организмов до производить новые белки . [20] В будущем эти неестественные пары оснований могут быть синтезированы и включены в олигонуклеотиды с помощью методов печати ДНК.

Сборка ДНК [ править ]

Таким образом, печать ДНК может использоваться для получения частей ДНК, которые определяются как последовательности ДНК, кодирующие конкретную биологическую функцию (например, промоторы , последовательности регуляции транскрипции или открытые рамки считывания ). [21]Однако, поскольку синтез олигонуклеотидов обычно не может точно производить последовательности олигонуклеотидов длиной более нескольких сотен пар оснований, необходимо использовать методы сборки ДНК для сборки этих частей вместе для создания функциональных генов, мультигенных цепей или даже целых синтетических хромосом или геномов. Некоторые методы сборки ДНК определяют только протоколы соединения частей ДНК, в то время как другие методы также определяют правила для формата частей ДНК, которые с ними совместимы. Эти процессы можно масштабировать, чтобы обеспечить сборку целых хромосом или геномов. В последние годы увеличилось количество различных стандартов сборки ДНК, и по состоянию на 2015 год было разработано 14 различных стандартов сборки, каждый со своими плюсами и минусами. [22] В целом, разработка стандартов сборки ДНК значительно облегчила рабочий процесс синтетической биологии, помогла обмену материалом между исследовательскими группами, а также позволила создавать модульные и повторно используемые части ДНК. [22]

Различные методы сборки ДНК можно разделить на три основные категории - сборка, опосредованная эндонуклеазами, сайт-специфическая рекомбинация и сборка на основе длинного перекрытия. [22] Каждая группа методов имеет свои отличительные особенности, а также свои преимущества и ограничения.

Сборка, опосредованная эндонуклеазами [ править ]

Эндонуклеазы - это ферменты, которые распознают и расщепляют сегменты нуклеиновых кислот, и их можно использовать для управления сборкой ДНК. Из различных типов рестрикционных ферментов рестрикционные ферменты типа II являются наиболее общедоступными и используются, поскольку их сайты расщепления расположены рядом или в их сайтах узнавания. Следовательно, методы сборки, опосредованные эндонуклеазами, используют это свойство для определения частей ДНК и протоколов сборки.

BioBricks [ править ]

Основная статья: BioBrick
BBF RFC 10 сборка двух частей, совместимых с BioBricks. Обработка вышестоящего фрагмента EcoRI и SpeI и нижележащего фрагмента EcoRI и XbaI позволяет осуществить сборку в желаемой последовательности. Поскольку SpeI и XbaI образуют дополнительные выступы, они помогают связать два фрагмента ДНК вместе, создавая рубцовую последовательность. Все исходные сайты рестрикции сохраняются в конечной конструкции, которую затем можно использовать для дальнейших реакций BioBricks.

Стандарт сборки BioBricks был описан и представлен Томом Найтом в 2003 году и с тех пор постоянно обновляется. [23] В настоящее время наиболее часто используемым стандартом BioBricks является стандарт сборки 10 или BBF RFC 10. BioBricks определяет последовательность префиксов и суффиксов, необходимых для совместимости части ДНК с методом сборки BioBricks, что позволяет объединить вместе всю ДНК. части, которые находятся в формате BioBricks.

Префикс содержит сайты рестрикции для EcoRI, NotI и XBaI, а суффикс содержит сайты рестрикции SpeI, NotI и PstI. Вне области префикса и суффикса часть ДНК не должна содержать эти сайты рестрикции. Чтобы соединить две части BioBrick вместе, одна из плазмид расщепляется EcoRI и SpeI, а вторая плазмида расщепляется EcoRI и XbaI. Два выступа EcoRI дополняют друг друга и, таким образом, отжигаются вместе, в то время как SpeI и XbaI также создают дополнительные выступы, которые также можно лигировать вместе. Поскольку полученная плазмида содержит исходные последовательности префикса и суффикса, ее можно использовать для соединения с другими частями BioBricks. [24] Из-за этого свойства стандарт сборки BioBricks называется идемпотентным.в природе. Однако между двумя слитыми BioBricks будет также образовываться «рубцовая» последовательность (TACTAG или TACTAGAG). Это предотвращает использование BioBricks для создания слитых белков, поскольку последовательность рубца длиной 6 пар оснований кодирует тирозин и стоп-кодон, что приводит к прекращению трансляции после экспрессии первого домена, в то время как последовательность рубца длиной 8 пар оснований вызывает сдвиг рамки считывания , предотвращая непрерывное считывание кодоны. Чтобы предложить альтернативные рубцовые последовательности, которые, например, дают рубец в 6 пар оснований, или последовательности рубцов, которые не содержат стоп-кодоны, были разработаны другие стандарты сборки, такие как BB-2 Assembly, BglBricks Assembly, Silver Assembly и Freiburg Assembly. [25] [26] [27] [28]

Хотя самый простой метод сборки деталей BioBrick описан выше, существует также несколько других широко используемых методов сборки, которые предлагают несколько преимуществ по сравнению со стандартной сборкой. Сборка из 3 антибиотиков (3A) позволяет выбрать правильную сборку посредством выбора антибиотика, в то время как сборка с амплифицированной вставкой стремится преодолеть низкую эффективность трансформации, наблюдаемую в сборке 3A. [29] [30]

Стандарт сборки BioBrick также послужил вдохновением для использования других типов эндонуклеаз для сборки ДНК. Например, как стандарт iBrick, так и стандарты сборки вектора HomeRun используют самонаводящиеся эндонуклеазы вместо рестрикционных ферментов типа II. [31] [32]

Сборка эндонуклеаз рестрикции типа II [ править ]

Некоторые методы сборки также используют эндонуклеазы рестрикции типа II. Они отличаются от других эндонуклеаз типа II, поскольку они отрезают несколько пар оснований от сайта узнавания. В результате последовательность выступа может быть изменена, чтобы содержать желаемую последовательность. Это обеспечивает методы сборки Типа II с двумя преимуществами: он обеспечивает сборку без образования рубцов и позволяет производить сборку из нескольких частей в одной ванне. Способы сборки, в которых используются эндонуклеазы типа II, включают Golden Gate и связанные с ним варианты.

Клонирование Golden Gate [ править ]
Основная статья: Клонирование Золотых Ворот
Последовательность частей ДНК для сборки Golden Gate можно регулировать путем определения уникальных дополнительных выступов для каждой части. Таким образом, для сборки гена 1 в порядке фрагментов A, B и C 3'-выступ для фрагмента A комплементарен 5'-выступу для фрагмента B, и аналогично для фрагмента B и фрагмента C. Для целевой плазмиды выбираемый Маркер фланкирован направленными наружу сайтами рестрикции BsaI. Это иссекает селектируемый маркер, позволяя вставить окончательную конструкцию. Т4-лигаза используется для лигирования фрагментов вместе и с целевой плазмидой.

Протокол сборки Golden Gate был определен Engler et al. 2008, чтобы определить метод сборки ДНК, который дал бы окончательную конструкцию без рубцовой последовательности, а также без исходных сайтов рестрикции. Это позволяет экспрессировать белок без содержания нежелательных белковых последовательностей, которые могут отрицательно влиять на укладку или экспрессию белка. При использовании рестрикционного фермента BsaI, который производит выступ из 4 пар оснований, для сборки можно использовать до 240 уникальных непалиндромных последовательностей. [33]

Дизайн и сборка плазмид

При клонировании Golden Gate каждый собираемый фрагмент ДНК помещают в плазмиду, фланкируемую обращенными внутрь сайтами рестрикции BsaI, содержащими запрограммированные выступающие последовательности. Для каждого фрагмента ДНК 3'-выступающая последовательность комплементарна 5'-выступающей части следующего нижестоящего фрагмента ДНК. Для первого фрагмента 5'-выступ комплементарен 5'-выступу целевой плазмиды, в то время как 3'-выступ последнего фрагмента комплементарен 3'-выступу целевой плазмиды. Такая конструкция позволяет собрать все фрагменты ДНК в реакции в одном сосуде (где все реагенты смешиваются вместе), при этом все фрагменты расположены в правильной последовательности.Успешно собранные конструкции отбирают путем обнаружения потери функции кассеты для скрининга, которая изначально находилась в целевой плазмиде.[33]

MoClo и золотая коса

Исходная сборка Golden Gate позволяет создать только одну конструкцию в векторе назначения. Чтобы позволить использовать эту конструкцию в последующей реакции в качестве вектора входа, были разработаны стандарты MoClo и Golden Braid. [34]

Стандарт MoClo включает определение нескольких уровней сборки ДНК:

  • Стандарт сборки Golden Braid также основан на первом уровне сборки Golden Gate и собирает последующие уровни с помощью попарного протокола. Четыре вектора назначения уровня 1 (собранные с помощью сборки Golden Gate) собираются в два вектора назначения уровня 2, которые затем используются в качестве векторов входа уровня 3 для вектора назначения уровня 3. Используются чередующиеся рестрикционные ферменты (BpiI для уровня 2 и BsaI для уровня 3).
    Стандарты сборки MoClo и Golden Braid являются производными от исходного стандарта сборки Golden Gate.
    Уровень 1: Сборка уровня 1 является стандартной сборкой Golden Gate, и гены собираются из их составных частей (частей ДНК, кодирующих генетические элементы, такие как UTR , промоторы, сайты связывания рибосом или терминаторные последовательности). По бокам от сайта вставки векторов-мишеней уровня 1 находится пара сайтов рестрикции BpiI, разрезанных внутрь. Это позволяет использовать эти плазмиды в качестве векторов входа для векторов назначения второго уровня.
  • Уровень 2: Сборка уровня 2 включает дальнейшую сборку генов, собранных в сборке уровня 1, в мультигенные конструкции. Если есть необходимость в дальнейшей сборке более высокого уровня, можно добавить сайты рестрикции BsaI с внутренним разрезом, чтобы фланкировать сайты вставки. Эти векторы затем можно использовать как векторы входа для конструкций более высокого уровня.

Каждый уровень сборки чередует использование сайтов рестрикции BsaI и BpiI, чтобы минимизировать количество запрещенных сайтов, а последовательная сборка для каждого уровня достигается с помощью дизайна плазмиды Golden Gate. В целом, стандарт MoClo позволяет собрать конструкцию, содержащую несколько единиц транскрипции, все из которых собраны из разных частей ДНК, с помощью серии реакций Golden Gate в одном сосуде. Однако одним из недостатков стандарта MoClo является то, что он требует использования «фиктивных частей» без биологической функции, если для окончательной конструкции требуется менее четырех составных частей. [35] Стандарт Golden Braid, с другой стороны, ввел попарный стандарт сборки Golden Gate.

Стандарт Golden Braid использует ту же многоуровневую сборку, что и MoClo, но каждый уровень включает сборку только двух фрагментов ДНК, то есть попарный подход. Следовательно, на каждом уровне пары генов клонируются в целевой фрагмент в желаемой последовательности, а затем они собираются по два за раз в последовательных уровнях. Как и MoClo, стандарт Golden Braid чередует рестрикционные ферменты BsaI и BpiI на каждом уровне.

Развитие методов сборки Golden Gate и его вариантов позволило исследователям разработать наборы инструментов для ускорения рабочего процесса синтетической биологии. Например, EcoFlex был разработан как набор инструментов для E. Coli, который использует стандарт MoClo для своих частей ДНК, в то время как аналогичный набор инструментов был также разработан для создания микроводорослей Chlamydomonas reinhardtii . [36] [37]

Рекомбинация для конкретного сайта [ править ]

Основная статья: Технология шлюза
Входные векторы Gateway Cloning должны быть сначала получены с использованием синтезированного фрагмента ДНК, содержащего требуемые сайты attB. Рекомбинация с донорным вектором катализируется смесью клоназ ВР и дает желаемый вектор входа с сайтами attL.
Желаемая конструкция получается путем рекомбинации вектора входа с вектором назначения. В этом случае окончательная конструкция включает сборку двух представляющих интерес фрагментов ДНК. Сайты attL в векторе входа рекомбинируют с сайтами attR в векторе назначения. Летальный ген ccdB теряется из вектора назначения, и любые бактерии, которые поглощают нежелательный вектор, погибают, что позволяет выбрать желаемый вектор.
Обнаружение специфических ортогональных сайтов att (т.е. каждый ортогональный attL реагирует только со своим партнером attR) позволило разработать технологию клонирования многоузлового шлюза. Это позволяет собирать несколько фрагментов ДНК с порядком сборки, определяемым сайтами att.
Краткое изложение основных технологий клонирования шлюзов.

В сайт-специфической рекомбинации используются фаговые интегразы вместо рестрикционных ферментов, что устраняет необходимость наличия сайтов рестрикции во фрагментах ДНК. Вместо этого интегразы используют уникальные сайты присоединения (att) и катализируют перестройку ДНК между целевым фрагментом и вектором-получателем. Система клонирования Invitrogen Gateway была изобретена в конце 1990-х годов и использует две запатентованные смеси ферментов: клоназу BP и клоназу LR. Смесь клоназ BP катализирует рекомбинацию между сайтами attB и attP, генерируя гибридные сайты attL и attR, в то время как смесь клоназ LR катализирует рекомбинацию сайтов attL и attR с образованием сайтов attB и attP. Поскольку каждая смесь ферментов распознает только определенные сайты att, рекомбинация высокоспецифична, и фрагменты могут быть собраны в желаемой последовательности.[38]

Векторный дизайн и сборка

Поскольку клонирование шлюза является запатентованной технологией, все реакции шлюза должны выполняться с помощью комплекта шлюза, предоставляемого производителем. Реакцию можно разделить на две стадии. Первый этап включает сборку входных клонов, содержащих интересующий фрагмент ДНК, а второй этап включает вставку этого интересующего фрагмента в целевой клон.

  1. Входные клоны должны быть получены с использованием поставляемых «донорных» векторов, содержащих кассету Gateway, фланкированную сайтами attP. Кассета Gateway содержит бактериальный суицидный ген (например, ccdB ), который обеспечивает выживание и селекцию успешно рекомбинированных исходных клонов. Пара сайтов attB добавляется для фланкирования интересующего фрагмента ДНК, и это позволит рекомбинировать с сайтами attP при добавлении смеси клоназ ВР. Получают входные клоны, и интересующий фрагмент фланкируется сайтами attL.
  2. Вектор назначения также поставляется с кассетой шлюза, но вместо этого он окружен парой сайтов attR. Смешивание этой целевой плазмиды с входными клонами и смесью LR-клоназ позволит рекомбинации между сайтами attR и attL. Создается целевой клон с успешно вставленным интересующим фрагментом. Летальный ген вставляется в исходный вектор, и бактерии, трансформированные этой плазмидой, погибнут. Таким образом, можно легко выбрать желаемый вектор.

Самые ранние итерации метода клонирования шлюза позволяли использовать только один клон записи для каждого созданного клона назначения. Однако дальнейшие исследования показали, что могут быть сгенерированы еще четыре ортогональные последовательности att, позволяющие собрать до четырех различных фрагментов ДНК, и этот процесс теперь известен как технология Multisite Gateway. [39]

Помимо клонирования шлюза, были также разработаны некоммерческие методы с использованием других интеграций. Например, в методе рекомбинационной сборки сериновой интегразы (SIRA) используется интеграза ϕC31, а в методе тандемной сборки на основе сайт-специфической рекомбинации (SSRTA) используется интеграза фага Streptomyces φBT1. [40] [41] Другие методы, такие как система сборки вектора HomeRun (HVAS), основаны на системе клонирования Gateway и дополнительно включают эндоуклазы самонаведения для разработки протокола, который потенциально может поддерживать промышленный синтез синтетических конструкций ДНК. [31]

Способы сборки, основанные на длинном перекрытии, требуют наличия длинных перекрывающихся областей на частях ДНК, которые должны быть собраны. Это позволяет создавать дополнительные выступы, которые могут отжигаться посредством комплементарного спаривания оснований. Существует множество методов, например сборка Гибсона, CPEC, MODAL, которые используют эту концепцию для сборки ДНК.

Сборка с длинным перекрытием [ править ]

В последние годы было разработано множество методов сборки с длинным перекрытием. Один из наиболее часто используемых методов, метод сборки Гибсона, был разработан в 2009 году и обеспечивает метод сборки ДНК в одном горшке, который не требует использования рестрикционных ферментов или интеграз. [42] Другие аналогичные методы сборки на основе перекрытия включают клонирование с расширением круговой полимеразы (CPEC), независимое от последовательностей и лигаз клонирование (SLIC) и экстракт клонирования с бесшовным лигированием (SLiCE). [43] [44] [45] Несмотря на наличие многих методов сборки с перекрытием, метод сборки Гибсона по-прежнему остается наиболее популярным. [46]Помимо методов, перечисленных выше, другие исследователи основывались на концепциях, используемых в сборке Гибсона и других методах сборки, для разработки новых стратегий сборки, таких как модульная сборка, направленная на перекрытие, с линкерами (MODAL) или стандарт сборки Biopart для идемпотентного клонирования (BASIC). ) метод. [47] [48]

Сборка Гибсона [ править ]

Основная статья: сборка Гибсона

Метод сборки Гибсона представляет собой относительно простой метод сборки ДНК, требующий всего лишь нескольких дополнительных реагентов: 5'- экзонуклеазы Т5 , ДНК-полимеразы Phusion и ДНК-лигазы Taq . Фрагменты ДНК, которые должны быть собраны, синтезируются так, чтобы иметь перекрывающиеся 5 'и 3' концы в том порядке, в котором они должны быть собраны. Эти реагенты смешиваются вместе с фрагментами ДНК, которые необходимо собрать, при 50 ° C, и происходят следующие реакции:

  1. Экзонуклеаза Т5 отщепляет ДНК с 5'-конца каждого фрагмента, обнажая 3'-выступающие части на каждом фрагменте ДНК.
  2. Комплементарные выступы на соседних фрагментах ДНК отжигаются посредством комплементарного спаривания оснований.
  3. ДНК-полимераза Phusion заполняет все пробелы в местах отжига фрагментов.
  4. ДНК-лигаза Taq восстанавливает порезы на обеих цепях ДНК.

Поскольку экзонуклеаза Т5 термолабильна, она инактивируется при 50 ° C после первого жевания. Таким образом, продукт стабилен, а фрагменты собраны в желаемом порядке. Этот протокол с одним горшком может точно собрать до 5 различных фрагментов, в то время как несколько коммерческих поставщиков имеют наборы для точной сборки до 15 различных фрагментов в двухэтапной реакции. [49] Однако, хотя протокол сборки Гибсона является быстрым и использует относительно мало реагентов, он требует индивидуального синтеза ДНК, поскольку каждый фрагмент должен быть сконструирован так, чтобы содержать перекрывающиеся последовательности с соседними фрагментами и амплифицировать с помощью ПЦР. Эта зависимость от ПЦР может также повлиять на точность реакции при использовании длинных фрагментов, фрагментов с высоким содержанием GC или повторяющихся последовательностей. [48]

Стандарт MODAL предоставляет общий формат, позволяющий сделать любую часть ДНК совместимой со сборкой Гибсона или другими методами сборки с перекрытием. Интересующий фрагмент ДНК проходит два раунда ПЦР, сначала для присоединения префикса адаптера и суффиксов, а затем для присоединения предопределенных линкерных последовательностей. После того, как детали имеют требуемый формат, можно использовать такие методы сборки, как сборка Гибсона. Порядок частей определяется линкерами, т. Е. Одна и та же линкерная последовательность присоединяется к 3'-концу восходящей части и 5'-концу нижестоящей части.

МОДАЛЬНЫЙ [ править ]

Стратегия MODAL определяет перекрывающиеся последовательности, известные как «линкеры», чтобы уменьшить количество настроек, которые необходимо выполнить с каждым фрагментом ДНК. Линкеры были разработаны с использованием R2oDNA Designer.программное обеспечение и области перекрытия были разработаны так, чтобы иметь длину 45 п.н., чтобы быть совместимыми с сборкой Гибсона и другими методами сборки с перекрытием. Чтобы прикрепить эти линкеры к собираемым частям, проводят ПЦР с использованием специфичных для частей праймеров, содержащих последовательности префикса 15 п.н. и адаптера суффикса. Затем линкеры присоединяются к последовательностям адаптера посредством второй реакции ПЦР. Чтобы расположить фрагменты ДНК, один и тот же линкер будет присоединен к суффиксу желаемого восходящего фрагмента и к префиксу желаемых нисходящих фрагментов. После присоединения линкеров сборка Гибсона, CPEC или другие способы сборки с перекрытием могут быть использованы для сборки фрагментов ДНК в желаемом порядке.

BASIC [ править ]

Стратегия сборки BASIC была разработана в 2015 году и направлена ​​на устранение ограничений предыдущих методов сборки, включая шесть ключевых концепций из них: стандартные детали многократного использования; одноуровневый формат (все детали одного формата и собираются по одному и тому же процессу); идемпотентное клонирование; параллельная (составная) сборка ДНК; независимость от размера; автоматичность. [48]

Части ДНК и дизайн линкера

Части ДНК конструируются и клонируются в запасные плазмиды, при этом часть фланкируется интегрированным префиксом ( i P) и интегрированным суффиксом ( i S). Последовательности i P и i S содержат обращенные внутрь сайты рестрикции BsaI, которые содержат выступы, комплементарные линкерам BASIC. [48]Как и в MODAL, 7 стандартных линкеров, используемых в BASIC, были разработаны с помощью программного обеспечения R2oDNA Designer и проверены, чтобы убедиться, что они не содержат последовательностей, гомологичных геномам шасси, и что они не содержат нежелательных последовательностей, таких как последовательности вторичной структуры, сайты рестрикции. или сайты связывания рибосом. Каждая линкерная последовательность разделяется на две половины, каждая с выступом из 4 пар оснований, комплементарным сайту рестрикции BsaI, двухцепочечной последовательностью 12 пар оснований и разделяющей перекрывающуюся последовательность 21 пар оснований с другой половиной. Половина, которая будет связываться с вышестоящей частью ДНК, известна как часть суффиксного линкера (например, L1S), а половина, которая связывается с нижней частью, известна как часть префиксного линкера (например, L1P). Эти линкеры составляют основу сборки частей ДНК вместе.

Помимо управления порядком сборки, стандартные линкеры BASIC также могут быть изменены для выполнения других функций. Для обеспечения идемпотентной сборки линкеры были также сконструированы с дополнительными метилированными последовательностями i P и i S, встроенными для защиты их от распознавания BsaI. Это метилирование теряется после трансформации и репликации плазмиды in vivo, и плазмиды можно экстрагировать, очищать и использовать для дальнейших реакций.

Поскольку линкерные последовательности относительно длинные (45 п.н. для стандартного линкера), есть возможность включить функциональные последовательности ДНК для уменьшения количества частей ДНК, необходимых во время сборки. Стандарт сборки BASIC предоставляет несколько линкеров, встроенных в RBS разной силы. Подобно тому, чтобы облегчить конструирование слитых белков, содержащих несколько белковых доменов, было также сконструировано несколько слитых линкеров, чтобы обеспечить полное считывание конструкции ДНК. Эти слитые линкеры кодируют полипептид глицина и серина из 15 аминокислот, который является идеальным линкерным пептидом для слитых белков с несколькими доменами.

Части ДНК, которые будут использоваться для сборки BASIC, должны содержать интегрированные префиксные и суффиксные последовательности (iP и iS). Они содержат сайты рестрикции BsaI, которые позволят линкерам iP и iS (которые содержат комплементарные выступающие последовательности) прикрепляться к части ДНК. Как только линкеры прикреплены, деталь готова к сборке.
Последовательность сборки определяется расположением линкеров. Суффиксный линкер лигируется с 3'-концом нижележащего фрагмента, в то время как префиксный линкер лигируется с 5'-концом нижележащего фрагмента. Здесь показан пример сборочной конструкции BASIC с использованием четырех частей ДНК.

сборка

Сборка окончательной конструкции состоит из трех основных этапов.

  1. Сначала части ДНК вырезаются из запасающей плазмиды, давая фрагмент ДНК с выступами BsaI на 3 'и 5' концах.
  2. Затем каждая линкерная часть присоединяется к соответствующей части ДНК путем инкубации с ДНК-лигазой Т4. Каждая часть ДНК будет иметь суффикс и префикс линкерной части из двух разных линкеров, чтобы определять порядок сборки. Например, первая часть последовательности будет иметь L1P и L2S, а вторая часть будет иметь присоединенные L2P и L3S. Детали компоновщика можно изменить, чтобы изменить последовательность сборки.
  3. Наконец, части с прикрепленными линкерами собирают в плазмиду путем инкубации при 50 ° C. Выступающие части линкеров P и S размером 21 п.н. отжигаются, и конечная конструкция может быть трансформирована в клетки бактерий для клонирования. Одноцепочечные разрывы репарируют in vivo после трансформации, получая стабильную конечную конструкцию, клонированную в плазмиды.

Приложения [ править ]

Поскольку методы печати ДНК и сборки ДНК позволили коммерческому синтезу генов становиться все более и более дешевым за последние годы [50], искусственный синтез генов представляет собой мощный и гибкий инженерный инструмент для создания и конструирования новых последовательностей ДНК и функций белков. Помимо синтетической биологии, различные области исследований, например, связанные с экспрессией гетерологичных генов , разработкой вакцин , генной терапией и молекулярной инженерией, значительно выиграют от наличия быстрых и дешевых методов синтеза ДНК для кодирования белков и пептидов. [51] Методы, используемые для печати и сборки ДНК, даже позволили использовать ДНК в качестве носителя информации .

Синтез бактериальных геномов [ править ]

Лаборатория Synthia и Mycoplasma [ править ]

Основная статья: Лаборатория микоплазм

28 июня 2007 года команда из Института Дж. Крейга Вентера опубликовала статью в Science Express , в которой говорилось, что они успешно трансплантировали природную ДНК из бактерии Mycoplasma mycoides в клетку Mycoplasma capricolum , создав бактерию, которая вела себя как M. . mycoides . [52]

6 окт 2007, Крейг Вентер объявил в интервью британской The Guardian газете , что та же самая команда синтезировали модифицированную версию одной хромосомы из Mycoplasma гениталий искусственно. Хромосома была изменена, чтобы удалить все гены, в которых тесты на живых бактериях показали ненужность. Следующим запланированным шагом в этом проекте минимального генома является трансплантация синтезированного минимального генома в бактериальную клетку с удалением ее старой ДНК; полученная бактерия будет называться Mycoplasma lab . На следующий день канадская группа по биоэтике , ETC Group, выступила с заявлением через своего представителя:Пэт Муни , говоря, что «творение Вентера» было «шасси, на котором можно построить почти все». Синтезированный геном еще не был пересажен в рабочую клетку. [53]

21 мая 2010 г. Science сообщила, что группа Вентера успешно синтезировала геном бактерии Mycoplasma mycoides из компьютерной записи и трансплантировала синтезированный геном в существующую клетку бактерии Mycoplasma capricolum, у которой была удалена ДНК. «Синтетическая» бактерия была жизнеспособной, т. Е. Способной воспроизводиться миллиарды раз. Изначально команда планировала использовать бактерию M. genitalium, с которой они ранее работали, но перешла на M. mycoides, потому что последняя бактерия растет намного быстрее, что привело к более быстрым экспериментам. [54] Вентер описывает его как «первый вид… родителями которого были компьютеры».[55] Трансформированная бактерия получила название " Synthia " ETC. Представитель Venter отказался подтвердить какие-либо достижения на момент написания этой статьи.

Синтетические дрожжи 2.0 [ править ]

В рамках проекта Synthetic Yeast 2.0 различные исследовательские группы по всему миру приняли участие в проекте по синтезу синтетических геномов дрожжей и, с помощью этого процесса, оптимизации генома модельного организма Saccharomyces cerevisae . [56] В проекте Yeast 2.0 использовались различные методы сборки ДНК, которые обсуждались выше, и в марте 2014 года Джеф Бёке из Медицинского центра Лангоне при Нью-Йоркском университете сообщил, что его команда синтезировала хромосому III S. cerevisae . [57] [58]Процедура включала замену генов в исходной хромосоме синтетическими версиями, а готовая синтетическая хромосома затем была интегрирована в дрожжевую клетку. Это потребовало разработки и создания 273 871 пары оснований ДНК - меньше, чем 316 667 пар в исходной хромосоме. В марте 2017 года синтез 6 из 16 хромосом был завершен, а синтез остальных все еще продолжается. [59]

См. Также [ править ]

  • Секвенирование ДНК
  • Генетическая модификация
  • Белковая инженерия
  • База данных синтетических генов

Примечания [ править ]

  1. ↑ Stein R (7 мая 2015 г.). «ДНК 'печать' - большой подарок для исследований, но некоторые вызывают опасения» . Все учтено . Национальное общественное радио.
  2. ^ а б Хорана Х.Г., Агарвал К.Л., Бючи Х., Карутерс М.Х., Гупта Н.К., Клеппе К. и др. (Декабрь 1972 г.). «Исследования полинуклеотидов. 103. Полный синтез структурного гена рибонуклеиновой кислоты переноса аланина из дрожжей». Журнал молекулярной биологии . 72 (2): 209–17. DOI : 10.1016 / 0022-2836 (72) 90146-5 . PMID 4571075 . 
  3. ^ a b Итакура К., Хиросе Т., Креа Р., Риггс А.Д., Хейнекер Х.Л., Боливар Ф., Бойер Х.В. (декабрь 1977 г.). «Экспрессия в Escherichia coli химически синтезированного гена гормона соматостатина». Наука . 198 (4321): 1056–63. Bibcode : 1977Sci ... 198.1056I . DOI : 10.1126 / science.412251 . PMID 412251 . 
  4. ^ a b Edge MD, Green AR, Heathcliffe GR, Meacock PA, Schuch W, Scanlon DB и др. (Август 1981 г.). «Полный синтез гена интерферона лейкоцитов человека». Природа . 292 (5825): 756–62. Bibcode : 1981Natur.292..756E . DOI : 10.1038 / 292756a0 . PMID 6167861 . S2CID 4330168 .  
  5. ^ Shukman D (2014-03-27). «Развитие синтетической ДНК приветствуется» . BBC News . Проверено 11 апреля 2020 .
  6. ^ Kimoto M, Yamashige R, Матсунага К Yokoyama S, Hirao I (май 2013). «Генерация высокоаффинных ДНК-аптамеров с использованием расширенного генетического алфавита». Природа Биотехнологии . 31 (5): 453–7. DOI : 10.1038 / nbt.2556 . PMID 23563318 . S2CID 23329867 .  
  7. ^ Малышев Д.А., Дхами К., Quach HT, Лавернь Т., Ордуханян П., Торкамани А., Ромесберг FE (июль 2012 г.). «Эффективная и независимая от последовательности репликация ДНК, содержащей третью пару оснований, устанавливает функциональный шестибуквенный генетический алфавит» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 109 (30): 12005–10. Bibcode : 2012PNAS..10912005M . DOI : 10.1073 / pnas.1205176109 . PMC 3409741 . PMID 22773812 .  
  8. ^ Малышев Д.А., Дхами К., Лавергн Т., Чен Т., Дай Н., Фостер Дж. М. и др. (Май 2014 г.). «Полусинтетический организм с расширенным генетическим алфавитом» . Природа . 509 (7500): 385–8. Bibcode : 2014Natur.509..385M . DOI : 10,1038 / природа13314 . PMC 4058825 . PMID 24805238 .  
  9. ^ a b Fuhrmann M, Oertel W, Hegemann P (август 1999). «Синтетический ген, кодирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP), является универсальным репортером Chlamydomonas reinhardtii». Заводской журнал . 19 (3): 353–61. DOI : 10.1046 / j.1365-313X.1999.00526.x . PMID 10476082 . 
  10. ^ Mandecki W, Bolling TJ (август 1988). «ФокИ метод генного синтеза». Джин . 68 (1): 101–7. DOI : 10.1016 / 0378-1119 (88) 90603-8 . PMID 3265397 . 
  11. ^ Штеммер WP, Crameri A, Ha KD, Бреннан TM, Heyneker HL (октябрь 1995). «Одностадийная сборка гена и всей плазмиды из большого количества олигодезоксирибонуклеотидов». Джин . 164 (1): 49–53. DOI : 10.1016 / 0378-1119 (95) 00511-4 . PMID 7590320 . 
  12. Перейти ↑ Gao X, Yo P, Keith A, Ragan TJ, Harris TK (ноябрь 2003 г.). «Термодинамически сбалансированный синтез генов на основе ПЦР наизнанку (TBIO): новый метод конструирования праймеров для точной сборки более длинных последовательностей генов» . Исследования нуклеиновых кислот . 31 (22): 143e – 143. DOI : 10.1093 / NAR / gng143 . PMC 275580 . PMID 14602936 .  
  13. ↑ Young L, Dong Q (апрель 2004 г.). «Двухэтапный метод тотального синтеза генов» . Исследования нуклеиновых кислот . 32 (7): e59. DOI : 10.1093 / NAR / gnh058 . PMC 407838 . PMID 15087491 .  
  14. ^ Хиллсон NJ, Rosengarten RD, Кислинг JD (январь 2012). «Программное обеспечение для автоматизации проектирования сборки j5 DNA» . Синтетическая биология ACS . 1 (1): 14–21. DOI : 10.1021 / sb2000116 . PMID 23651006 . 
  15. ^ Hoover DM, Lubkowski J (май 2002). «DNAWorks: автоматизированный метод конструирования олигонуклеотидов для синтеза генов на основе ПЦР» . Исследования нуклеиновых кислот . 30 (10): 43e – 43. DOI : 10.1093 / NAR / 30.10.e43 . PMC 115297 . PMID 12000848 .  
  16. ↑ Villalobos A, Ness JE, Gustafsson C, Minshull J, Govindarajan S (июнь 2006 г.). «Конструктор генов: инструмент синтетической биологии для создания искусственных сегментов ДНК» . BMC Bioinformatics . 7 : 285. DOI : 10,1186 / 1471-2105-7-285 . PMC 1523223 . PMID 16756672 .  
  17. ^ Тянь Дж, Гонг Х, Шэн Н, Чжоу X, Гулари Э, Гао X, Церковь G (декабрь 2004 г.). «Точный мультиплексный синтез генов из программируемых микрочипов ДНК» (PDF) . Природа . 432 (7020): 1050–4. Bibcode : 2004Natur.432.1050T . DOI : 10,1038 / природа03151 . ЛВП : 2027,42 / 62677 . PMID 15616567 . S2CID 4373350 .   
  18. ^ Matzas M, Stähler PF, Kefer N, Siebelt N, Boisguérin V, Leonard JT и др. (Декабрь 2010 г.). «Синтез генов высокой точности путем извлечения ДНК с подтвержденной последовательностью, идентифицированной с помощью высокопроизводительного пиросеквенирования» . Природа Биотехнологии . 28 (12): 1291–4. DOI : 10.1038 / nbt.1710 . PMC 3579223 . PMID 21113166 .  
  19. ^ Schwartz JJ, Ли C, Shendure J (сентябрь 2012). «Точный синтез генов с направленным на метку извлечением молекул ДНК с подтвержденной последовательностью» . Природные методы . 9 (9): 913–5. DOI : 10.1038 / nmeth.2137 . PMC 3433648 . PMID 22886093 .  
  20. ^ Weidman C (2017-12-06). «Расширяя генетический алфавит» . Блог . Гарвардский университет . Проверено 17 апреля 2020 .
  21. ^ «Справка: синтетическая биология - parts.igem.org» . parts.igem.org . Проверено 11 апреля 2020 .
  22. ^ a b c Casini A, Сторч М., Болдуин Г.С., Эллис Т. (сентябрь 2015 г.). «Кубики и чертежи: методы и стандарты сборки ДНК» . Обзоры природы. Молекулярная клеточная биология . 16 (9): 568–76. DOI : 10.1038 / nrm4014 . ЛВП : 10044/1/31281 . PMID 26081612 . S2CID 3502437 .  
  23. Перейти ↑ Knight T (2003). «Идемпотентный векторный дизайн для стандартной сборки биокирпичей». ЛВП : 1721,1 / 21168 . Цитировать журнал требует |journal=( помощь )
  24. ^ Рокк G, Korvald Е, Pahr Дж, Oyås О, Лале R (2014). «Стандарты и методы сборки BioBrick и соответствующие программные инструменты». В Valla S, Lale R (ред.). Способы клонирования и сборки ДНК . Методы молекулярной биологии. 1116 . Клифтон, Нью-Джерси, стр. 1-24. DOI : 10.1007 / 978-1-62703-764-8_1 . ISBN 978-1-62703-763-1. PMID  24395353 .
  25. ↑ Knight T (19 ноября 2008 г.). «Проект стандарта на биологические части биокирпича BB-2». ЛВП : 1721,1 / 45139 . Цитировать журнал требует |journal=( помощь )
  26. ^ Андерсон JC, Dueber JE, Leguía М, У GC, Goler JA, Аркин А.П., Кислинг JD (январь 2010). «BglBricks: гибкий стандарт для сборки биологических деталей» . Журнал биологической инженерии . 4 (1): 1. DOI : 10,1186 / 1754-1611-4-1 . PMC 2822740 . PMID 20205762 .  
  27. Перейти ↑ Phillips I, Silver P (2006-04-20). «Новая стратегия сборки биокирпича, разработанная для легкой инженерии белков». ЛВП : 1721,1 / 32535 . Цитировать журнал требует |journal=( помощь )
  28. ^ Грюнберг Р., Арндт К., Мюллер К. (2009-04-18). «Стандарт сборки биокирпича Fusion Protein (Фрайбург)». ЛВП : 1721,1 / 45140 . Цитировать журнал требует |journal=( помощь )
  29. ^ Шетти R, Lizarazo M, Rettberg R, Knight TF (2011). «Сборка стандартных биологических частей BioBrick с использованием трех антибиотиков». Методы в энзимологии . 498 : 311–26. DOI : 10.1016 / B978-0-12-385120-8.00013-9 . ЛВП : 1721,1 / 65066 . ISBN 9780123851208. PMID  21601683 .
  30. ↑ Speer MA, Ричард TL (декабрь 2011 г.). «Усиленная сборка вставок: оптимизированный подход к стандартной сборке генетических схем BioBrickTM» . Журнал биологической инженерии . 5 (1): 17. DOI : 10,1186 / 1754-1611-5-17 . PMC 3287150 . PMID 22176971 .  
  31. ^ a b Ли М.В., Шукла Д., Родос Б.Х., Лалл А., Шу Дж., Мориарити Б.С., Ларгаэспада Д.А. (24.06.2014). «Система сборки вектора HomeRun: гибкая и стандартизированная система клонирования для сборки многомодульных конструкций ДНК» . PLOS ONE . 9 (6): e100948. Bibcode : 2014PLoSO ... 9j0948L . DOI : 10.1371 / journal.pone.0100948 . PMC 4069157 . PMID 24959875 .  
  32. ^ Лю JK, Чен WH, Рен SX, Zhao GP, Ван Дж (2014-10-20). «iBrick: новый стандарт итеративной сборки биологических частей с самонаводящимися эндонуклеазами» . PLOS ONE . 9 (10): e110852. Bibcode : 2014PLoSO ... 9k0852L . DOI : 10.1371 / journal.pone.0110852 . PMC 4203835 . PMID 25329380 .  
  33. ^ а б Энглер C, Кандзия R, Marillonnet S (2008-11-05). «Одноразовый, одноэтапный прецизионный метод клонирования с высокой производительностью» . PLOS ONE . 3 (11): e3647. Bibcode : 2008PLoSO ... 3.3647E . DOI : 10.1371 / journal.pone.0003647 . PMC 2574415 . PMID 18985154 .  
  34. ^ Weber E, Энглер C, Gruetzner R, S Вернер, Marillonnet S (февраль 2011). «Модульная система клонирования для стандартизированной сборки мультигенных конструкций» . PLOS ONE . 6 (2): e16765. Bibcode : 2011PLoSO ... 616765W . DOI : 10.1371 / journal.pone.0016765 . PMC 3041749 . PMID 21364738 .  
  35. ^ Клейн СА, Эмд л, Куиджперс А, Sobetzko Р (2019-10-17). «MoCloFlex: модульная, но гибкая система клонирования» . Границы биоинженерии и биотехнологии . 7 : 271. DOI : 10.3389 / fbioe.2019.00271 . PMC 6843054 . PMID 31750294 .  
  36. ^ Мур SJ, Lai HE, Kelwick RJ, Chee SM, Bell DJ, Polizzi KM, Freemont PS (октябрь 2016 г.). «EcoFlex: Многофункциональный набор MoClo для синтетической биологии E. coli» . Синтетическая биология ACS . 5 (10): 1059–1069. DOI : 10.1021 / acssynbio.6b00031 . PMID 27096716 . 
  37. ^ Крозэ Р, Наварро FJ, Willmund Р, Р Mehrshahi, Bakowski К, Lauersen KJ, и др. (Сентябрь 2018 г.). «Рождение фотосинтетического каркаса: набор инструментов MoClo, позволяющий использовать синтетическую биологию в микроводорослях Chlamydomonas reinhardtii». Синтетическая биология ACS . 7 (9): 2074–2086. DOI : 10.1021 / acssynbio.8b00251 . PMID 30165733 . 
  38. ^ Риис-Hoyes JS, Walhout AJ (январь 2018). "Gateway Рекомбинационное клонирование" . Протоколы Колд-Спринг-Харбор . 2018 (1): pdb.top094912. DOI : 10,1101 / pdb.top094912 . PMC 5935001 . PMID 29295908 .  
  39. ^ Sasaki Y, Sone T, Yoshida S, Yahata K, Hotta J, Chesnut JD и др. (Февраль 2004 г.). «Доказательства высокой специфичности и эффективности множественных сигналов рекомбинации в смешанном клонировании ДНК с помощью системы Multisite Gateway» . Журнал биотехнологии . 107 (3): 233–43. DOI : 10.1016 / j.jbiotec.2003.10.001 . PMID 14736459 . 
  40. ^ Colloms SD, Меррик CA, Olorunniji FJ, Старк WM, Smith MC, Osbourn A, и др. (Февраль 2014). «Быстрая сборка и модификация метаболических путей с использованием сайт-специфической рекомбинации серин-интегразы» . Исследования нуклеиновых кислот . 42 (4): e23. DOI : 10.1093 / NAR / gkt1101 . PMC 3936721 . PMID 24225316 .  
  41. ↑ Zhang L, Zhao G, Ding X (03.11.2011). «Тандемная сборка кластера биосинтетических генов эпотилона путем сайт-специфической рекомбинации in vitro» . Научные отчеты . 1 (1): 141. Bibcode : 2011NatSR ... 1E.141Z . DOI : 10.1038 / srep00141 . PMC 3216622 . PMID 22355658 .  
  42. Перейти ↑ Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO (май 2009 г.). «Ферментативная сборка молекул ДНК до нескольких сотен килобаз» . Природные методы . 6 (5): 343–5. DOI : 10.1038 / nmeth.1318 . PMID 19363495 . S2CID 1351008 .  
  43. ↑ Quan J, Tian J (июль 2009 г.). «Клонирование с расширением круговой полимеразы сложных библиотек генов и путей» . PLOS ONE . 4 (7): e6441. Bibcode : 2009PLoSO ... 4.6441Q . DOI : 10.1371 / journal.pone.0006441 . PMC 2713398 . PMID 19649325 .  
  44. ↑ Li MZ, Elledge SJ (март 2007 г.). «Использование гомологичной рекомбинации in vitro для создания рекомбинантной ДНК с помощью SLIC» . Природные методы . 4 (3): 251–6. DOI : 10.1038 / nmeth1010 . PMID 17293868 . S2CID 30893882 .  
  45. ↑ Zhang Y, Werling U, Edelmann W (апрель 2012 г.). «SLiCE: новый метод клонирования ДНК на основе экстракта бактериальных клеток» . Исследования нуклеиновых кислот . 40 (8): e55. DOI : 10.1093 / NAR / gkr1288 . PMC 3333860 . PMID 22241772 .  
  46. ^ «Как Гибсон Assembly® меняет синтетическую биологию» . Биолаборатории Новой Англии . Проверено 14 апреля 2020 .
  47. ^ Касини А, Макдональд JT, Де Йонге Дж, Христодолу G, Freemont П.С., Baldwin Г.С., Эллис Т (январь 2014). «Конструирование ДНК в одном горшке для синтетической биологии: модульная сборка, направленная на перекрытие, с линкерами (MODAL)» . Исследования нуклеиновых кислот . 42 (1): e7. DOI : 10.1093 / NAR / gkt915 . PMC 3874208 . PMID 24153110 .  
  48. ^ а б в г Сторч М., Казини А, Макроу Б., Флеминг Т., Трюитт Х., Эллис Т., Болдуин Г.С. (июль 2015 г.). «BASIC: новый стандарт сборки биодеталей для идемпотентного клонирования, обеспечивающий точную сборку одноуровневой ДНК для синтетической биологии» . Синтетическая биология ACS . 4 (7): 781–7. DOI : 10.1021 / sb500356d . PMID 25746445 . 
  49. ^ "Протокол сборки Гибсона" . Addgene . Проверено 14 апреля 2020 .
  50. ^ El Каруи M, Ойос-Flight M, L Fletcher (2019). «Будущие тенденции в синтетической биологии-отчет» . Границы биоинженерии и биотехнологии . 7 : 175. DOI : 10.3389 / fbioe.2019.00175 . PMC 6692427 . PMID 31448268 .  
  51. ^ Kosuri S, церковь GM (май 2014). «Крупномасштабный синтез ДНК de novo: технологии и приложения» (PDF) . Природные методы . 11 (5): 499–507. DOI : 10.1038 / nmeth.2918 . PMC 7098426 . PMID 24781323 .   
  52. ^ Лартиг С., Гласс Дж. И., Альперович Н., Пайпер Р., Пармар П. П., Хатчисон Калифорния и др. (Август 2007 г.). «Трансплантация генома бактерий: смена одного вида на другой». Наука . 317 (5838): 632–8. Bibcode : 2007Sci ... 317..632L . CiteSeerX 10.1.1.395.4374 . DOI : 10.1126 / science.1144622 . PMID 17600181 . S2CID 83956478 .   
  53. ↑ Pilkington E (06.10.2009). «Я создаю искусственную жизнь, - заявляет генный пионер США» . Лондон: Гардиан. Архивировано 28 мая 2010 года . Проверено 22 мая 2010 .
  54. ^ Пенниси, Е. (2010-05-21). «Синтетический геном приносит новую жизнь бактериям» (PDF) . Наука . 328 (5981): 958–9. DOI : 10.1126 / science.328.5981.958 . PMID 20488994 . Архивировано (PDF) из оригинала 25 мая 2010 года . Проверено 21 мая 2010 .  
  55. ^ «Как ученые создали« искусственную жизнь » » . BBC News . 2010-05-20. Архивировано 1 июня 2013 года . Проверено 21 мая 2010 .
  56. ^ «Дрожжи 2.0» . Сборник сообщений природы . Springer Nature Limited . Проверено 17 апреля 2020 .
  57. ^ Shukman D (27 марта 2014). «Ученые приветствуют развитие синтетических хромосом» . BBC News . Проверено 28 марта 2014 .
  58. ^ Annaluru N, Muller H, Mitchell LA, Ramalingam S, Stracquadanio G, Richardson SM и др. (Апрель 2014 г.). «Полный синтез функционального конструктора эукариотической хромосомы» . Наука . 344 (6179): 55–8. Bibcode : 2014Sci ... 344 ... 55A . DOI : 10.1126 / science.1249252 . PMC 4033833 . PMID 24674868 .  
  59. ^ Специальный выпуск SYNTHETIC YEAST GENOME Science 10 марта 2017 Том 355, выпуск 6329