Саузерн-блот

Поднос со стопкой, состоящей сверху вниз из груза, бумажных полотенец, мембраны из нитроцеллюлозы или нейлона , геля, раствора соли и пластины из стекла.

Мембрана саузерн-блоттинга после гибридизации и промывки.

Саузерн-блот-агарозный гель при ультрафиолетовом освещении.

Саузерн-блот- авторадиограмма .

Саузерн - блот является методом , используемым в молекулярной биологии для выявления конкретной последовательности ДНК в образцах ДНК. Саузерн-блоттинг сочетает перенос разделенных электрофорезом фрагментов ДНК на фильтрующую мембрану и последующее обнаружение фрагментов гибридизацией зонда .

Метод назван в честь британского биолога Эдвина Саузерна , который впервые опубликовал его в 1975 году. ^[1] Другие методы блоттинга (например, вестерн-блоттинг , ^[2] нозерн-блоттинг , восточный блоттинг , юго-западный блоттинг ), которые используют аналогичные принципы, но используют РНК. или белок, позже были названы в связи с именем Эдвина Саузерна. Поскольку этикетка одноименная , Southern пишется с заглавной буквы, как это принято в именах собственные . Названия других методов блоттинга могут соответствовать этому соглашению по аналогии. ^[3]

Метод [ править ]

Ограничение эндонуклеазы используются для резки нити ДНК с высокой молекулярной массой на более мелкие фрагменты.
Затем фрагменты ДНК подвергают электрофорезу в агарозном геле для разделения их по размеру.
Если некоторые из фрагментов ДНК имеют размер более 15 т.п.н. , то перед блоттингом гель можно обработать кислотой, например разбавленной HCl . Это депуринирует фрагменты ДНК, разбивая ДНК на более мелкие части, тем самым обеспечивая более эффективный перенос из геля на мембрану.
Если используются методы щелочного переноса, гель ДНК помещают в щелочной раствор (обычно содержащий гидроксид натрия ) для денатурирования двухцепочечной ДНК. Денатурация в щелочной среде может улучшить связывание отрицательно заряженных остатков тимина ДНК с положительно заряженными аминогруппами мембраны, разделяя ее на отдельные цепи ДНК для последующей гибридизации с зондом (см. Ниже), и разрушает любую остаточную РНК, которая может все еще присутствовать в ДНК. Однако выбор щелочного метода переноса вместо нейтрального часто является эмпирическим и может привести к эквивалентным результатам. ^{[ необходима цитата ]}
Лист нитроцеллюлозной (или, альтернативно, нейлоновой ) мембраны помещается поверх (или ниже, в зависимости от направления переноса) геля. Давление прилагается к гелю равномерно (либо с помощью всасывания, либо путем размещения стопки бумажных полотенец и груза поверх мембраны и геля), чтобы обеспечить хороший и равномерный контакт между гелем и мембраной. При переносе всасыванием используется 20- кратный буфер SSC для обеспечения герметичности и предотвращения высыхания геля. Перенос буфера за счет капиллярного действия из области с высоким водным потенциалом в область с низким водным потенциалом (обычно фильтровальная бумага и бумажные салфетки) затем используется для перемещения ДНК из геля на мембрану; ионный обмен взаимодействия связывают ДНК с мембраной из-за отрицательного заряда ДНК и положительного заряда мембраны.
Затем мембрану запекают в вакууме или обычной печи при 80 ° C в течение 2 часов (стандартные условия; нитроцеллюлозная или нейлоновая мембрана) или подвергают воздействию ультрафиолетового излучения (нейлоновая мембрана) для постоянного прикрепления перенесенной ДНК к мембране.
Затем мембрану подвергают воздействию зонда для гибридизации - отдельного фрагмента ДНК с определенной последовательностью, присутствие которой в целевой ДНК необходимо определить. ДНК зонда помечена так, чтобы ее можно было обнаружить, обычно путем включения радиоактивности или метки молекулы флуоресцентным или хромогенным красителем . В некоторых случаях гибридизационный зонд может быть сделан из РНК, а не из ДНК. Чтобы гарантировать специфичность связывания зонда с образцом ДНК, в большинстве распространенных методов гибридизации используется ДНК спермы лосося или сельди для блокирования поверхности мембраны и целевой ДНК, деионизированный формамид и детергенты, такие как SDS, для уменьшения неспецифического связывания зонд.
После гибридизации избыток зонда смывается с мембраны (обычно с использованием буфера SSC ), и картина гибридизации визуализируется на рентгеновской пленке с помощью авторадиографии в случае радиоактивного или флуоресцентного зонда или по появлению цвета на мембране, если используется хромогенный метод обнаружения.

Результат [ править ]

Гибридизация зонда с конкретным фрагментом ДНК на мембране фильтра указывает на то, что этот фрагмент содержит последовательность ДНК, комплементарную зонду. Этап переноса ДНК из геля для электрофореза на мембрану позволяет легко связывать меченый гибридизационный зонд с фракционированной по размеру ДНК. Это также позволяет фиксировать гибриды мишень-зонд, необходимые для анализа с помощью авторадиографии или других методов обнаружения. Саузерн-блоттинг, выполняемый с использованием расщепленной рестрикционным ферментом геномной ДНК, может использоваться для определения количества последовательностей (например, копий гена) в геноме.. Зонд, который гибридизуется только с одним сегментом ДНК, который не был разрезан рестрикционным ферментом, будет давать одну полосу на Саузерн-блоттинге, тогда как несколько полос, вероятно, будут наблюдаться, когда зонд гибридизуется с несколькими очень похожими последовательностями (например, теми, которые может быть результатом дублирования последовательности). Модификация условий гибридизации (например, увеличение температуры гибридизации или уменьшение концентрации соли) может использоваться для увеличения специфичности и уменьшения гибридизации зонда с последовательностями, которые менее чем на 100% похожи.

Приложения [ править ]

Перенос саузерн-блоттинга может быть использован для клонирования на основе гомологии на основе аминокислотной последовательности белкового продукта целевого гена. Олигонуклеотиды сконструированы так, чтобы они были похожи на последовательность-мишень. Олигонуклеотиды химически синтезируются, помечаются радиоактивной меткой и используются для скрининга библиотеки ДНК или других коллекций клонированных фрагментов ДНК. Последовательности, которые гибридизуются с гибридизационным зондом, дополнительно анализируются, например, для получения полной последовательности целевого гена.

Саузерн-блоттинг также можно использовать для идентификации метилированных сайтов в определенных генах. Особенно полезными являются рестрикционные нуклеазы MspI и HpaII , обе из которых распознают и расщепляют одну и ту же последовательность. Однако HpaII требует, чтобы C в этом сайте был метилирован, тогда как MspI расщепляет только неметилированную ДНК в этом сайте. Следовательно, любые метилированные сайты в последовательности, анализируемой с помощью конкретного зонда, будут расщепляться первым, но не вторым ферментом. ^[4]

См. Также [ править ]

Гель-электрофорез нуклеиновых кислот
Фрагмент ограничения
Генетический отпечаток пальца
Нозерн-блот
Вестерн-блоттинг
Восточная клякса
Юго-западное пятно
Северо-западное пятно

Ссылки [ править ]

^ Южный, Эдвин Меллор (5 ноября 1975 г.). «Выявление специфических последовательностей среди фрагментов ДНК, разделенных гель-электрофорезом». Журнал молекулярной биологии . 98 (3): 503–517. DOI : 10.1016 / S0022-2836 (75) 80083-0 . ISSN 0022-2836 . PMID 1195397 .
^ Towbin; Стэхелин, Т; Гордон, Дж; и другие. (1979). «Электрофоретический перенос белков из полиакриламидных гелей на нитроцеллюлозные листы: методика и некоторые применения» . PNAS . 76 (9): 4350–4. DOI : 10.1073 / pnas.76.9.4350 . PMC 411572 . PMID 388439 .
^ Бернетт, В. Нил (апрель 1981). «Вестерн-блоттинг: электрофоретический перенос белков из гелей додецилсульфат-полиакриламид натрия на немодифицированную нитроцеллюлозу и радиографическое обнаружение с использованием антител и радиоактивного йода белка А». Аналитическая биохимия . 112 (2): 195–203. DOI : 10.1016 / 0003-2697 (81) 90281-5 . ISSN 0003-2697 . PMID 6266278 .
^ Биохимия 3-е издание, Мэтьюз, Ван Холд и др., Addison Wesley Publishing, pg 977

Внешние ссылки [ править ]

Ресурсы в вашей библиотеке
Ресурсы в других библиотеках

OpenWetWare

[1] Южный, Эдвин Меллор (5 ноября 1975 г.). «Выявление специфических последовательностей среди фрагментов ДНК, разделенных гель-электрофорезом». Журнал молекулярной биологии . 98 (3): 503–517. DOI : 10.1016 / S0022-2836 (75) 80083-0 . ISSN 0022-2836 . PMID 1195397 .

[2] Towbin; Стэхелин, Т; Гордон, Дж; и другие. (1979). «Электрофоретический перенос белков из полиакриламидных гелей на нитроцеллюлозные листы: методика и некоторые применения» . PNAS . 76 (9): 4350–4. DOI : 10.1073 / pnas.76.9.4350 . PMC 411572 . PMID 388439 .

[3] Бернетт, В. Нил (апрель 1981). «Вестерн-блоттинг: электрофоретический перенос белков из гелей додецилсульфат-полиакриламид натрия на немодифицированную нитроцеллюлозу и радиографическое обнаружение с использованием антител и радиоактивного йода белка А». Аналитическая биохимия . 112 (2): 195–203. DOI : 10.1016 / 0003-2697 (81) 90281-5 . ISSN 0003-2697 . PMID 6266278 .

[4] Биохимия 3-е издание, Мэтьюз, Ван Холд и др., Addison Wesley Publishing, pg 977

[1]