Нозерн - блот , или РНК - блот, [1] это метод , используемый в молекулярной биологии исследований для изучения экспрессии генов путем детекции РНК (или изолированных мРНК ) в образце. [2] [3]
С помощью нозерн-блоттинга можно наблюдать клеточный контроль над структурой и функцией путем определения скорости экспрессии конкретных генов во время дифференцировки и морфогенеза , а также в аномальных или болезненных условиях. [4] Нозерн-блоттинг включает использование электрофореза для разделения образцов РНК по размеру и обнаружение гибридизационным зондом, комплементарным части или всей целевой последовательности. Термин «нозерн-блот» на самом деле относится конкретно к капиллярному переносу РНК из геля для электрофореза на мембрану для блоттинга. Однако весь процесс обычно называют Нозерн-блоттингом. [5] Метод Нозерн-блоттинга был разработан в 1977 году Джеймсом Олвином,Дэвид Кемп и Джордж Старк в Стэнфордском университете , [6] с вкладами от Gerhard Heinrich. Нозерн-блоттинг получил свое название от сходства с первым методом блоттинга - саузерн-блоттингом , названным в честь биолога Эдвина Саузерна . [2] Основное различие состоит в том, что в Нозерн-блоте анализируется скорее РНК, чем ДНК . [7]
Процедура
Общая процедура блоттинга [5] начинается с извлечения общей РНК из гомогенизированного образца ткани или из клеток. Затем эукариотическая мРНК может быть выделена с помощью хроматографии на олиго (dT) целлюлозе для выделения только тех РНК с поли (A) хвостом . [8] [9] Затем образцы РНК разделяют гель-электрофорезом. Поскольку гели хрупкие и зонды не могут проникнуть в матрицу, образцы РНК, теперь разделенные по размеру, переносятся на нейлоновую мембрану через капиллярную или вакуумную систему блоттинга.
Нейлоновая мембрана с положительным зарядом является наиболее эффективной для использования в Нозерн-блоттинге, поскольку отрицательно заряженные нуклеиновые кислоты обладают высоким сродством к ним. Буфер для переноса, используемый для блоттинга, обычно содержит формамид, поскольку он снижает температуру отжига при взаимодействии зонд-РНК, тем самым устраняя необходимость в высоких температурах, которые могут вызвать деградацию РНК. [10] После того, как РНК была перенесена на мембрану, она иммобилизуется посредством ковалентной связи с мембраной под действием УФ-света или тепла. После того, как зонд был помечен, он гибридизируется с РНК на мембране. Экспериментальные условия, которые могут влиять на эффективность и специфичность гибридизации, включают ионную силу, вязкость, длину дуплекса, несовпадающие пары оснований и состав оснований. [11] Мембрана промывается, чтобы гарантировать специфическое связывание зонда и предотвратить возникновение фоновых сигналов. Затем гибридные сигналы обнаруживаются с помощью рентгеновской пленки и могут быть количественно определены денситометрией . Для создания контролей для сравнения в Нозерн-блоте можно использовать образцы, не отображающие интересующий генный продукт, после определения с помощью микрочипов или ОТ-ПЦР . [11]
Гели
Образцы РНК чаще всего разделяют на агарозных гелях, содержащих формальдегид в качестве денатурирующего агента для РНК, ограничивающего вторичную структуру. [11] [12] Гели можно окрашивать бромистым этидием (EtBr) и рассматривать в ультрафиолетовом свете для определения качества и количества РНК перед блоттингом. [11] Электрофорез в полиакриламидном геле с мочевиной также можно использовать для разделения РНК, но чаще всего он используется для фрагментированных РНК или микроРНК. [13] РНК-лестницу часто проводят рядом с образцами на геле для электрофореза, чтобы наблюдать размер полученных фрагментов, но в образцах общей РНК субъединицы рибосом могут действовать как маркеры размера. [11] Поскольку большая рибосомная субъединица - это 28S (приблизительно 5kb), а малая рибосомная субъединица - это 18S (приблизительно 2kb), на геле появляются две заметные полосы, большая, почти в два раза интенсивнее меньшей. [11] [14]
Зонды
Зонды для нозерн-блоттинга состоят из нуклеиновых кислот с последовательностью, комплементарной для всей или части интересующей РНК, они могут быть ДНК, РНК или олигонуклеотидами с минимум 25 основаниями, комплементарными целевой последовательности. [5] РНК-зонды (рибозонды), которые транскрибируются in vitro, способны выдерживать более строгие этапы промывки, предотвращая некоторый фоновый шум. [11] Обычно кДНК создают с помощью меченых праймеров для интересующей последовательности РНК, чтобы действовать как зонд в Нозерн-блоте. [15] Зонды должны быть помечены либо радиоактивными изотопами ( 32 P), либо хемилюминесценцией, при которой щелочная фосфатаза или пероксидаза хрена (HRP) разрушают хемилюминесцентные субстраты, производя обнаруживаемое излучение света. [16] Хемилюминесцентное мечение может происходить двумя способами: либо зонд присоединяется к ферменту, либо зонд метят лигандом (например, биотином ), лиганд (например, авидин или стрептавидин ) присоединен к ферменту ( например, HRP). [11] Рентгеновская пленка может обнаруживать как радиоактивные, так и хемилюминесцентные сигналы, и многие исследователи предпочитают хемилюминесцентные сигналы, потому что они быстрее, более чувствительны и уменьшают опасность для здоровья, связанную с радиоактивными метками. [16] Одну и ту же мембрану можно исследовать до пяти раз без значительной потери целевой РНК. [10]
Приложения
Нозерн-блоттинг позволяет наблюдать характер экспрессии определенного гена между тканями, органами, стадиями развития, уровнями экологического стресса, инфекцией патогенов и в ходе лечения. [9] [15] [17] Этот метод использовался, чтобы показать сверхэкспрессию онкогенов и подавление генов-супрессоров опухолей в раковых клетках по сравнению с «нормальной» тканью, [11] а также экспрессию генов в отторжении пересаженные органы. [18] Если повышенная регуляция гена наблюдается по обилию мРНК на Нозерн-блоте, образец можно затем секвенировать, чтобы определить, известен ли ген исследователям или это новое открытие. [18] Паттерны экспрессии, полученные в данных условиях, могут дать представление о функции этого гена. Поскольку РНК сначала разделяется по размеру, если используется только один тип зонда, разница в уровне каждой полосы на мембране может дать представление о размере продукта, предлагая альтернативные продукты сплайсинга того же гена или повторяющиеся мотивы последовательностей. [8] [14] Разница в размере продукта гена также может указывать на делеции или ошибки в обработке транскриптов. Изменяя зонд-мишень, используемый вдоль известной последовательности, можно определить, какая область РНК отсутствует. [2]
Преимущества и недостатки
Анализ экспрессии генов можно проводить несколькими различными методами, включая ОТ-ПЦР, анализы защиты от РНКаз, микроматрицы, RNA-Seq , серийный анализ экспрессии генов (SAGE), а также нозерн-блоттинг. [4] [5] Микроматрицы используются довольно часто и обычно согласуются с данными, полученными с помощью Нозерн-блотов; однако иногда нозерн-блоттинг может обнаружить небольшие изменения в экспрессии генов, которые не могут быть обнаружены с помощью микрочипов. [19] Преимущество микроматриц перед нозерн-блоттингом заключается в том, что одновременно можно визуализировать тысячи генов, в то время как нозерн-блоттинг обычно рассматривает один или небольшое количество генов. [17] [19]
Проблема в северном блоттинга часто образец деградация с помощью РНКазов (как эндогенная к образцу и через загрязнение окружающей среды), в котором можно избежать пути надлежащей стерилизации стеклянной посуды и применением ингибиторов РНКазов , такие как DEPC ( диэтилпирокарбонат ). [5] Химические вещества, используемые в большинстве северных пятен, могут представлять опасность для исследователя, поскольку формальдегид, радиоактивный материал, бромид этидия, DEPC и УФ-свет вредны при определенных воздействиях. [11] По сравнению с ОТ-ПЦР, Нозерн-блоттинг имеет низкую чувствительность, но он также имеет высокую специфичность, что важно для уменьшения количества ложноположительных результатов. [11]
Преимущества использования Нозерн-блоттинга включают определение размера РНК, наблюдение за альтернативными продуктами сплайсинга, использование зондов с частичной гомологией, качество и количество РНК можно измерить на геле до блоттинга, а мембраны можно хранить. и осуждался годами после промокания. [11]
Для Нозерн-блоттинга для обнаружения мРНК ацетилхолинэстеразы нерадиоактивный метод сравнивали с радиоактивным, и было обнаружено, что он такой же чувствительный, как и радиоактивный, но не требует защиты от излучения и занимает меньше времени. [20]
Обратное северное пятно
Иногда исследователи используют вариант процедуры, известный как обратный нозерн-блот. В этой процедуре нуклеиновая кислота субстрата (которая прикреплена к мембране) представляет собой набор изолированных фрагментов ДНК, а зонд представляет собой РНК, извлеченную из ткани и радиоактивно помеченную. Использование ДНК-микрочипов, которые получили широкое распространение в конце 1990-х - начале 2000-х годов, больше похоже на обратную процедуру, поскольку они включают использование изолированных фрагментов ДНК, прикрепленных к субстрату, и гибридизацию с зондом, изготовленным из клеточной РНК. . Таким образом, обратная процедура, хотя изначально необычная, позволила северному анализу развиться в профилирование экспрессии генов , при котором можно отслеживать экспрессию многих (возможно, всех) генов в организме.
Смотрите также
- Вестерн-блоттинг
- Восточная клякса
- Северо-западное пятно
- Дальневосточная клякса
- Дальневосточный блот
- Дифференциальный дисплей
Рекомендации
- ^ Гилберт, SF (2000) Биология развития, 6-е изд. Сандерленд, Массачусетс, Sinauer Associates.
- ^ a b c Альбертс, Б., Джонсон, А., Льюис, Дж. Рафф, М., Робертс, К., Уолтер, П. 2008. Молекулярная биология клетки, 5-е изд. Garland Science, Taylor & Francis Group, NY, стр. 538–539.
- ^ Kevil, CG, Уолш Л., Laroux, FS, Kalogeris Т., Гришэм, MB, Александр, JS (1997) Усовершенствованный, Rapid Северный протокол. Биохим. и Biophys. Research Comm. 238: 277–279.
- ^ a b Schlamp, K .; Weinmann, A .; Крупп, М .; Maass, T .; Галле, PR; Тойфель, А. (2008). «BlotBase: база данных Нозерн-блотов». Джин . 427 (1-2): 47-50. DOI : 10.1016 / j.gene.2008.08.026 . PMID 18838116 .
- ^ a b c d e Трейхурн, П. (1996) Нозерн-блоттинг. Pro. Nutrition Soc. 55: 583–589.
- ^ Алвин Дж. К., Кемп Диджей, Старк Г. Р. (1977). «Метод обнаружения специфических РНК в агарозных гелях путем переноса на диазобензилоксиметилбумагу и гибридизации с ДНК-зондами» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 74 (12): 5350–4. DOI : 10.1073 / pnas.74.12.5350 . PMC 431715 . PMID 414220 .
- ^ Бор, YC; Swartz, J .; Li, Y .; Coyle, J .; Рекош, Д .; Хаммаршельд, Мария-Луиза (2006). «Нозерн-блоттинг мРНК из полирибосом млекопитающих». Протоколы природы . DOI : 10.1038 / nprot.2006.216 .
- ^ а б Дюран, GM; Зукин, RS (1993). «Регуляция развития мРНК, кодирующих рецепторы Kainate / AMPA мозга крысы: исследование северного анализа». J. Neurochem . 61 (6): 2239–2246. DOI : 10.1111 / j.1471-4159.1993.tb07465.x . PMID 8245974 .
- ^ а б Mori, H .; Takeda-Yoshikawa, Y .; Хара-Нисимура, I .; Нисимура, М. (1991). «Клонирование малатсинтазы тыквы и секвенирование кДНК и Нозерн-блоттинг». Евро. J. Biochem . 197 (2): 331–336. DOI : 10.1111 / j.1432-1033.1991.tb15915.x . PMID 1709098 .
- ^ а б Ян, H .; McLeese, J .; Weisbart, M .; Dionne, J.-L .; Lemaire, I .; Обен, РА (1993). «Упрощенный протокол высокой пропускной способности для северной гибридизации» . Исследования нуклеиновых кислот . 21 (14): 3337–3338. DOI : 10.1093 / NAR / 21.14.3337 . PMC 309787 . PMID 8341618 .
- ^ Б с д е е г ч я J K L Streit, S .; Михальский, CW; Эркан, М .; Kleef, J .; Фрисс, Х. (2009). «Нозерн-блоттинг для обнаружения РНК в клетках и тканях рака поджелудочной железы». Протоколы природы . 4 (1): 37–43. DOI : 10.1038 / nprot.2008.216 . PMID 19131955 .
- ^ Yamanaka, S .; Поксай, КС; Арнольд, KS; Innerarity, TL (1997). «Новая мРНК репрессора трансляции широко редактируется в печени, содержащей опухоли, вызванные экспрессией трансгена фермента редактирования мРНК апоВ» . Genes Dev . 11 (3): 321–333. DOI : 10,1101 / gad.11.3.321 . PMID 9030685 .
- ^ Valoczi, A., Hornyik, C., Varga, N., Burgyan, J., Kauppinen, S., Havelda, Z. (2004) Чувствительное и специфическое обнаружение микроРНК методом нозерн-блоттинга с использованием LNA-модифицированных олигонуклеотидных зондов. Nuc. Исследования кислот. 32: e175.
- ^ а б Гортнер, Г .; Pfenninger, M .; Kahl, G .; Вайзинг, К. (1996). «Нозерн-блоттинг простой повторяющейся транскрипции последовательности в растениях». Электрофорез . 17 (7): 1183–1189. DOI : 10.1002 / elps.1150170702 . PMID 8855401 .
- ^ a b Liang, P. Pardee, AB (1995) Последние достижения в области дифференциального отображения. Current Opinion Immunol. 7: 274–280.
- ^ а б Engler-Blum, G .; Meier, M .; Франк, Дж .; Мюллер, Джорджия (1993). «Уменьшение фоновых проблем при нерадиоактивном Нозерн-блоттинге и Саузерн-блоттинге обеспечивает более высокую чувствительность, чем гибридизации на основе 32P». Анальный. Биохим . 210 (2): 235–244. DOI : 10.1006 / abio.1993.1189 . PMID 7685563 .
- ^ a b Болдуин, Д., Крейн, В., Райс, Д. (1999) Сравнение гелевых, нейлоновых фильтров и методов микроматрицы для обнаружения дифференциальной экспрессии РНК в растениях. Current Opinion in Plant Biol. 2: 96–103.
- ^ а б Utans, U .; Liang, P .; Wyner, LR; Карновский, MJ; Рассел, Мэн (1994). «Хроническое сердечное отторжение: идентификация пяти активированных генов в трансплантированных сердцах с помощью дифференциального отображения мРНК» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 91 (14): 6463–6467. DOI : 10.1073 / pnas.91.14.6463 . PMC 44222 . PMID 8022806 .
- ^ а б Taniguchi, M .; Миура, К .; Iwao, H .; Яманака, С. (2001). «Количественная оценка микрочипов ДНК - сравнение с нозерн-блоттингом». Геномика . 71 (1): 34–39. DOI : 10.1006 / geno.2000.6427 . PMID 11161795 .
- ^ Крефт, К., Крефт, С., Комел, Р., Grubič, Z. (2000). Нерадиоактивный нозерн-блоттинг для определения мРНК ацетилхолинэстеразы. Арка Пфлюгера - Eur J Physiol, 439: R66-R67
Внешние ссылки
- OpenWetWare